氣相色譜法測(cè)定馬鈴薯中毒死蜱殘留量的不確定度評(píng)定

李少萍，杜志龍，張小燕，盧天齊，楊延辰，陳小娟

（中國(guó)農(nóng)業(yè)機(jī)械化科學(xué)研究院集團(tuán)有限公司，北京 100083）

馬鈴薯是茄科一年生塊莖草本植物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，有“地下蘋果”和“第二面包”的美稱。美國(guó)農(nóng)業(yè)部研究中心的341 號(hào)研究報(bào)告指出：“每天食用馬鈴薯和全脂奶粉便可以獲得人體所需的一切營(yíng)養(yǎng)元素”，并且認(rèn)為馬鈴薯將是世界的一種主要糧食食品。2015 年中國(guó)啟動(dòng)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，馬鈴薯成為繼水稻、小麥、玉米后第四大主糧食物[1,2]。然而，在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中，為追求馬鈴薯的高產(chǎn)高效和管理方便，農(nóng)藥的使用頻次和使用量一步步加大。雖然馬鈴薯可食用塊莖生長(zhǎng)在地下，常常被誤認(rèn)為比裸露在空氣中直接被農(nóng)藥噴灑的果蔬安全，但土地里農(nóng)藥殘留也很多，有些不易降解的農(nóng)藥更是在土地里積累。眾所周知，農(nóng)藥殘留對(duì)人體健康危害極大，高濃度農(nóng)藥殘留進(jìn)入人體后對(duì)人體健康造成不同程度的危害，低濃度超標(biāo)的農(nóng)藥殘留不會(huì)在短時(shí)間內(nèi)引起癥狀，但可以長(zhǎng)期積累，通過(guò)食物鏈的傳播產(chǎn)生富集，很可能導(dǎo)致人體的慢性中毒。有研究表明，心腦血管疾病、阿爾茨海默病、帕金森病等疾病發(fā)病率的增加與農(nóng)藥殘留的食用直接相關(guān)[3]。

毒死蜱是劇毒和高殘留農(nóng)藥的最佳替代品，廣泛用于農(nóng)業(yè)和城市衛(wèi)生害蟲防治。毒死蜱是目前世界上生產(chǎn)和銷售的最大殺蟲劑品種之一，也是世界衛(wèi)生組織許可的唯一有機(jī)磷品種[4]。中國(guó)毒死蜱的生產(chǎn)和使用也在增加。近年來(lái)，由于毒死蜱的廣泛應(yīng)用，許多地區(qū)的土壤、大氣、雨水、地下水等環(huán)境中都檢測(cè)到了毒死蜱殘留。雖然毒死蜱是替代劇毒有機(jī)磷農(nóng)藥的最佳選擇，但其毒性不容忽視。毒死蜱可引起人體膽堿酯酶的抑制，膽堿酯酶在神經(jīng)系統(tǒng)中積聚，導(dǎo)致惡心、頭暈，甚至神志不清，接觸高濃度的毒死蜱會(huì)導(dǎo)致呼吸麻痹和死亡[5]。因此，很有必要提高毒死蜱等農(nóng)藥殘留檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

測(cè)量不確定度評(píng)定是對(duì)檢測(cè)結(jié)果可信性、準(zhǔn)確度檢查的重要指標(biāo)，在測(cè)量結(jié)果的評(píng)估中起著重要作用。通過(guò)分析每個(gè)不確定度的分量大小，找出影響測(cè)試結(jié)果的主要因素，從而對(duì)主要影響因素嚴(yán)加把控，提高檢測(cè)質(zhì)量[6-9]。本研究根據(jù)JJF1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[10]原理方法和NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測(cè)定》[11]，對(duì)馬鈴薯中毒死蜱的殘留量進(jìn)行了不確定度分析與評(píng)定。通過(guò)不確定度分析，找出毒死蜱測(cè)定過(guò)程中影響不確定度的主要來(lái)源，控制檢測(cè)過(guò)程中容易引入高不確定度的環(huán)節(jié)，對(duì)其他農(nóng)藥殘留的精確檢測(cè)也提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯樣品為中國(guó)農(nóng)業(yè)機(jī)械化科學(xué)研究院集團(tuán)有限公司行業(yè)技術(shù)服務(wù)中心在國(guó)家監(jiān)督抽查中的陽(yáng)性樣品。

丙酮，重蒸；乙腈，分析純；氯化鈉，分析純。毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[濃度100 mg/L，證書編號(hào)：GBW(E)081141，來(lái)源為中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院]。

濾膜：0.2 μm，有機(jī)溶劑膜；硅膠：60～80 目130℃烘2 h，以5%水失活；助濾劑：celite545；凝結(jié)液：5 g 氯化銨+10 mL 磷酸+100 mL 水，用前稀釋5 倍。

1.2 儀器與設(shè)備

磐諾A91PLUS 氣相色譜儀（常州磐諾儀器有限公司，常州），配有火焰光度檢測(cè)器（FPD 磷濾光片）；分析天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司，常州]，感量0.1 mg；雞心瓶，200 mL；移液器，1 mL；具塞離心管，50 mL；渦旋混合器，氮?dú)獯蹈蓛x（南京銘奧儀器設(shè)備有限公司，南京）；低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，合肥），3 500 r/min；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，上海）。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取10 g 試樣（精確至0.01 g）于50 mL 具塞離心管中，加入20 mL乙腈，震蕩30 min后過(guò)濾，濾液中加入5 g 氯化鈉，蓋上塞子，劇烈震蕩1 min，3 500 r/min 離心2 min，使乙腈相和水相分層。轉(zhuǎn)移出乙腈至磨口三角瓶中，重復(fù)上述操作再提取一遍殘?jiān)?，合并乙腈相，乙腈相?0℃水浴中旋蒸近干，加入1 mL 丙酮定容后過(guò)0.2 μm 有機(jī)溶劑膜于進(jìn)樣小瓶中，待測(cè)。

色譜柱：Elite1701，0.25 μm×30 m×0.32 mm。

氣體流速：氮?dú)猓?0 mL/min；尾吹氣（氮?dú)猓?0 mL/min；氫氣流量，50 mL/min；空氣流量，70 mL/min。

進(jìn)樣口溫度220℃；檢測(cè)器溫度240℃；柱溫升溫程序：初始150℃保持4 min，然后8℃/min 升到230℃保持8 min。進(jìn)樣方式：不分流；進(jìn)樣量：1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

試樣中毒死蜱殘留量計(jì)算公式：

式中：X—試樣中毒死蜱殘留量，mg/kg；c—試樣溶液中毒死蜱殘留量的濃度，mg/L；V—被測(cè)試樣總體積，mL；m—稱取試樣的質(zhì)量，g；1 000—換算系數(shù)。

2.2 測(cè)量不確定度來(lái)源分析

毒死蜱殘留量測(cè)定相關(guān)不確定度來(lái)源，見(jiàn)圖1。

圖1 毒死蜱殘留量測(cè)定相關(guān)不確定度來(lái)源Figure 1 Source of uncertainty for the determination of chlorpyrifos residues

2.3 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度各分量

根據(jù)數(shù)學(xué)模型分析，不確定度的來(lái)源主要有，樣品重復(fù)性試驗(yàn)、樣品稱量、樣品定容、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、添加回收率及氣相色譜儀。

2.3.1 重復(fù)性試驗(yàn)引入的相對(duì)不確定度ur(x)

對(duì)馬鈴薯中毒死蜱殘留量重復(fù)測(cè)量7 次，測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 毒死蜱殘留量測(cè)量結(jié)果Table 1 Measurement results of chlorpyrifos residues

毒死蜱殘留量標(biāo)準(zhǔn)偏差s采用貝塞爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度則由重復(fù)性試驗(yàn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度0.004 04。

2.3.2 樣品稱量引入的相對(duì)不確定度ur( m)

樣品稱量所引入的不確定度主要來(lái)源于所用天平的重復(fù)性和最大允許誤差。本試驗(yàn)中使用的電子天平（BSA224S）檢定證書上給出的重復(fù)性為0.1 mg，法定允差為±0.5 mg，按均勻分布，則天平稱量所引入的相對(duì)不確定度為0.000 030 0。

2.3.3 樣品定容引入的相對(duì)不確定度ur( v)

樣品定容引入的不確定度包括1 mL分度吸量管允差和溫度引起水體積變化引入的不確定度兩部分。

（1）1 mL 分度吸量管允差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1( v)

樣品最后用1 mL 分度吸量管定容，1 mL 分度吸量管容量（B級(jí)）允差為±0.015 mL，按均勻分布，引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）溫度對(duì)1 mL 分度吸量管體積影響引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( v)

1 mL 分度吸量管檢定時(shí)溫度為20.0℃，試驗(yàn)時(shí)溫度為25.0℃，溫度波動(dòng)為2.0℃，水的膨脹系數(shù)是2.1×10-4℃，則溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

則樣品定容過(guò)程1 mL 分度吸量管容量（B 級(jí)）引入的相對(duì)不確定度為：

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程引入的相對(duì)不確定度ur( c1)

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中引入的不確定度由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度和標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋過(guò)程引入的不確定度組成。

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)不確定度u1(c1)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)毒死蜱[證書編號(hào)：GBW(E)081141]，標(biāo)準(zhǔn)值100 μg/mL，證書給出的不確定度為3%（k=2），則

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程中引入的相對(duì)不確定度u2( c1)

毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程為：取1 mL 100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用丙酮定容至10 mL，得10 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)貯備液；再用1 mL 分度吸量管分別吸取10 mg/L毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2，0.4，0.6，0.8 和1.0 mL，置于10 mL 容量瓶中用丙酮定容配制成0.2，0.4，0.6，0.8 和1.0 mg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在此過(guò)程中不確定度主要由所用分度吸量管不確定度、容量瓶不確定度和溫度影響的不確定度組成。

1 mL 分度吸量管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c11)。1 mL 分度吸量管引入的不確定度主要有兩個(gè)：

（1）分度吸量管允差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c111)。1 mL 分度吸量管容量（B 級(jí)）允差為±0.015 mL，按均勻分布，引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）溫度對(duì)1 mL 移液管體積的影響引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c112)。標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c112)=則1 mL分度吸量管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.008 66。

1 mL 分度吸量管吸取0.2 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c12)。1 mL分度吸量管引入的不確定度主要有兩個(gè)：（1）分度吸量管允差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c111)。（2）溫度對(duì)1 mL移液管吸取0.2 mL體積的影響引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c122)。標(biāo)準(zhǔn)不確定度則1 mL 分度吸量管吸取0.2 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c12)=

1 mL 分度吸量管吸取0.4 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c13)。1 mL 分度吸量管引入的不確定度主要有兩個(gè)：（1）分度吸量管允差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c111) 。（2）溫度對(duì)1 mL 移液管吸取0.4 mL 體積的影響引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c132)。標(biāo)準(zhǔn)不確定度0.000 096 8。則1 mL分度吸量管吸取0.4 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度0.008 66。

1 mL 分度吸量管吸取0.6 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c14)。1 mL分度吸量管引入的不確定度主要有兩個(gè)：（1）分度吸量管允差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c111) 。（2）溫度對(duì)1 mL 移液管吸取0.6 mL 體積的影響引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c142)。標(biāo)準(zhǔn)不確定度0.000 145。則1 mL分度吸量管吸取0.6 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度0.008 66。

1 mL分度吸量管吸取0.8 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c15)。1 mL分度吸量管引入的不確定度主要有兩個(gè)：（1）分度吸量管允差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c111) 。（2）溫度對(duì)1 mL 移液管吸取0.8 mL體積的影響引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2( c152)。標(biāo)準(zhǔn)不確定度則1 mL分度吸量管吸取0.8 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度則標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程中引入的相對(duì)不確定度

則標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對(duì)不確定度ur( c1)=

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)不確定度ur( c2)

對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各濃度分別進(jìn)行3 次測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積Table 2 Peak area of chlorpyrifos standard solution

由氣相色譜儀工作站得擬合工作曲線方程：y=ax+b（y為峰面積，x為濃度），a= 12 567.74，b=-287.539 8，R2=0.999 30。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度u1(y)由式（1）計(jì)算：

式中：a—標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，12 567.74；p—樣品重復(fù)測(cè)定次數(shù)，7；n—標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點(diǎn)數(shù)，5；—樣品測(cè)定平均濃度，mg/L；—標(biāo)準(zhǔn)溶液平均濃度，mg/L；—標(biāo)準(zhǔn)濃度Ci對(duì)應(yīng)的平均峰面積；s—擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差；Ci—標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)濃度值，mg/L；b—標(biāo)準(zhǔn)曲線截距，-287.539 8。

工作曲線擬合引入的相對(duì)不確定度ur(c)2=

2.3.6 氣相色譜儀引入的相對(duì)不確定度ur( c3)

結(jié)合儀器檢定證書上的信息，測(cè)量不確定度為3%（k=2），則相對(duì)不確定為

2.3.7 方法回收率引入的相對(duì)不確定度ur(R)

待測(cè)樣品在預(yù)處理過(guò)程中受樣品性質(zhì)和基質(zhì)效應(yīng)的影響，樣品中待測(cè)組分不能100%進(jìn)入測(cè)定溶液，可通過(guò)加標(biāo)回收試驗(yàn)評(píng)估該過(guò)程中引入的不確定度。根據(jù)檢測(cè)方法，平行制備并測(cè)試了7 個(gè)加標(biāo)樣品，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 毒死蜱回收率測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of chlorpyrifos recovery rate

由表3 計(jì)算回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差s(R =)1.439 7。則回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度則回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度0.005 62。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)t方法檢驗(yàn)，判斷偏差是否顯著，當(dāng)置信度為95%，n-1=6時(shí)，查t值臨界值分布表，發(fā)現(xiàn)毒死蜱的t值小于雙邊臨界值t(0.05,6）=2.447 1，回收率與100%無(wú)顯著差異。

2.4 馬鈴薯中毒死蜱殘留量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度U( X)

實(shí)際測(cè)定馬鈴薯中毒死蜱殘留量為0.011 69 mg/kg，回收率修正后為0.012 09 mg/kg，馬鈴薯中毒死蜱殘留量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為U( X)=0.097 2 ×0.012 09=0.001 175 mg/kg。

2.5 擴(kuò)展不確定度

取包含因子k= 2，則馬鈴薯中毒死蜱殘留量的擴(kuò)展不確定度U=U( X)×2=0.001 175 × 2 =0.002 35 mg/kg，樣品測(cè)定結(jié)果可表示為X=（0.012 09±0.002 35）mg/kg，k=2。

3 討 論

氣相色譜法是當(dāng)前應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的重要方法之一，在檢測(cè)過(guò)程中，容易受到檢測(cè)儀器、檢測(cè)試劑、環(huán)境溫度、樣本制備、稱量、提取、凈化、定容、時(shí)間控制等諸多因素的影響，操作不當(dāng)會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果[12,13]。本研究通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型分析了氣相色譜法測(cè)定馬鈴薯中毒死蜱殘留量的不確定度來(lái)源，討論了各不確定分量對(duì)合成不確定度的影響。由此試驗(yàn)結(jié)果可知，除了本試驗(yàn)所用儀器外，測(cè)量不確定度的主要來(lái)源為標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度，其中主要原因是樣品測(cè)定濃度較低，沒(méi)有落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間，因此配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，樣品檢出濃度應(yīng)盡量落在標(biāo)液濃度的平均值處，這樣可以較大的減少標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度。其次為標(biāo)準(zhǔn)溶液定容及配制過(guò)程引入的不確定度，分析是由于各實(shí)驗(yàn)室使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身的不確定度所致，在擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的過(guò)程中有很多重復(fù)測(cè)定的步驟，這都與人員的操作有關(guān)。因此，毒死蜱檢測(cè)時(shí)應(yīng)特別注意標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，規(guī)范操作，減少人為因素帶來(lái)的誤差。其次，為了降低標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度，一方面可以增加毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液系列點(diǎn)的個(gè)數(shù)，另一方面可以增加樣品溶液的平行測(cè)定次數(shù)，使被測(cè)物質(zhì)的含量盡可能接近標(biāo)準(zhǔn)曲線中相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量。