丹參酮B調(diào)控LRP6/Wnt1/β-catenin通路對(duì)血管性癡呆性小鼠認(rèn)知功能的影響

葉明燈，汪晶瑩，周 源，程玉潔，陳 明，俞 斐

[1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第二醫(yī)院)藥學(xué)部，江蘇 南京 210003；2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032]

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指由多種腦血管疾病引起的腦部功能障礙,進(jìn)而產(chǎn)生獲得性智能損傷的綜合征[1]。研究證實(shí),VD作為老年癡呆的第二大形式，大約占癡呆性疾病總發(fā)生例數(shù)的20%～30%[2-3]。伴隨人口老齡化的加劇，我國(guó)VD癡呆已經(jīng)逐漸成為老年性癡呆的最主要類(lèi)型[4]。研究表明,導(dǎo)致VD的主要因素為腦血管病變，如小血管病變、大動(dòng)脈病變等。腦血管病變會(huì)進(jìn)一步引起控制學(xué)習(xí)、記憶功能的海馬神經(jīng)元缺血，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和細(xì)胞凋亡，并最終引起癡呆[5-6]。但是,目前臨床上有關(guān)VD的治療十分有限，而中醫(yī)藥以獨(dú)特的診療理論與方法可以通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)的方式在防治VD中發(fā)揮巨大潛力。丹參酮B(tanshinone B，TSB)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參的脂溶性成分代表物質(zhì)之一，其具有廣泛的藥理學(xué)活性，包括改善微血管循環(huán)、清除氧自由基、抗癌以及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等，已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[7]。既往研究表明TSB在中風(fēng)性大鼠、VD性小鼠中能夠改善認(rèn)知功能障礙，發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)作用[8-9]。在VD小鼠中丹參酮ⅡA能夠通過(guò)抑制大腦皮質(zhì)氧化應(yīng)激，調(diào)控興奮性氨基酸和抑制性氨基酸含量，從而改善認(rèn)知功能障礙。但是目前有關(guān)TSB對(duì)VD小鼠認(rèn)知功能障礙的分子機(jī)制尚不完全清楚。因此，本研究將通過(guò)雙側(cè)頸總動(dòng)脈縮窄法構(gòu)建VD小鼠模型，闡明LRP6/Wnt1/β-catenin信號(hào)通路在VD中的作用及TSB的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(20～22)g，周齡6～8周，動(dòng)物由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(皖)2017-001，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑丹參酮B(西安冠宇生物技術(shù)有限公司，純度≥98，批號(hào)：112246-15-8)；鹽酸多奈哌齊(donepezil，DP)粉末(SELLECK公司，純度≥99，批號(hào)：120011-70-3)；蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin staining，HE)染色液(碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：C0105S)；MDA、SOD以及GSH-Px測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程共公司)；p-LRP6兔單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology，批號(hào)：5583)；LRP6兔單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology，批號(hào)：14220)；Wnt1小鼠單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology，批號(hào)：15071)；β-catenin小鼠單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology，批號(hào)：89477)；β-actin小鼠單克隆抗體(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：5174)；一抗、二抗稀釋液(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：P0023A-100ml)；山羊抗小鼠(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：A0286)；山羊抗兔(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：A0277)；極超敏ECL發(fā)光試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：P0018FS)。

1.3 儀器G22-W型高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)；SuPerMax 3000FA型多功能酶標(biāo)儀(Thermo賽默飛世爾)；M371450型組織渦旋儀(武漢維塞爾生物科技有限公司)；TC-XDS-500C型熒光倒置顯微鏡(日本/奧林巴斯Olympus)；Western blot檢測(cè)裝置(美國(guó)Bio-Rad伯樂(lè)公司)；GoodLook-1000型成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad伯樂(lè)公司)。

1.4 動(dòng)物分組與處理60只雄性C57BL/6小鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(Control組)、血管性癡呆模型組(VD組)、丹參酮B低劑量組(TSB 2 mg·kg-1)、丹參酮B中劑量組(TSB 4 mg·kg-1)、丹參酮B高劑量組(TSB 8 mg·kg-1)以及陽(yáng)性藥物組(鹽酸多奈哌齊1 mg·kg-1)，每組各10只。采用小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈縮窄法構(gòu)建VD模型[10]待造模成功10 d后，其中丹參酮低、中、高劑量組腹腔注射丹參酮B，陽(yáng)性藥物組腹腔注射鹽酸多奈哌齊，每日1次，Control組以及VD組小鼠腹腔注射等量生理鹽水，共計(jì)20 d。

1.5 Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)各組雄性C57BL/6小鼠于給藥處理20 d后，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的空間記憶能力。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：各組小鼠在第一象限入點(diǎn)處面向放入水中，實(shí)驗(yàn)記錄在120 s內(nèi)各組小鼠成功尋找并爬上平臺(tái)的時(shí)間長(zhǎng)短，即為逃避潛伏期，之后分別從其他3個(gè)象限入口處放入水中，持續(xù)訓(xùn)練5 d；(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)的d 6時(shí)，撤去平臺(tái)，并將小鼠在第一象限入點(diǎn)處面向放入水中，記錄小鼠60 s內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡，計(jì)算各組小鼠通過(guò)目標(biāo)象限的次數(shù)以及小鼠在原平臺(tái)游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間的比值大小。

1.6 MDA含量、SOD、GSH-Px活性測(cè)定將各組小鼠斷頭處理后快速去除全腦組織，在冰上分離大腦皮層以及海馬組織，組織碾磨，BCA測(cè)定蛋白濃度并定量，按照各自試劑盒說(shuō)明操作。

1.7 HE染色觀察海馬組織病理學(xué)形態(tài)各組小鼠乙醚麻醉后，迅速采用斷頭取腦，摘取視交叉至漏斗柄的腦片，采用4%的多聚甲醛固定各組小鼠海馬組織，脫水、透明、包埋、石蠟切片，并按照HE染色試劑盒進(jìn)行海馬組織染色，顯微鏡下觀察各組小鼠海馬組織形態(tài)學(xué)變化。

1.8 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)海馬組織p-LRP6、Wnt1以及β-catenin蛋白表達(dá)取各組小鼠海馬組織，組織碾磨，裂解；BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；凝膠電泳；濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜；上樣；用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育對(duì)應(yīng)p-LRP6兔單克隆抗體(1 ∶1 000)，LRP6兔單克隆抗體(1 ∶1 000)，Wnt1小鼠單克隆抗體(1 ∶1 000)、β-catenin小鼠單克隆抗體(1 ∶1 000)以及β-actin小鼠單克隆抗體(1 ∶2 000)，4 ℃過(guò)夜，孵育對(duì)應(yīng)的山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗((1 ∶5 000)1～2 h，；搖床搖晃上加TPBS洗滌3次，5 min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。p-LRP6、LRP6、Wnt1和β-catenin蛋白表達(dá)表達(dá)水平以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值相比反映。

2 結(jié)果

2.1 TSB對(duì)VD小鼠行為學(xué)的影響Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)定位航行實(shí)驗(yàn)顯示，與Control組小鼠相比，VD組小鼠定位航行的潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01)。與VD組小鼠相比，TSB不同劑量組小鼠定位航行的潛伏期均不同程度性縮短(P<0.05或P<0.01)，表明TSB能夠明顯改善VD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能(Fig 1)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)探索實(shí)驗(yàn)顯示，與Control組小鼠相比，VD組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限(第四象限)停留時(shí)間百分比均明顯減少(P<0.01)。與VD組小鼠相比，TSB組小鼠不同劑量組穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限(第四象限)停留時(shí)間百分比均明顯增加(P<0.05或P<0.01)(Fig 2)。

2.2 TSB對(duì)VD小鼠皮層和海馬組織MDA含量、SOD以及GSH-Px活性影響與Control組相比，VD組小鼠大腦皮層和海馬組織MDA含量明顯增加(P<0.01)，GSH-Px和SOD活性均明顯降低(P<0.01)。與VD組小鼠相比，TSB組小鼠大腦皮層和海馬組織MDA含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)，GSH-Px和SOD活性均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，且呈劑量依賴(lài)性(Fig 3、Fig 4)。

Fig 1 Effect of TSB on escape latency of mice n=6)**P<0.01 vs control,#P<0.05,##P<0.01 vs VD.

Fig 2 Effect of TSB on latency of mouse water maze space exploration experiment n=6)**P<0.01 vs control,#P<0.05,##P<0.01 vs VD.

2.3 TSB對(duì)VD小鼠海馬區(qū)病理組織學(xué)的影響與Control組相比，VD組小鼠海馬齒狀回處顆粒狀細(xì)胞核明顯固縮，CA1以及CA3區(qū)域海馬神經(jīng)元數(shù)量均明顯減少，細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞大部分皺縮、部分神經(jīng)元細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)出現(xiàn)明顯聚集等。與VD組相比，TSB不同劑量組和DP組小鼠海馬齒狀回處、CA1以及CA3區(qū)病理性損傷明顯減輕(Fig 5～Fig 7)。

Fig 4 Comparison of MDA content,SOD and GSH-Px activity in hippocampus of mice in each group n=6)**P<0.01 vs control.#P<0.05,##P<0.01 vs VD.

2.4 TSB對(duì)VD小鼠LRP6/Wnt1/β-catenin通路的影響與Control組相比，VD組小鼠海馬組織p-LRP6、Wnt1以及β-catenin蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.01)。與VD組相比，TSB中劑量組小鼠海馬組織p-LRP6、Wnt1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，β-catenin蛋白表達(dá)無(wú)差異(P>0.05)，TSB高劑量組以及DP組小鼠海馬組織p-LRP6、Wnt1以及β-catenin蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.01)，TSB低劑量組小鼠海馬組織p-LRP6、Wnt1以及β-catenin蛋白表達(dá)均無(wú)差異(P>0.05)(Fig 8)。

Fig 5 Histopathological changes of hippocampal CA1 of mice in each group (HE,×200)

Fig 6 Histopathological changes of hippocampal CA3 of mice in each group (×200)

Fig 7 Histopathological changes in hippocampal dentate gyrus of mice in each group (HE,×200)

Fig 8 Effect of TSB on LRP6/Wnt1/β-catenin pathway related proteins in hippocampus of VD mice n=6)A:The bands of p-LRP6,LRP6,Wnt1,β-catenin protein.B:Quantification of p-LRP6,LRP6,Wnt1,β-catenin protein.**P<0.01 vs control,#P<0.05,##P<0.01 vs VD.

3 討論

VD是腦血管損傷導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙，主要表現(xiàn)為神經(jīng)活動(dòng)、語(yǔ)言、學(xué)習(xí)以及記憶能力的障礙。腦部血流長(zhǎng)期灌流不足會(huì)導(dǎo)致中樞膽堿功能障礙、神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷是學(xué)習(xí)和記憶能力下降的重要原因[10]。因此，本研究首先通過(guò)雙側(cè)頸總動(dòng)脈縮窄法構(gòu)建VD小鼠模型。Morris實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與Control組相比，VD組小鼠定位航行的潛伏期明顯延長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限(第四象限)停留時(shí)間百分比均顯著性減少；HE染色顯示VD組小鼠海馬齒狀回處顆粒狀細(xì)胞核明顯固縮，CA1以及CA3區(qū)域海馬神經(jīng)元數(shù)量均明顯減少，細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞大部分皺縮、部分神經(jīng)元細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)出現(xiàn)明顯聚集等。以上結(jié)果表明，雙側(cè)頸總動(dòng)脈縮窄法構(gòu)建VD小鼠模型構(gòu)建成功，可用于后續(xù)藥物療效實(shí)驗(yàn)。

目前臨床上有關(guān)VD患者的治療主要有藥物治療和特殊方式治療等。其中藥物包括神經(jīng)保護(hù)劑、腦組織代謝改善劑等，神經(jīng)遞質(zhì)的替代治療是特殊方式治療的關(guān)鍵[11]。但是由于費(fèi)用昂貴以及治療療效不佳使得患者依從性不高。因此，積極探尋有效的治療藥物對(duì)于改善VD患者的生活治療尤為關(guān)鍵。TSB是丹參酮ⅡA的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，具有和丹參酮ⅡA相似的藥理學(xué)活性。研究證實(shí)丹參酮ⅡA能夠通過(guò)抑制VD小鼠氧化應(yīng)激，降低腦組織炎癥反應(yīng)、抑制Caspase-3、促進(jìn)Bcl-2表達(dá)降低海馬神經(jīng)元凋亡等途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[12-13]。本研究通過(guò)VD小鼠腹腔注射不同劑量的TSB，觀察其治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSB能夠縮短定位航行的潛伏期、增加穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限(第四象限)停留時(shí)間百分比、減輕海馬齒狀回處、CA1以及CA3區(qū)病理性損傷。以上結(jié)果表明TSB對(duì)VD小鼠具有治療效果。那么有關(guān)TSB是如何發(fā)揮VD小鼠的神經(jīng)保護(hù)作呢？氧化應(yīng)激性損傷在神經(jīng)退行性病變中發(fā)揮重要作用。在腦部血流長(zhǎng)期灌流不足時(shí)會(huì)導(dǎo)致MDA含量升高、SOD以及GSH-Px活性降低。本研究結(jié)果顯示TSB能夠降低VD小鼠大腦皮層和海馬組織中MDA水平，增強(qiáng)SOD以及GSH-Px活性。Wnt信號(hào)通路在VD中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、氧化應(yīng)激、凋亡以及增殖等。Wnt信號(hào)通路可以概括為經(jīng)典信號(hào)通路、非經(jīng)典信號(hào)通路。其中Wnt經(jīng)典型號(hào)通路又被稱(chēng)為Wnt/β-catenin信號(hào)通路[14]。既往研究表明，在VD大鼠中，激活Wnt/β-catenin傳導(dǎo)能夠明顯改善大鼠海馬神經(jīng)損傷[15]。另外在帕金森病大鼠模型中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白Wnt1、β-catenin表達(dá)下調(diào)，GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達(dá)上調(diào)，抑制Wnt1能夠減輕MPP+誘導(dǎo)的PC12凋亡[16]。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(low-density lipoprotein receptor-related protein6，LRP6)屬于低密度脂蛋白受體超家族成員之一[17]。既往研究表明，電針治療能夠通過(guò)調(diào)節(jié)海馬組織LRP6影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路，減少細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)與VD組相比，TSB中、高劑量組小鼠海馬組織p-LRP6蛋白表達(dá)明顯升高。該研究結(jié)果表明TSB能夠通過(guò)調(diào)控p-LRP6，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路改善VD小鼠認(rèn)知功能障礙。

綜上所述，本研究通過(guò)研究丹參酮B對(duì)血管性癡呆小鼠認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用及其調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示TSB能夠改善VD小鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與激活海馬組織LRP6/Wnt1/β-catenin通路，進(jìn)而抑制小鼠大腦皮層和海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激有關(guān)。該研究結(jié)果將有助豐富VD的發(fā)生機(jī)制以及為其藥物靶點(diǎn)治療提供新的可能。