首次于青海省發(fā)現(xiàn)Pectobacterium polaris引起馬鈴薯黑脛病

劉思邈，孫清華，張鳳軍，馬永強(qiáng)，馮志文，張若芳*

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)馬鈴薯工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016）

馬鈴薯原產(chǎn)于南美洲安第斯山高山區(qū)，由于其塊莖具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是僅次于水稻和小麥的全球第三大糧食作物[1]。在中國(guó)馬鈴薯種植范圍較為廣泛，覆蓋了東北、華北、西北、西南和華南各地區(qū)，種植面積達(dá)4.67×106hm2左右。但隨之而來的是馬鈴薯病蟲害對(duì)其產(chǎn)量的影響日益突出，其中黑脛病為生產(chǎn)上廣泛發(fā)生的病害之一，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)田間發(fā)病率可達(dá)50%以上，嚴(yán)重降低了馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，使種植戶遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失。

馬鈴薯黑脛病是一種細(xì)菌性病害，一般是種薯帶菌開始腐爛，傳至地下莖，地下莖腐爛后傳至地上莖基部，維管束病變部位呈現(xiàn)黑褐色，植物葉片開始萎蔫，莖基部撕裂折斷；后期病菌通過匍匐莖傳入到新的塊莖中，導(dǎo)致新生塊莖腐爛。馬鈴薯黑脛病病原菌屬于果膠桿菌屬（Pectobacteriumspp.）和狄克氏菌屬（Dickeyaspp.），果膠桿菌科（Pectobacteriaceae），變形菌門（Proteobacteria）[2]，其宿主范圍廣泛，包括馬鈴薯在內(nèi)的其他蔬菜作物以及觀賞植物[3]。其中果膠桿菌屬和狄克氏菌屬分布尤為廣泛，已報(bào)道可以侵染39 個(gè)科的86 種不同植物[4]。在中國(guó)，馬鈴薯黑脛病主要致病菌為果膠桿菌屬病原菌。該病原菌分布廣泛，在不同區(qū)域病原群體結(jié)構(gòu)特征可能存在差異。本研究從青海省馬鈴薯產(chǎn)區(qū)病樣組織中分離致病菌，通過16S rRNA序列、多位點(diǎn)序列分析以及致病性進(jìn)行病原菌的鑒定，比較分析不同菌株的致病力，期望了解不同區(qū)域的主要病原菌種類，為制定有針對(duì)性的黑脛病有效防控措施提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 分離和純化

2021年9月，在青海省西寧市（E101.74°，N36.56°）馬鈴薯產(chǎn)區(qū)（調(diào)查面積為30 hm2）發(fā)現(xiàn)疑似黑脛病感染植株（圖1），發(fā)病率為20%左右。從該產(chǎn)區(qū)采集到‘Favorita’疑似病株5 株，分離得到Pectobacteriumspp. 3 株 ， 命 名 為 ZRIMU1222、 ZRIMU1223 和ZRIMU1224。將樣品進(jìn)行分離病原菌，首先將受黑脛病感染的植物莖部切下，在75%乙醇中浸泡2 min，用蒸餾水沖洗干凈，移至磨樣袋中，并加入無菌蒸餾水，充分研磨，保留上清液，將上述溶液梯度稀釋，接種到結(jié)晶紫果膠酸瓊脂（Crystal violet pectate，CVP）平板上，28℃孵育2～3 d[5]，用牙簽挑取在CVP 平板上出現(xiàn)的單個(gè)細(xì)菌菌落，并在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上劃線，以獲得純菌落。

圖1 田間馬鈴薯植株黑脛病癥狀Figure 1 Symptoms of blackleg on potato plant from the field

1.2 供試菌株DNA提取

將所分離到的細(xì)菌置于營(yíng)養(yǎng)肉湯（Nutrient broth，NB）培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)16 h，將細(xì)菌懸浮液在12 000 r/min 下離心2 min，使用TaKaRa Mini BEST 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA的提取。

1.3 16S rRNA基因序列分析

使用通用引物8F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGA CTT），對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行16S rRNA 基因擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：Green Mix，12.5 μL，引物各 0.6 μL，模板 1.0 μL，ddH2O 10.3 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃，5 min；98℃，10 s，退火溫度 55℃，5 s，72℃，100 s，29 個(gè)循環(huán)；72℃，5 min。PCR 反應(yīng)使用T100 TM 熱循環(huán)儀（美國(guó)Bio-Rad）完成。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，質(zhì)量良好的PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Sanger 測(cè)序，將獲得序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中己知序列進(jìn)行Blast 比對(duì)，并利用MEGAX[6]軟件，使用最大似然法和Tamura-Nei model進(jìn)行16S系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.4 多位點(diǎn)序列分析

采用多位點(diǎn)序列分析，對(duì)病原菌proA（MT427753-MT427756）、icdA（MT427761-MT427764）、mdh（MT427765-MT427768）、gapA（MT427769-MT427772）[4]、gyrA（MT427757-MT427760）和rpoS（MT427773-MT427776）[7]6個(gè)管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：Prime STAR HS DNA Polymerase（2×），12.5 μL，引物各0.6 μL，模板1.0 μL，ddH2O 10.3 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃，5 min；98℃，10 s，退火溫度59℃，5 s，72℃，1 min，29 個(gè)循環(huán)；72℃，5 min。PCR反應(yīng)使用T100 TM 熱循環(huán)儀（美國(guó)Bio-Rad）完成。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，質(zhì)量良好的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，將獲得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中己知序列進(jìn)行Blast 比對(duì)，并利用MEGAX[6]軟件，使用最大似然法和Tamura-Nei model 進(jìn)行MLSA 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.5 致病性檢測(cè)

1.5.1 植株檢測(cè)

3株分離株菌懸液（106cfu/mL）以莖基部注射方式侵染馬鈴薯品種‘費(fèi)烏瑞它’的幼苗（每株菌侵染5 株植株），以無菌水或營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基作為對(duì)照，幼苗生長(zhǎng)環(huán)境保持在相對(duì)濕度80%、溫度21℃，侵染7 d后拍照記錄[8]。

1.5.2 薯塊檢測(cè)

選用‘Favorita’種薯，切成兩半，3株P(guān).polaris菌株菌懸液（106cfu/mL）離心，棄上清液，沉淀加入無菌蒸餾水中制成混懸液，于馬鈴薯切面的四角及中間部位穿刺并注入100 μL 混懸液，以無菌水為對(duì)照，3 次重復(fù)[9]。接種后處理與對(duì)照分別包裹封口膜，以保持薯塊濕度，于28℃培養(yǎng)2～3 d，觀察發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA基因序列分析

基于16S rRNA基因完整序列，以Dickeyaspp.菌株，以及Erwiniaspp.菌株為外群，將ZRIMU1222、ZRIMU1223 和ZRIMU1224 菌株序列（登錄號(hào)分別為：OP389242、OP389243 和 OP389244）與已發(fā)表的18 株果膠桿菌菌株的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，本研究分離得到的3個(gè)菌株與P.polaris菌株構(gòu)成了明顯的分枝，已發(fā)表的P. atrosepticum、P. brasiliense、P. carotovorum與P. parmentieri株系形成的類群則分別構(gòu)成了獨(dú)立的分枝（圖2）。

圖2 基于3株分離株及其他果膠桿菌屬菌株16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of three strains and other Pectobacterium strains

2.2 多位點(diǎn)序列分析

基于菌株的多位點(diǎn)rpoS-proA-gapA-icdA-gyrA-mdh堿基串聯(lián)序列，用Pectobacteriumspp.及其密切相關(guān)的物種Dickeyaspp.的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果顯示，分離株ZRIMU1222、ZRIMU1223、ZRIMU1224親緣關(guān)系較近，與Pectobacterium polaris其他菌株聚集到一起，同屬一個(gè)分枝；與其他Pectobacteriumspp.，Dickeyaspp.以及Erwiniaspp.親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。由此，可以推斷出分離株ZRIMU1222、ZRIMU1223、ZRIMU1224這3株菌株具有較高的相似性，且均來源于果膠桿菌屬，屬于Pectobacterium polaris。

圖3 基于3株分離株及其他果膠桿菌屬菌株rpoS、proA、gapA、icdA、gyrA和mdh多位點(diǎn)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree based on the multi-locus sequence of rpoS,proA,gapA,icdA,gyrA,and mdh of three strains and other Pectobacterium strains

2.3 致病性檢測(cè)

用 106cfu/mL 的 ZRIMU1222、 ZRIMU1223 和ZRIMU1224 菌液和營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基（對(duì)照）注入馬鈴薯品種‘費(fèi)烏瑞它’的幼苗，結(jié)果顯示注射ZRIMU1222、ZRIMU1223 和 ZRIMU1224 菌液的幼苗均出現(xiàn)癥狀（莖基部腐爛發(fā)黑），而對(duì)照植株無病癥，注射傷口呈愈合狀態(tài)（圖4）。薯塊侵染3 d后，感染Pectobacterium的薯塊均表現(xiàn)出潰爛發(fā)臭的癥狀（圖4），對(duì)照組無病癥，薯肉緊實(shí)無潰爛癥狀。

圖4 基于科赫法則將分離株分別感染‘費(fèi)烏瑞它’幼苗和塊莖Figure 4 'Favorita'seedlings and tubers infected with candidate pathogenic isolates for Koch's postulate test

3 討 論

馬鈴薯黑脛病是一種細(xì)菌性病害，在中國(guó)馬鈴薯產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，可發(fā)生在馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段，通過影響出苗率、幼苗存活率降低產(chǎn)量，造成經(jīng)濟(jì)損失[10]。由于馬鈴薯新品種的更新、檢疫制度不健全及種薯跨區(qū)調(diào)運(yùn)頻繁，使得馬鈴薯黑脛病發(fā)生呈逐年上升趨勢(shì)[11]，新的致病菌逐步走入大眾的視野，Pectobacteriumspp.屬的種和亞種數(shù)量逐漸增加。在癥狀上，幾種致病菌引起的黑脛和軟腐癥狀是類似的，所以單單依靠表型特征和生理生化測(cè)試進(jìn)行相同種或亞種之間的準(zhǔn)確鑒別變得比較困難。DNA標(biāo)記、血清學(xué)[12]、16S rRNA序列[13]以及多位點(diǎn)序列分析[14]，在許多植物病原細(xì)菌致病亞種和致病型區(qū)分方面有較多報(bào)道，是目前較常用的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分類方法。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)，通過對(duì)同源序列進(jìn)行篩選、序列比對(duì)、進(jìn)化樹構(gòu)建、評(píng)估進(jìn)化樹4個(gè)步驟，對(duì)其基因組進(jìn)行分析，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，分離的3 個(gè)Pectobacterium polaris菌株與已發(fā)表的Pectobacterium polaris株系共同形成了明顯的Pectobacterium polaris分枝，且該分枝與其他種（或亞種）形成了不同類群，由此可以推斷這3 株分離物屬于Pectobacterium polaris菌株。后續(xù)致病性檢測(cè)表明，3株分離株均滿足科赫法則，且被侵染的植株維管束病變部位均呈現(xiàn)黑褐色，被侵染的薯塊潰爛發(fā)臭。

目前，青海地區(qū)已檢測(cè)并報(bào)道的病原菌為Pectobacterium atrosepticum[15]，而Pectobacterium polaris病原菌株尚未報(bào)道。近幾年，歐洲國(guó)家，如波蘭[16]、俄羅斯[17]、土耳其[18]等對(duì)于Pectobacterium polaris均有報(bào)道。在中國(guó)，Wang 等[19]在河北，首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了Pectobacterium polaris菌株，Handique等[20]在內(nèi)蒙古自治區(qū)及四川省相繼報(bào)道了該菌株。本研究發(fā)現(xiàn)的3株病原菌Pectobacterium polaris在青海省為首次報(bào)道，期望此研究為后續(xù)致病機(jī)理的研究以及生防菌的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。