斑馬魚腫瘤模型研究進(jìn)展

李 璘，邱蓉麗，魏凱峰，孫東東,3

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 1.中醫(yī)學(xué)院、2.藥學(xué)院，3.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

斑馬魚作為一種體外受精的模式動(dòng)物，廣泛應(yīng)用于人類多種疾病的研究。由于斑馬魚腫瘤模型與人類腫瘤的高度保守性，許多人類腫瘤相關(guān)通路在斑馬魚腫瘤中存在同源物。早在2005年斑馬魚就用于腫瘤的研究[1]，近來(lái)轉(zhuǎn)基因斑馬魚和腫瘤移植斑馬魚的出現(xiàn)，使其成為具有發(fā)展?jié)摿Φ囊环N腫瘤動(dòng)物模型。

1 斑馬魚在腫瘤研究中的優(yōu)勢(shì)

斑馬魚屬于非哺乳類脊椎動(dòng)物，比無(wú)脊椎動(dòng)物線蟲和果蠅更加與人類相近，用于體內(nèi)腫瘤增殖、分裂、轉(zhuǎn)移及抗腫瘤藥物的快速篩選研究。斑馬魚先天免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)與人和小鼠高度保守，造血系統(tǒng)與人類相似且和人類的血細(xì)胞相對(duì)應(yīng)，適用于人類血液腫瘤的研究[2]。斑馬魚受精24 h后主要器官發(fā)育完成，受精7～14 d相當(dāng)于生命的早期階段，先天免疫系統(tǒng)受精后開始發(fā)育，約2～3周獲得性免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟，這個(gè)時(shí)間窗可以植入人或鼠的腫瘤細(xì)胞而不被斑馬魚的免疫系統(tǒng)排斥。斑馬魚產(chǎn)生天然色素前處于透明狀態(tài)，可以觀察腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和腫瘤大小[3]。斑馬魚每?jī)芍墚a(chǎn)卵約600～700枚，產(chǎn)生遺傳一致的后代，細(xì)胞培養(yǎng)板即可飼養(yǎng)。斑馬魚移植的腫瘤與小鼠腫瘤模型具有相似的藥物敏感性，腫瘤細(xì)胞移植于成體魚，短時(shí)間內(nèi)可獲得大量腫瘤移植模型[4]。轉(zhuǎn)基因斑馬魚和熒光標(biāo)記細(xì)胞的出現(xiàn)，擴(kuò)大了斑馬魚在腫瘤研究方面的應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因斑馬魚(Casper)終身保持透明，用于腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、腫瘤血管生成、腫瘤與微環(huán)境的相互作用、腫瘤募集免疫細(xì)胞能力等多方面的研究。

2 斑馬魚腫瘤模型

2.1 誘發(fā)性斑馬魚腫瘤模型誘發(fā)性斑馬魚腫瘤模型包括自然狀態(tài)下發(fā)生和致癌劑誘發(fā)的腫瘤模型。自然狀態(tài)下因斑馬魚體溫比較低(28.5 ℃)，自發(fā)性腫瘤細(xì)胞容易發(fā)生凋亡，腫瘤的自然發(fā)生率比較低，一般發(fā)生在1～2年的斑馬魚[3]。自然誘發(fā)的腫瘤主要與魚類病毒、寄生蟲及水污染物有關(guān)[5]。假毛細(xì)線蟲(Pseudocapillariatomentosa)感染斑馬魚產(chǎn)生腸道多病灶異常增生物，在感染附近組織形成腫瘤[6]。斑馬魚自發(fā)性腸腫瘤包括腸腺癌、小細(xì)胞腸癌，它們?cè)谀c道中隨機(jī)分布，常侵襲黏膜皮下組織[7]。斑馬魚的大腦在組織學(xué)上與哺乳類動(dòng)物明顯不同，大量前腦、間腦和延腦的嗜堿性胚胎細(xì)胞緊緊圍繞著腦室系統(tǒng)，腦室周圍的細(xì)胞容易發(fā)生胚胎性神經(jīng)瘤，這與兒科神經(jīng)瘤相似。犬、貓等哺乳動(dòng)物和成人腦部發(fā)生神經(jīng)膠質(zhì)瘤，但斑馬魚常發(fā)生分化度較低的成神經(jīng)細(xì)胞瘤。如果抑癌基因，如tp53、mlh1、msh2、msh6等發(fā)生變異，斑馬魚容易發(fā)生周圍神經(jīng)鞘瘤[6]。

與人類相似，許多致癌劑可以誘發(fā)斑馬魚發(fā)生腫瘤，且兩者具有組織學(xué)相似性。肝臟是斑馬魚最容易發(fā)生腫瘤的臟器，因?yàn)轸~類的肝臟一生中不停生長(zhǎng)，NDMA和DBP可以誘發(fā)肝腫瘤。用DEN飼養(yǎng)斑馬魚8周后，肝臟及胰腺發(fā)生腫瘤。DMBA和MNNG除可誘發(fā)消化系統(tǒng)的腫瘤外，還可誘發(fā)免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤[8]。用DMBA飼養(yǎng)感染假毛細(xì)線蟲的斑馬魚，腫瘤發(fā)病率比沒(méi)有感染的斑馬魚提高50%[8]。DABA導(dǎo)致斑馬魚發(fā)生混合性腫瘤(平滑肌和腺上皮惡性惡性腫瘤)，檢測(cè)斑馬的嵌合眼判斷EMS或ENU誘發(fā)囊胚期斑馬魚腫瘤發(fā)生情況[9]。致癌劑還可以誘發(fā)斑馬魚多處血管瘤，眼球脈絡(luò)膜和鰓處血管容易發(fā)生血管瘤，與這些部位豐富的小血管密度大有關(guān)[6]。

斑馬魚的誘發(fā)性腫瘤與人和哺乳類動(dòng)物具有很高的相似性，但它們解剖結(jié)構(gòu)上的差異導(dǎo)致其腫瘤類型存在一些不同的特點(diǎn)。斑馬魚的卵巢腫瘤大部分是上皮組織癌，腺癌很少，也極少發(fā)生脂肪肉瘤和脂肪瘤。血源性腫瘤除淋巴瘤外，斑馬魚很少患有其它血液腫瘤，氣囊罕見(jiàn)發(fā)生腫瘤[6]。斑馬魚腫瘤很少發(fā)生哺乳類動(dòng)物類似的自發(fā)性淋巴轉(zhuǎn)移和骨髓轉(zhuǎn)移[10]。

化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)的斑馬魚腫瘤模型操作非常方便，但因其發(fā)生率低、腫瘤發(fā)生的臟器不確定，具有一定的局限性。但這類腫瘤組織細(xì)胞的雜合性與人類腫瘤發(fā)生的過(guò)程高度相似，常用于因基因變異而誘發(fā)腫瘤的病因?qū)W研究。

2.2 轉(zhuǎn)基因斑馬魚腫瘤模型現(xiàn)代生物及轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以改變斑馬魚的遺傳背景，將腫瘤誘導(dǎo)基因?qū)氚唏R魚生殖細(xì)胞可以形成轉(zhuǎn)基因腫瘤模型。用rag2啟動(dòng)斑馬魚淋巴細(xì)胞基因c-myc表達(dá)，產(chǎn)生T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病模型，并從胸腺擴(kuò)散至骨和內(nèi)臟組織，hlk，srk和otg基因變異也產(chǎn)生T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病模型[11]。有學(xué)者用電轉(zhuǎn)基因方法，在BRAF/p53-/-/mitfa背景下，Cas9敲除抑癌基因Rb1造成高侵襲性黑色素瘤細(xì)胞，7周內(nèi)100%產(chǎn)生具有免疫相容的黑色素瘤斑馬魚模型[12]。建立這種轉(zhuǎn)基因模型需要大量時(shí)間，腫瘤發(fā)生位置隨機(jī)性大，大部分轉(zhuǎn)基因斑馬魚不能成活至性成熟期形成可遺傳性的腫瘤模型。

組織特異性啟動(dòng)子可以特異地控制組織的基因表達(dá)，誘發(fā)特定組織的斑馬魚腫瘤模型。黑色素細(xì)胞特異性啟動(dòng)子mitfa促進(jìn)BRAF高表達(dá)，絲氨酸/蘇氨酸激酶BRAF活性增加，激活MAPK通路產(chǎn)生黑色素瘤。在p53-/-突變背景下，BRAF激活組氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1促進(jìn)黑色素瘤增長(zhǎng)，形成黑色素瘤斑馬魚模型。阻斷SPRED1后，同時(shí)抑制pten和p53后促進(jìn)斑馬魚粘膜黑色素瘤的生成。BRAF/p53-/-/mitfa斑馬魚僅5%發(fā)生黑色素瘤，SETDB1阻斷15周后20%形成黑色素瘤[13]。改變?cè)S多組織特異性啟動(dòng)子造成斑馬魚腫瘤模型，啟動(dòng)子fabp10促進(jìn)KRAS或激活肝β-catenin，6個(gè)月后誘發(fā)斑馬魚產(chǎn)生肝癌，ptf1啟動(dòng)子促進(jìn)KRAS產(chǎn)生胰腺癌，KRAS或Mylz2基因的表達(dá)產(chǎn)生橫紋肌肉瘤斑馬魚模型[14-15]。nf1基因的缺失促進(jìn)轉(zhuǎn)基因斑馬魚MYCN誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的侵襲作用，dbh和sox可誘發(fā)腦部腫瘤[16-17]。特異性啟動(dòng)子誘發(fā)的斑馬魚腫瘤組織特異性強(qiáng)，但存在基因的脫靶現(xiàn)象，有時(shí)啟動(dòng)子的組織特異性不強(qiáng)，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生率不高。

與誘發(fā)性斑馬魚腫瘤模型比較，轉(zhuǎn)基因斑馬魚腫瘤模型可控性和發(fā)生率均增高，但其操作的復(fù)雜性也增加，需要大量的經(jīng)費(fèi)和時(shí)間。

2.3 植入性斑馬魚腫瘤模型植入性斑馬魚腫瘤模型是將標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞植入斑馬魚胚胎或成體魚不同位置，用于研究腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移及抗腫瘤藥物。斑馬魚受精后48 h內(nèi)是植入腫瘤細(xì)胞的最佳時(shí)期[18]，植入的位置包括卵黃囊、卵周間隙或居維葉氏管，也可以注入成體斑馬魚的腹腔內(nèi)。腫瘤細(xì)胞植入斑馬魚的位置不同，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)方式不同，研究目的也不相同。卵黃囊是有清晰界限無(wú)細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)，由膽固醇、甘油三酯和磷脂膽堿等脂類物質(zhì)組成，植入卵黃囊標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞非常容易觀察，用于研究腫瘤細(xì)胞的增殖、分裂和運(yùn)動(dòng)功能[19-20]。卵黃周隙沒(méi)有血管及淋巴管等結(jié)構(gòu)，在發(fā)育過(guò)程中靠近胸腹部的血管，腫瘤細(xì)胞植入卵黃周隙，利于研究在腫瘤細(xì)胞刺激下血管發(fā)生、血管轉(zhuǎn)移和腫瘤細(xì)胞增殖[21]。這種模型觀察窗口較短，只有5～6 d(植入后)，并且對(duì)幼體產(chǎn)生損傷。也可在2～3 dpf直接將腫瘤細(xì)胞(熒光標(biāo)記)注入居維氏管而導(dǎo)入血循環(huán)[22]。循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞在尾部造血組織附近生成腫瘤，適用于腫瘤細(xì)胞的血管侵襲轉(zhuǎn)移和EMT的研究。

斑馬魚胚胎免疫系統(tǒng)沒(méi)有發(fā)育成熟，利于外源腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，但因其體積小，僅能植入少量腫瘤細(xì)胞。成年斑馬魚可以植入大量腫瘤細(xì)胞，每尾魚可種植5×104個(gè)腫瘤細(xì)胞，甚至可達(dá)2×106個(gè)細(xì)胞。但成年斑馬魚對(duì)外源性腫瘤細(xì)胞具有免疫排斥反應(yīng)而不能生長(zhǎng)增殖，因此，成年斑馬魚腫瘤模型需要用免疫抑制劑或γ-射線抑制機(jī)體的免疫系統(tǒng)。大劑量地塞米松抑制斑馬魚免疫反應(yīng)，用高分辨共聚集顯微鏡可以觀察綠色熒光蛋白標(biāo)記的斑馬魚兩周內(nèi)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的情況[21]。γ-射線照射斑馬魚后免疫系統(tǒng)的恢復(fù)需要30 d，腫瘤細(xì)胞可以生長(zhǎng)增殖20 d[23]。也有學(xué)者先將腫瘤細(xì)胞用射線照射后植入斑馬魚幼魚，3個(gè)月后再植入沒(méi)有照射的同種腫瘤細(xì)胞，這些腫瘤細(xì)胞不被免疫系統(tǒng)抑制并表現(xiàn)為腫瘤轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)[24]。

用免疫抑制劑或γ-射線照射抑制斑馬魚免疫系統(tǒng)，增加了一個(gè)可變因素，還存在抑制劑與篩選藥物間可能的相互作用。為了避免高劑量地寒米松或低致死量γ射線所致的不利因素，可用免疫缺陷型斑馬魚建立植入性腫瘤模型。改變斑馬魚rag2基因，降低T、BK細(xì)胞數(shù)而抑制斑馬魚的免疫系統(tǒng)，可在不同位置植入腫瘤細(xì)胞[25]。采用prkdc-/-和il-2rga-/-基因突變?cè)斐擅庖呷毕莅唏R魚(T、B、NK細(xì)胞缺陷)，這種斑馬魚可以37 ℃水溫中飼養(yǎng)，移植腫瘤細(xì)胞株或患者腫瘤細(xì)胞可以生長(zhǎng)28 d，有效地避免了腫瘤細(xì)胞與斑馬魚生長(zhǎng)的溫度差異問(wèn)題[26]。

植入性斑馬魚腫瘤模型與誘發(fā)性及轉(zhuǎn)基因斑馬魚腫瘤模型比較具有更高的可控性，研究者可以將腫瘤細(xì)胞植入斑馬魚的不同位置實(shí)現(xiàn)自己的研究目的。但斑馬魚胚胎或成體斑馬魚的免疫系統(tǒng)處于不成熟或抑制狀態(tài)，對(duì)研究腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞間的相互作用有一定的影響。

3 結(jié)語(yǔ)

斑馬魚腫瘤模型制作方法簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)周期短，有較好的重現(xiàn)性，與人類基因高度相似，且具有體內(nèi)成像、遺傳易處理性和藥物效應(yīng)測(cè)試的順從性等特點(diǎn)，給學(xué)者提供了研究腫瘤機(jī)制的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。斑馬魚腫瘤模型已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但斑馬魚腫瘤模型也有其局限性。斑馬魚個(gè)體小，解剖及組織定位有一定的難度，原位腫瘤植入難度較大。斑馬魚可以產(chǎn)生大量遺傳一致的后代，但胚胎和幼體死亡率較高，后代的純合子雄性多于雌性。斑馬魚可以用來(lái)研究胃癌、肺癌、乳腺癌及前列腺癌，但因其沒(méi)有相應(yīng)的組織結(jié)構(gòu)而不能進(jìn)行原位腫瘤的研究[27-28]。斑馬魚移植瘤生長(zhǎng)時(shí)間短、種植細(xì)胞少，很難進(jìn)行獲得性腫瘤抗藥性研究[29]，也缺乏相應(yīng)有效的斑馬魚蛋白抗體。斑馬魚正常體溫約28 ℃，哺乳類動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞高于這個(gè)體溫，并且有些腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵基因?qū)囟确浅Ｃ舾小ｋm然斑馬魚腫瘤模型有以上不足，但不可否認(rèn)，斑馬魚作為新興的獨(dú)具特點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其腫瘤模型給人類抗腫瘤藥物高通量篩選，預(yù)測(cè)抗腫瘤藥物的抗腫瘤范圍以及臨床腫瘤個(gè)體化治療方案提供非常有用的價(jià)值，也為腫瘤的研究提供了新的途徑和模型系統(tǒng)。