外泌體在肝臟損傷中的研究進(jìn)展

王子明，王 華,2,3

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，2.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，肝病研究所，3.炎癥免疫性疾病安徽省實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230032)

在多細(xì)胞生物中，體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持需要不同功能的細(xì)胞相互作用與協(xié)調(diào)，而機(jī)體在面對不同的應(yīng)激和損傷時也需要細(xì)胞間的通訊來應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)[1]，細(xì)胞不僅能夠通過直接接觸和分泌各種激素、細(xì)胞因子等化學(xué)信號傳遞信息，而且還能通過膜衍生的納米級的細(xì)胞外囊泡進(jìn)行交流，外泌體作為細(xì)胞外囊泡的一種類型，攜帶著大量的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和代謝產(chǎn)物等，在細(xì)胞間和器官間的信息傳遞中有著不可或缺的作用。

各種類型肝損傷的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，外泌體作為細(xì)胞間通訊的新介質(zhì)，能夠在肝臟受到損傷時持續(xù)分泌，其攜帶的生物信息可以傳遞給鄰近或者遠(yuǎn)距離細(xì)胞，從而引發(fā)受體細(xì)胞相關(guān)功能的改變，在多種類型肝損傷的發(fā)生發(fā)展中扮演著不同的角色。本文就外泌體在不同類型肝損傷中發(fā)揮的潛在作用予以綜述。

1 外泌體的產(chǎn)生、釋放與作用方式

外泌體是由細(xì)胞分泌的直徑約為40～160 nm的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，其產(chǎn)生與釋放包括內(nèi)體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)依賴和非依賴兩種方式，ESCRT由4種可溶性多蛋白復(fù)合物組成，包括ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ和ESCRT-Ⅲ，參與了蛋白質(zhì)的分選以及外泌體的裝載等，是進(jìn)化上高度保守的過程[1-2]。

外泌體依賴于ESCRT的發(fā)生機(jī)制：首先在胞吞和細(xì)胞膜內(nèi)陷的作用下，早期核內(nèi)體形成，之后不斷成熟形成晚期核內(nèi)體，晚期核內(nèi)體將其限制膜的一部分向腔內(nèi)萌發(fā)形成腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)，隨后ESCRT被招募到內(nèi)體膜的胞質(zhì)一側(cè)，將所選蛋白分選入ILVs，ILVs不斷累積并逐漸成熟，從而形成了多泡體(multivesicular bodies，MVBs)。隨后MVBs既可以與溶酶體融合被降解，也能夠與質(zhì)膜融合，完成外泌體的胞外分泌[3-4]。脂質(zhì)驅(qū)動可能在ESCRT非依賴機(jī)制中發(fā)揮作用，這其中研究較多的是神經(jīng)酰胺，參與了ILVs的生成[1]。

外泌體通過多種方式與靶細(xì)胞相互作用[3,5]：(1)配受體相互識別激活細(xì)胞內(nèi)信號。(2)靶細(xì)胞通過細(xì)胞膜融合吸收外泌體。(3)靶細(xì)胞通過內(nèi)吞機(jī)制(吞噬作用、大胞飲作用或受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用)內(nèi)化外泌體。

2 外泌體與肝損傷

生理?xiàng)l件下的外泌體能夠持續(xù)分泌，而在應(yīng)激或病理狀態(tài)下，外泌體的內(nèi)容物可能發(fā)生定性和定量的變化[6]。肝損傷可由脂質(zhì)、酒精、膽汁、藥物以及病毒等多種原因引起，不同類型肝損傷釋放的外泌體裝載不同的內(nèi)容物，作用于受體細(xì)胞后產(chǎn)生不同的影響，從而推動或者延緩肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來，微小RNA(microRNA，miRNA)，一種高度保守的非編碼小RNA，在各種疾病中的作用已被廣泛研究，miRNA是生物體內(nèi)基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子，外泌體攜帶包括miRNA在內(nèi)的豐富的核酸，可以通過翻譯阻滯或mRNA降解來抑制靶向mRNA的蛋白表達(dá)過程[7]。下文將重點(diǎn)介紹外泌體中的miRNA在各種類型肝損傷中的作用。

2.1 外泌體與非酒精性肝病非酒精性肝病包括單純的肝臟脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)以及相關(guān)的肝硬化和肝細(xì)胞癌一系列疾病。NASH是非酒精性脂肪肝發(fā)展為肝硬化并最終進(jìn)展為肝細(xì)胞癌的關(guān)鍵事件，炎癥的出現(xiàn)是NASH的特征之一。脂毒性的肝細(xì)胞能夠通過各種分子途徑誘發(fā)肝細(xì)胞應(yīng)激，引發(fā)肝細(xì)胞損傷，從而激活炎性細(xì)胞并釋放炎癥因子，外泌體在肝細(xì)胞和炎癥細(xì)胞的這種交叉對話中起到媒介作用。研究發(fā)現(xiàn)，脂毒性的肝細(xì)胞能夠釋放攜帶有miR-192-5p的外泌體，作用于巨噬細(xì)胞后，通過調(diào)節(jié)Rictor/Akt/FoxO1信號通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化，并刺激促炎因子的釋放，從而推動了炎癥的進(jìn)展[8]。另外，脂質(zhì)還能夠抑制肝細(xì)胞中MVBs在溶酶體的降解，導(dǎo)致含有miR-122-5p的外泌體分泌增加，并激活巨噬細(xì)胞向M1型極化，促進(jìn)了炎癥的發(fā)生與發(fā)展[9]。Hirsova等[6]研究發(fā)現(xiàn)，脂毒性肝細(xì)胞能夠釋放含有腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的外泌體，作用于位于巨噬細(xì)胞上的死亡受體5(death receptor 5，DR5)，并以DR5依賴的方式激活NF-κB信號通路，從而促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)與白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)的釋放。這些研究都表明，外泌體作為載體，攜帶著脂毒性肝細(xì)胞發(fā)出的信號分子，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的激活以及炎癥因子的釋放，推動了非酒精性肝病的炎癥進(jìn)展，這部分解釋了NASH發(fā)生的潛在機(jī)制。

Fig 1 Roles of exosomes in liver injury

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與調(diào)節(jié)脂代謝穩(wěn)態(tài)，脂毒性物質(zhì)(如飽和游離脂肪酸等)能夠誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可能會導(dǎo)致NASH的發(fā)生與發(fā)展[10]。研究發(fā)現(xiàn)[11]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞分泌的外泌體能夠通過醛酮還原酶家族1成員B7觸發(fā)NASH。另外，脂質(zhì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，肌醇依賴性激酶1α通過X盒結(jié)合蛋白1促進(jìn)神經(jīng)酰胺的新生合成增加，介導(dǎo)肝細(xì)胞以ESCRT非依賴的方式釋放外泌體后招募單核細(xì)胞到達(dá)肝臟，推動了NASH的進(jìn)程[10]。這也說明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作為脂毒性亞細(xì)胞應(yīng)激的突出類型，其能夠從外泌體的生物學(xué)過程解釋NASH的病理過程，有利于對疾病發(fā)生機(jī)制的全面理解。

另外，有趣的是，髓樣特異性IL-6能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞釋放含有miR-223的外泌體，作用于肝細(xì)胞后，減少肝細(xì)胞中具有PDZ結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄活化因子(transcriptional activator with PDZ-binding motif，TAZ)的表達(dá)，TAZ具有促纖維化的作用，抑制TAZ能夠延緩非酒精性肝病向NASH乃至肝纖維化的進(jìn)展，從而為非酒精性肝病的治療提供了新思路[12]。NASH作為非酒精性肝病進(jìn)展的關(guān)鍵事件，早期給予適當(dāng)?shù)母深A(yù)，能夠明顯減少不良的預(yù)后，外泌體在這一事件的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，將其作為治療靶點(diǎn)將具有良好的臨床前景。

此外，外泌體在非酒精性肝病中的作用不僅僅局限于推動疾病的進(jìn)展，還充當(dāng)了機(jī)體不同器官之間交流的媒介。研究發(fā)現(xiàn)[7]，脂肪變的肝細(xì)胞釋放的外泌體攜帶microRNA-1，能夠抑制血管穩(wěn)態(tài)的調(diào)控因子，從而引起內(nèi)皮炎癥的發(fā)生和動脈粥樣硬化的形成，推動了心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。此研究揭示了肝源性外泌體在肝臟和血管系統(tǒng)之間的遠(yuǎn)距離通訊中的重要作用。另外，Zhao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)超載后，肝細(xì)胞釋放富含let-7e-5p等miRNA的外泌體，作用于脂肪細(xì)胞后，導(dǎo)致脂肪重構(gòu)，從而引起脂質(zhì)在肝臟、脂肪等器官之間重新分布，這也說明了肝臟不僅僅是一個被動的異位沉積器官，而且能夠感知不同代謝狀態(tài)，并通過外泌體協(xié)調(diào)功能，以重塑脂肪組織，來適應(yīng)脂肪超載引起的代謝變化。

2.2 外泌體與酒精性肝損傷最近，大量的研究證明了酒精性肝損傷中肝細(xì)胞釋放的外泌體介導(dǎo)了酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的炎癥進(jìn)程。如蛋白質(zhì)組學(xué)分析已表明酒精性肝損傷循環(huán)中的外泌體增加，并攜帶酒精相關(guān)特異性蛋白質(zhì)，且循環(huán)外泌體中的熱休克蛋白90介導(dǎo)了巨噬細(xì)胞在肝臟的激活[14]。另外，酒精性肝細(xì)胞釋放富含線粒體雙鏈RNA的外泌體，通過刺激庫普弗細(xì)胞上的Toll樣受體3，促進(jìn)了IL-1β的產(chǎn)生與分泌，激活的庫普弗細(xì)胞進(jìn)一步招募γδT細(xì)胞并促進(jìn)了白細(xì)胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)的分泌，加速了炎癥的進(jìn)展[15]。

另外，有研究對ALD中外泌體分泌的增多做出了部分解釋，通過慢性酒精消耗可以提高肝臟中miR-155的水平，從而抑制自噬過程中的mTOR通路，下調(diào)溶酶體相關(guān)膜蛋白的表達(dá)，破壞溶酶體的功能，自噬體與多泡體結(jié)合，并將其內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外，外泌體的分泌增加[16]，此研究也進(jìn)一步表明，在ALD中，酒精可以阻斷自噬體和溶酶體融合并促進(jìn)外泌體的分泌，自噬和外泌體的生物發(fā)生是兩個復(fù)雜的過程，而由于其部分共同的分子機(jī)制，使得miR-155能夠在自噬和外泌體分泌之間產(chǎn)生串?dāng)_作用，因此，自噬和外泌體分泌之間的相互作用與影響需要進(jìn)一步研究。

目前，有關(guān)外泌體在ALD中的研究大多集中在炎癥，然而ALD也是一種代謝性疾病，外泌體在ALD的代謝過程中是否發(fā)揮作用，尚需進(jìn)一步探索。另外，外泌體在體液中廣泛存在，且攜帶酒精相關(guān)特異性組分，也可作為診斷酒精性肝損傷的標(biāo)志物，但其特異性與靈敏度尚需評價(jià)。

2.3 外泌體與膽汁淤積性肝損傷膽汁流動障礙和膽汁酸代謝紊亂是膽汁淤積性肝損傷的主要誘因，肝內(nèi)膽汁酸的淤積激活炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝內(nèi)膽管破壞以及肝細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致膽管炎、肝纖維化和潛在的肝硬化。膽管細(xì)胞分泌的外泌體在膽汁淤積性肝損傷的發(fā)生以及疾病的進(jìn)展中扮演著重要角色。研究表明[17]，在膽汁淤積的情況下，膽管細(xì)胞上調(diào)了長鏈非編碼RNA H19(long non-coding RNA H19，lncRNA H19)的表達(dá)，由外泌體裝載并作用于肝細(xì)胞，在肝細(xì)胞中通過抑制啟動子活性和降低mRNA穩(wěn)定性來抑制小異源二聚體伴侶受體的表達(dá)，從而導(dǎo)致了膽汁淤積性肝損傷的發(fā)生與發(fā)展。此外，外泌體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的活化在膽汁淤積性肝損傷的炎癥進(jìn)展中也起著關(guān)鍵性的作用，同樣在膽汁淤積的情況下，攜帶有l(wèi)ncRNA H19的外泌體被庫普弗細(xì)胞攝取后，誘導(dǎo)了炎癥因子的表達(dá)、單核細(xì)胞的趨化以及M1型巨噬細(xì)胞的極化，從而導(dǎo)致了肝臟的炎癥進(jìn)展[18]。另外，肝星狀細(xì)胞的激活是促進(jìn)慢性膽汁淤積性肝病進(jìn)展的主要驅(qū)動力。有研究進(jìn)一步表明，膽管細(xì)胞釋放的含lncRNA H19的外泌體能夠作用于肝星狀細(xì)胞，從而促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化和增殖，加速了膽汁淤積性肝纖維化的進(jìn)程[19]。

2.4 外泌體與藥物性肝損傷目前普遍認(rèn)為，藥物引起的肝細(xì)胞損傷可能是由免疫反應(yīng)介導(dǎo)的，并且大多數(shù)延遲時間較長的特異型藥物性肝損傷是由適應(yīng)性免疫攻擊引起的[20]。外泌體可能在肝臟對藥物的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。Ogese等[21]通過對藥物性肝損傷中肝源性外泌體內(nèi)包裹的蛋白質(zhì)進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)經(jīng)藥物修飾后的蛋白可以通過外泌體從組織細(xì)胞轉(zhuǎn)移到免疫系統(tǒng)，最終以肽片段的形式呈遞至樹突狀細(xì)胞表面的人白細(xì)胞抗原分子，觸發(fā)抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，介導(dǎo)肝細(xì)胞的損傷。另外，在藥物性肝損傷當(dāng)中，肝細(xì)胞來源的外泌體能夠被單核細(xì)胞吸收并傳遞miRNA，改變單核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，對單核細(xì)胞進(jìn)行免疫抑制，從而促進(jìn)肝臟的免疫耐受，T細(xì)胞反應(yīng)可能正是由于免疫耐受的喪失導(dǎo)致的[22]。另外，Yarana等[23]認(rèn)為，化療藥物阿霉素處理后的肝源性外泌體中的4-羥基壬烯醛——阿霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的毒性脂質(zhì)過氧化物，能夠上調(diào)巨噬細(xì)胞抗氧化酶硫氧還蛋白1水平，并通過調(diào)節(jié)抗炎與促炎之間的平衡從而保護(hù)肝臟免受炎癥損傷，這也表明了并不是所有暴露于氧化應(yīng)激條件下釋放的外泌體都是有害的，外泌體也是一種新型的氧化還原免疫應(yīng)答介質(zhì)，提高了我們對癌癥治療過程中先天免疫應(yīng)答的認(rèn)識。

2.5 外泌體與病毒性肝損傷外泌體在病毒性肝損傷中可能扮演著不同的角色。首先，被乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染后的肝細(xì)胞分泌的外泌體被證實(shí)具有免疫抑制功能[24]。另外，外泌體可以將干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白2轉(zhuǎn)運(yùn)至樹突狀細(xì)胞，抑制干擾素α(interferon-α，IFN-α)的激活，并阻斷了外源性IFN-α的抗HBV治療效果[25]。其次，在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染導(dǎo)致的病毒性肝損傷當(dāng)中，被HCV感染的肝細(xì)胞分泌的外泌體中的miR-192通過上調(diào)肝星狀細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達(dá)，刺激肝星狀細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞活化，推動了肝纖維化的進(jìn)程[26]。

有趣的是，在病毒性肝損傷當(dāng)中，外泌體不僅在加速病毒復(fù)制以及推動纖維化進(jìn)程中發(fā)揮作用，還可以通過干擾素抑制病毒復(fù)制從而介導(dǎo)抗病毒反應(yīng)。巨噬細(xì)胞來源的含有hsa-miR-574-5p的外泌體能夠抑制肝細(xì)胞中HBV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[27]。Zhao等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染的肝細(xì)胞衍生的外泌體含有HBV編碼的miRNA，即HBV-miR-3，下調(diào)了巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子的表達(dá)，從而激活JAK/STAT信號通路，增強(qiáng)了干擾素介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)，并且巨噬細(xì)胞向M1表型極化，IL-6分泌增加，減輕了病毒性肝損傷。

外泌體對病毒性肝損傷的影響是多方面的，其可以清除病毒復(fù)制的不利因素，加速纖維化進(jìn)程，也能夠通過細(xì)胞間通訊的作用激活先天免疫應(yīng)答來抑制病毒復(fù)制，因此，外泌體在病毒性肝損傷當(dāng)中的作用是復(fù)雜的，尚需進(jìn)一步的研究與探討。

3 結(jié)論

外泌體中含有蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等多種生物大分子，其介導(dǎo)的細(xì)胞通訊作用在機(jī)體中可能扮演著不同的角色，不同類型的細(xì)胞可以在生理?xiàng)l件下通過外泌體維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，也能夠通過激活受體細(xì)胞的不同通路改變其功能，進(jìn)而保護(hù)肝臟免受損傷或?qū)е赂鞣N類型肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展，因此，外泌體在不同條件下功能的復(fù)雜性需要進(jìn)一步研究。另外，病理生理?xiàng)l件下的肝源性外泌體的作用不僅僅局限于肝臟的內(nèi)環(huán)境，還可以通過遠(yuǎn)距離的通訊影響其他組織器官，所以，外泌體對機(jī)體的影響是廣泛而深遠(yuǎn)的。同時，在循環(huán)和肝臟中存在的特異性外泌體又使得其在肝損傷的診斷、治療和預(yù)后等方面具有較好的臨床前景，可作為肝損傷新型的治療載體、免疫調(diào)節(jié)劑等。外泌體的研究與應(yīng)用也不僅僅局限于肝臟疾病，同時為許多疾病的診斷和治療提供了新的方法和策略。但是，外泌體的分離純化等技術(shù)尚需簡化和優(yōu)化，雖然許多新的方法已經(jīng)開發(fā)，但是尚未進(jìn)行有力的評價(jià)，未來對于外泌體介導(dǎo)的疾病發(fā)生的具體機(jī)制也要進(jìn)一步研究。