劉思邈,孫清華,張鳳軍,馬永強(qiáng),馮志文,張若芳*
(1.內(nèi)蒙古大學(xué)馬鈴薯工程技術(shù)研究中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021;2.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院,青海 西寧 810016)
馬鈴薯原產(chǎn)于南美洲安第斯山高山區(qū),由于其塊莖具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,是僅次于水稻和小麥的全球第三大糧食作物[1]。在中國(guó)馬鈴薯種植范圍較為廣泛,覆蓋了東北、華北、西北、西南和華南各地區(qū),種植面積達(dá)4.67×106hm2左右。但隨之而來(lái)的是馬鈴薯病蟲(chóng)害對(duì)其產(chǎn)量的影響日益突出,其中黑脛病為生產(chǎn)上廣泛發(fā)生的病害之一,發(fā)病嚴(yán)重時(shí)田間發(fā)病率可達(dá)50%以上,嚴(yán)重降低了馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì),使種植戶(hù)遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失。
馬鈴薯黑脛病是一種細(xì)菌性病害,一般是種薯帶菌開(kāi)始腐爛,傳至地下莖,地下莖腐爛后傳至地上莖基部,維管束病變部位呈現(xiàn)黑褐色,植物葉片開(kāi)始萎蔫,莖基部撕裂折斷;后期病菌通過(guò)匍匐莖傳入到新的塊莖中,導(dǎo)致新生塊莖腐爛。馬鈴薯黑脛病病原菌屬于果膠桿菌屬(Pectobacteriumspp.)和狄克氏菌屬(Dickeyaspp.),果膠桿菌科(Pectobacteriaceae),變形菌門(mén)(Proteobacteria)[2],其宿主范圍廣泛,包括馬鈴薯在內(nèi)的其他蔬菜作物以及觀賞植物[3]。其中果膠桿菌屬和狄克氏菌屬分布尤為廣泛,已報(bào)道可以侵染39 個(gè)科的86 種不同植物[4]。在中國(guó),馬鈴薯黑脛病主要致病菌為果膠桿菌屬病原菌。該病原菌分布廣泛,在不同區(qū)域病原群體結(jié)構(gòu)特征可能存在差異。本研究從青海省馬鈴薯產(chǎn)區(qū)病樣組織中分離致病菌,通過(guò)16S rRNA序列、多位點(diǎn)序列分析以及致病性進(jìn)行病原菌的鑒定,比較分析不同菌株的致病力,期望了解不同區(qū)域的主要病原菌種類(lèi),為制定有針對(duì)性的黑脛病有效防控措施提供理論基礎(chǔ)。
2021年9月,在青海省西寧市(E101.74°,N36.56°)馬鈴薯產(chǎn)區(qū)(調(diào)查面積為30 hm2)發(fā)現(xiàn)疑似黑脛病感染植株(圖1),發(fā)病率為20%左右。從該產(chǎn)區(qū)采集到‘Favorita’疑似病株5 株,分離得到Pectobacteriumspp. 3 株 , 命 名 為 ZRIMU1222、 ZRIMU1223 和ZRIMU1224。將樣品進(jìn)行分離病原菌,首先將受黑脛病感染的植物莖部切下,在75%乙醇中浸泡2 min,用蒸餾水沖洗干凈,移至磨樣袋中,并加入無(wú)菌蒸餾水,充分研磨,保留上清液,將上述溶液梯度稀釋?zhuān)臃N到結(jié)晶紫果膠酸瓊脂(Crystal violet pectate,CVP)平板上,28℃孵育2~3 d[5],用牙簽挑取在CVP 平板上出現(xiàn)的單個(gè)細(xì)菌菌落,并在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上劃線(xiàn),以獲得純菌落。
圖1 田間馬鈴薯植株黑脛病癥狀Figure 1 Symptoms of blackleg on potato plant from the field
將所分離到的細(xì)菌置于營(yíng)養(yǎng)肉湯(Nutrient broth,NB)培養(yǎng)基中,28℃,200 r/min 振蕩培養(yǎng)16 h,將細(xì)菌懸浮液在12 000 r/min 下離心2 min,使用TaKaRa Mini BEST 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA的提取。
使用通用引物8F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGA CTT),對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行16S rRNA 基因擴(kuò)增,反應(yīng)體系為:Green Mix,12.5 μL,引物各 0.6 μL,模板 1.0 μL,ddH2O 10.3 μL,反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃,5 min;98℃,10 s,退火溫度 55℃,5 s,72℃,100 s,29 個(gè)循環(huán);72℃,5 min。PCR 反應(yīng)使用T100 TM 熱循環(huán)儀(美國(guó)Bio-Rad)完成。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),質(zhì)量良好的PCR 產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行Sanger 測(cè)序,將獲得序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中己知序列進(jìn)行Blast 比對(duì),并利用MEGAX[6]軟件,使用最大似然法和Tamura-Nei model進(jìn)行16S系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。
采用多位點(diǎn)序列分析,對(duì)病原菌proA(MT427753-MT427756)、icdA(MT427761-MT427764)、mdh(MT427765-MT427768)、gapA(MT427769-MT427772)[4]、gyrA(MT427757-MT427760)和rpoS(MT427773-MT427776)[7]6個(gè)管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為:Prime STAR HS DNA Polymerase(2×),12.5 μL,引物各0.6 μL,模板1.0 μL,ddH2O 10.3 μL,反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃,5 min;98℃,10 s,退火溫度59℃,5 s,72℃,1 min,29 個(gè)循環(huán);72℃,5 min。PCR反應(yīng)使用T100 TM 熱循環(huán)儀(美國(guó)Bio-Rad)完成。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),質(zhì)量良好的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序,將獲得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中己知序列進(jìn)行Blast 比對(duì),并利用MEGAX[6]軟件,使用最大似然法和Tamura-Nei model 進(jìn)行MLSA 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。
1.5.1 植株檢測(cè)
3株分離株菌懸液(106cfu/mL)以莖基部注射方式侵染馬鈴薯品種‘費(fèi)烏瑞它’的幼苗(每株菌侵染5 株植株),以無(wú)菌水或營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基作為對(duì)照,幼苗生長(zhǎng)環(huán)境保持在相對(duì)濕度80%、溫度21℃,侵染7 d后拍照記錄[8]。
1.5.2 薯塊檢測(cè)
選用‘Favorita’種薯,切成兩半,3株P(guān).polaris菌株菌懸液(106cfu/mL)離心,棄上清液,沉淀加入無(wú)菌蒸餾水中制成混懸液,于馬鈴薯切面的四角及中間部位穿刺并注入100 μL 混懸液,以無(wú)菌水為對(duì)照,3 次重復(fù)[9]。接種后處理與對(duì)照分別包裹封口膜,以保持薯塊濕度,于28℃培養(yǎng)2~3 d,觀察發(fā)病情況。
基于16S rRNA基因完整序列,以Dickeyaspp.菌株,以及Erwiniaspp.菌株為外群,將ZRIMU1222、ZRIMU1223 和ZRIMU1224 菌株序列(登錄號(hào)分別為:OP389242、OP389243 和 OP389244)與已發(fā)表的18 株果膠桿菌菌株的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示,本研究分離得到的3個(gè)菌株與P.polaris菌株構(gòu)成了明顯的分枝,已發(fā)表的P. atrosepticum、P. brasiliense、P. carotovorum與P. parmentieri株系形成的類(lèi)群則分別構(gòu)成了獨(dú)立的分枝(圖2)。
圖2 基于3株分離株及其他果膠桿菌屬菌株16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of three strains and other Pectobacterium strains
基于菌株的多位點(diǎn)rpoS-proA-gapA-icdA-gyrA-mdh堿基串聯(lián)序列,用Pectobacteriumspp.及其密切相關(guān)的物種Dickeyaspp.的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。結(jié)果顯示,分離株ZRIMU1222、ZRIMU1223、ZRIMU1224親緣關(guān)系較近,與Pectobacterium polaris其他菌株聚集到一起,同屬一個(gè)分枝;與其他Pectobacteriumspp.,Dickeyaspp.以及Erwiniaspp.親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。由此,可以推斷出分離株ZRIMU1222、ZRIMU1223、ZRIMU1224這3株菌株具有較高的相似性,且均來(lái)源于果膠桿菌屬,屬于Pectobacterium polaris。
圖3 基于3株分離株及其他果膠桿菌屬菌株rpoS、proA、gapA、icdA、gyrA和mdh多位點(diǎn)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 3 Phylogenetic tree based on the multi-locus sequence of rpoS,proA,gapA,icdA,gyrA,and mdh of three strains and other Pectobacterium strains
用 106cfu/mL 的 ZRIMU1222、 ZRIMU1223 和ZRIMU1224 菌液和營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基(對(duì)照)注入馬鈴薯品種‘費(fèi)烏瑞它’的幼苗,結(jié)果顯示注射ZRIMU1222、ZRIMU1223 和 ZRIMU1224 菌液的幼苗均出現(xiàn)癥狀(莖基部腐爛發(fā)黑),而對(duì)照植株無(wú)病癥,注射傷口呈愈合狀態(tài)(圖4)。薯塊侵染3 d后,感染Pectobacterium的薯塊均表現(xiàn)出潰爛發(fā)臭的癥狀(圖4),對(duì)照組無(wú)病癥,薯肉緊實(shí)無(wú)潰爛癥狀。
圖4 基于科赫法則將分離株分別感染‘費(fèi)烏瑞它’幼苗和塊莖Figure 4 'Favorita'seedlings and tubers infected with candidate pathogenic isolates for Koch's postulate test
馬鈴薯黑脛病是一種細(xì)菌性病害,在中國(guó)馬鈴薯產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴(yán)重,可發(fā)生在馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段,通過(guò)影響出苗率、幼苗存活率降低產(chǎn)量,造成經(jīng)濟(jì)損失[10]。由于馬鈴薯新品種的更新、檢疫制度不健全及種薯跨區(qū)調(diào)運(yùn)頻繁,使得馬鈴薯黑脛病發(fā)生呈逐年上升趨勢(shì)[11],新的致病菌逐步走入大眾的視野,Pectobacteriumspp.屬的種和亞種數(shù)量逐漸增加。在癥狀上,幾種致病菌引起的黑脛和軟腐癥狀是類(lèi)似的,所以單單依靠表型特征和生理生化測(cè)試進(jìn)行相同種或亞種之間的準(zhǔn)確鑒別變得比較困難。DNA標(biāo)記、血清學(xué)[12]、16S rRNA序列[13]以及多位點(diǎn)序列分析[14],在許多植物病原細(xì)菌致病亞種和致病型區(qū)分方面有較多報(bào)道,是目前較常用的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分類(lèi)方法。本研究運(yùn)用生物信息學(xué),通過(guò)對(duì)同源序列進(jìn)行篩選、序列比對(duì)、進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建、評(píng)估進(jìn)化樹(shù)4個(gè)步驟,對(duì)其基因組進(jìn)行分析,所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明,分離的3 個(gè)Pectobacterium polaris菌株與已發(fā)表的Pectobacterium polaris株系共同形成了明顯的Pectobacterium polaris分枝,且該分枝與其他種(或亞種)形成了不同類(lèi)群,由此可以推斷這3 株分離物屬于Pectobacterium polaris菌株。后續(xù)致病性檢測(cè)表明,3株分離株均滿(mǎn)足科赫法則,且被侵染的植株維管束病變部位均呈現(xiàn)黑褐色,被侵染的薯塊潰爛發(fā)臭。
目前,青海地區(qū)已檢測(cè)并報(bào)道的病原菌為Pectobacterium atrosepticum[15],而Pectobacterium polaris病原菌株尚未報(bào)道。近幾年,歐洲國(guó)家,如波蘭[16]、俄羅斯[17]、土耳其[18]等對(duì)于Pectobacterium polaris均有報(bào)道。在中國(guó),Wang 等[19]在河北,首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了Pectobacterium polaris菌株,Handique等[20]在內(nèi)蒙古自治區(qū)及四川省相繼報(bào)道了該菌株。本研究發(fā)現(xiàn)的3株病原菌Pectobacterium polaris在青海省為首次報(bào)道,期望此研究為后續(xù)致病機(jī)理的研究以及生防菌的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。