• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    首次于青海省發(fā)現(xiàn)Pectobacterium polaris引起馬鈴薯黑脛病

    2022-02-23 08:41:50劉思邈孫清華張鳳軍馬永強(qiáng)馮志文張若芳
    中國(guó)馬鈴薯 2022年6期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)

    劉思邈,孫清華,張鳳軍,馬永強(qiáng),馮志文,張若芳*

    (1.內(nèi)蒙古大學(xué)馬鈴薯工程技術(shù)研究中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021;2.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院,青海 西寧 810016)

    馬鈴薯原產(chǎn)于南美洲安第斯山高山區(qū),由于其塊莖具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,是僅次于水稻和小麥的全球第三大糧食作物[1]。在中國(guó)馬鈴薯種植范圍較為廣泛,覆蓋了東北、華北、西北、西南和華南各地區(qū),種植面積達(dá)4.67×106hm2左右。但隨之而來(lái)的是馬鈴薯病蟲(chóng)害對(duì)其產(chǎn)量的影響日益突出,其中黑脛病為生產(chǎn)上廣泛發(fā)生的病害之一,發(fā)病嚴(yán)重時(shí)田間發(fā)病率可達(dá)50%以上,嚴(yán)重降低了馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì),使種植戶(hù)遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失。

    馬鈴薯黑脛病是一種細(xì)菌性病害,一般是種薯帶菌開(kāi)始腐爛,傳至地下莖,地下莖腐爛后傳至地上莖基部,維管束病變部位呈現(xiàn)黑褐色,植物葉片開(kāi)始萎蔫,莖基部撕裂折斷;后期病菌通過(guò)匍匐莖傳入到新的塊莖中,導(dǎo)致新生塊莖腐爛。馬鈴薯黑脛病病原菌屬于果膠桿菌屬(Pectobacteriumspp.)和狄克氏菌屬(Dickeyaspp.),果膠桿菌科(Pectobacteriaceae),變形菌門(mén)(Proteobacteria)[2],其宿主范圍廣泛,包括馬鈴薯在內(nèi)的其他蔬菜作物以及觀賞植物[3]。其中果膠桿菌屬和狄克氏菌屬分布尤為廣泛,已報(bào)道可以侵染39 個(gè)科的86 種不同植物[4]。在中國(guó),馬鈴薯黑脛病主要致病菌為果膠桿菌屬病原菌。該病原菌分布廣泛,在不同區(qū)域病原群體結(jié)構(gòu)特征可能存在差異。本研究從青海省馬鈴薯產(chǎn)區(qū)病樣組織中分離致病菌,通過(guò)16S rRNA序列、多位點(diǎn)序列分析以及致病性進(jìn)行病原菌的鑒定,比較分析不同菌株的致病力,期望了解不同區(qū)域的主要病原菌種類(lèi),為制定有針對(duì)性的黑脛病有效防控措施提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 分離和純化

    2021年9月,在青海省西寧市(E101.74°,N36.56°)馬鈴薯產(chǎn)區(qū)(調(diào)查面積為30 hm2)發(fā)現(xiàn)疑似黑脛病感染植株(圖1),發(fā)病率為20%左右。從該產(chǎn)區(qū)采集到‘Favorita’疑似病株5 株,分離得到Pectobacteriumspp. 3 株 , 命 名 為 ZRIMU1222、 ZRIMU1223 和ZRIMU1224。將樣品進(jìn)行分離病原菌,首先將受黑脛病感染的植物莖部切下,在75%乙醇中浸泡2 min,用蒸餾水沖洗干凈,移至磨樣袋中,并加入無(wú)菌蒸餾水,充分研磨,保留上清液,將上述溶液梯度稀釋?zhuān)臃N到結(jié)晶紫果膠酸瓊脂(Crystal violet pectate,CVP)平板上,28℃孵育2~3 d[5],用牙簽挑取在CVP 平板上出現(xiàn)的單個(gè)細(xì)菌菌落,并在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上劃線(xiàn),以獲得純菌落。

    圖1 田間馬鈴薯植株黑脛病癥狀Figure 1 Symptoms of blackleg on potato plant from the field

    1.2 供試菌株DNA提取

    將所分離到的細(xì)菌置于營(yíng)養(yǎng)肉湯(Nutrient broth,NB)培養(yǎng)基中,28℃,200 r/min 振蕩培養(yǎng)16 h,將細(xì)菌懸浮液在12 000 r/min 下離心2 min,使用TaKaRa Mini BEST 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA的提取。

    1.3 16S rRNA基因序列分析

    使用通用引物8F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGA CTT),對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行16S rRNA 基因擴(kuò)增,反應(yīng)體系為:Green Mix,12.5 μL,引物各 0.6 μL,模板 1.0 μL,ddH2O 10.3 μL,反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃,5 min;98℃,10 s,退火溫度 55℃,5 s,72℃,100 s,29 個(gè)循環(huán);72℃,5 min。PCR 反應(yīng)使用T100 TM 熱循環(huán)儀(美國(guó)Bio-Rad)完成。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),質(zhì)量良好的PCR 產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行Sanger 測(cè)序,將獲得序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中己知序列進(jìn)行Blast 比對(duì),并利用MEGAX[6]軟件,使用最大似然法和Tamura-Nei model進(jìn)行16S系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

    1.4 多位點(diǎn)序列分析

    采用多位點(diǎn)序列分析,對(duì)病原菌proA(MT427753-MT427756)、icdA(MT427761-MT427764)、mdh(MT427765-MT427768)、gapA(MT427769-MT427772)[4]、gyrA(MT427757-MT427760)和rpoS(MT427773-MT427776)[7]6個(gè)管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為:Prime STAR HS DNA Polymerase(2×),12.5 μL,引物各0.6 μL,模板1.0 μL,ddH2O 10.3 μL,反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃,5 min;98℃,10 s,退火溫度59℃,5 s,72℃,1 min,29 個(gè)循環(huán);72℃,5 min。PCR反應(yīng)使用T100 TM 熱循環(huán)儀(美國(guó)Bio-Rad)完成。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),質(zhì)量良好的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序,將獲得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中己知序列進(jìn)行Blast 比對(duì),并利用MEGAX[6]軟件,使用最大似然法和Tamura-Nei model 進(jìn)行MLSA 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

    1.5 致病性檢測(cè)

    1.5.1 植株檢測(cè)

    3株分離株菌懸液(106cfu/mL)以莖基部注射方式侵染馬鈴薯品種‘費(fèi)烏瑞它’的幼苗(每株菌侵染5 株植株),以無(wú)菌水或營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基作為對(duì)照,幼苗生長(zhǎng)環(huán)境保持在相對(duì)濕度80%、溫度21℃,侵染7 d后拍照記錄[8]。

    1.5.2 薯塊檢測(cè)

    選用‘Favorita’種薯,切成兩半,3株P(guān).polaris菌株菌懸液(106cfu/mL)離心,棄上清液,沉淀加入無(wú)菌蒸餾水中制成混懸液,于馬鈴薯切面的四角及中間部位穿刺并注入100 μL 混懸液,以無(wú)菌水為對(duì)照,3 次重復(fù)[9]。接種后處理與對(duì)照分別包裹封口膜,以保持薯塊濕度,于28℃培養(yǎng)2~3 d,觀察發(fā)病情況。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 16S rRNA基因序列分析

    基于16S rRNA基因完整序列,以Dickeyaspp.菌株,以及Erwiniaspp.菌株為外群,將ZRIMU1222、ZRIMU1223 和ZRIMU1224 菌株序列(登錄號(hào)分別為:OP389242、OP389243 和 OP389244)與已發(fā)表的18 株果膠桿菌菌株的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示,本研究分離得到的3個(gè)菌株與P.polaris菌株構(gòu)成了明顯的分枝,已發(fā)表的P. atrosepticum、P. brasiliense、P. carotovorum與P. parmentieri株系形成的類(lèi)群則分別構(gòu)成了獨(dú)立的分枝(圖2)。

    圖2 基于3株分離株及其他果膠桿菌屬菌株16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of three strains and other Pectobacterium strains

    2.2 多位點(diǎn)序列分析

    基于菌株的多位點(diǎn)rpoS-proA-gapA-icdA-gyrA-mdh堿基串聯(lián)序列,用Pectobacteriumspp.及其密切相關(guān)的物種Dickeyaspp.的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。結(jié)果顯示,分離株ZRIMU1222、ZRIMU1223、ZRIMU1224親緣關(guān)系較近,與Pectobacterium polaris其他菌株聚集到一起,同屬一個(gè)分枝;與其他Pectobacteriumspp.,Dickeyaspp.以及Erwiniaspp.親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。由此,可以推斷出分離株ZRIMU1222、ZRIMU1223、ZRIMU1224這3株菌株具有較高的相似性,且均來(lái)源于果膠桿菌屬,屬于Pectobacterium polaris。

    圖3 基于3株分離株及其他果膠桿菌屬菌株rpoS、proA、gapA、icdA、gyrA和mdh多位點(diǎn)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 3 Phylogenetic tree based on the multi-locus sequence of rpoS,proA,gapA,icdA,gyrA,and mdh of three strains and other Pectobacterium strains

    2.3 致病性檢測(cè)

    用 106cfu/mL 的 ZRIMU1222、 ZRIMU1223 和ZRIMU1224 菌液和營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基(對(duì)照)注入馬鈴薯品種‘費(fèi)烏瑞它’的幼苗,結(jié)果顯示注射ZRIMU1222、ZRIMU1223 和 ZRIMU1224 菌液的幼苗均出現(xiàn)癥狀(莖基部腐爛發(fā)黑),而對(duì)照植株無(wú)病癥,注射傷口呈愈合狀態(tài)(圖4)。薯塊侵染3 d后,感染Pectobacterium的薯塊均表現(xiàn)出潰爛發(fā)臭的癥狀(圖4),對(duì)照組無(wú)病癥,薯肉緊實(shí)無(wú)潰爛癥狀。

    圖4 基于科赫法則將分離株分別感染‘費(fèi)烏瑞它’幼苗和塊莖Figure 4 'Favorita'seedlings and tubers infected with candidate pathogenic isolates for Koch's postulate test

    3 討 論

    馬鈴薯黑脛病是一種細(xì)菌性病害,在中國(guó)馬鈴薯產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴(yán)重,可發(fā)生在馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段,通過(guò)影響出苗率、幼苗存活率降低產(chǎn)量,造成經(jīng)濟(jì)損失[10]。由于馬鈴薯新品種的更新、檢疫制度不健全及種薯跨區(qū)調(diào)運(yùn)頻繁,使得馬鈴薯黑脛病發(fā)生呈逐年上升趨勢(shì)[11],新的致病菌逐步走入大眾的視野,Pectobacteriumspp.屬的種和亞種數(shù)量逐漸增加。在癥狀上,幾種致病菌引起的黑脛和軟腐癥狀是類(lèi)似的,所以單單依靠表型特征和生理生化測(cè)試進(jìn)行相同種或亞種之間的準(zhǔn)確鑒別變得比較困難。DNA標(biāo)記、血清學(xué)[12]、16S rRNA序列[13]以及多位點(diǎn)序列分析[14],在許多植物病原細(xì)菌致病亞種和致病型區(qū)分方面有較多報(bào)道,是目前較常用的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分類(lèi)方法。本研究運(yùn)用生物信息學(xué),通過(guò)對(duì)同源序列進(jìn)行篩選、序列比對(duì)、進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建、評(píng)估進(jìn)化樹(shù)4個(gè)步驟,對(duì)其基因組進(jìn)行分析,所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明,分離的3 個(gè)Pectobacterium polaris菌株與已發(fā)表的Pectobacterium polaris株系共同形成了明顯的Pectobacterium polaris分枝,且該分枝與其他種(或亞種)形成了不同類(lèi)群,由此可以推斷這3 株分離物屬于Pectobacterium polaris菌株。后續(xù)致病性檢測(cè)表明,3株分離株均滿(mǎn)足科赫法則,且被侵染的植株維管束病變部位均呈現(xiàn)黑褐色,被侵染的薯塊潰爛發(fā)臭。

    目前,青海地區(qū)已檢測(cè)并報(bào)道的病原菌為Pectobacterium atrosepticum[15],而Pectobacterium polaris病原菌株尚未報(bào)道。近幾年,歐洲國(guó)家,如波蘭[16]、俄羅斯[17]、土耳其[18]等對(duì)于Pectobacterium polaris均有報(bào)道。在中國(guó),Wang 等[19]在河北,首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了Pectobacterium polaris菌株,Handique等[20]在內(nèi)蒙古自治區(qū)及四川省相繼報(bào)道了該菌株。本研究發(fā)現(xiàn)的3株病原菌Pectobacterium polaris在青海省為首次報(bào)道,期望此研究為后續(xù)致病機(jī)理的研究以及生防菌的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    檢測(cè)
    QC 檢測(cè)
    “不等式”檢測(cè)題
    “一元一次不等式”檢測(cè)題
    “一元一次不等式組”檢測(cè)題
    “幾何圖形”檢測(cè)題
    “角”檢測(cè)題
    “有理數(shù)的乘除法”檢測(cè)題
    “有理數(shù)”檢測(cè)題
    “角”檢測(cè)題
    “幾何圖形”檢測(cè)題
    国产精品女同一区二区软件 | 毛片一级片免费看久久久久 | 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久这里只有精品中国| 国产成年人精品一区二区| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产美女午夜福利| 久久久久久久亚洲中文字幕| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 精品日产1卡2卡| 91在线观看av| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲18禁久久av| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 成年免费大片在线观看| 中国美白少妇内射xxxbb| 中文字幕av成人在线电影| 哪里可以看免费的av片| 亚洲成人久久爱视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产老妇女一区| 亚洲国产精品sss在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 午夜激情福利司机影院| 免费av观看视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| av女优亚洲男人天堂| 亚洲在线观看片| 欧美日韩综合久久久久久 | 久久久久性生活片| 国产伦在线观看视频一区| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 免费看光身美女| 久久人人精品亚洲av| 91久久精品国产一区二区三区| av女优亚洲男人天堂| 日韩大尺度精品在线看网址| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 黄色配什么色好看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 一级黄色大片毛片| 别揉我奶头 嗯啊视频| 免费观看精品视频网站| 伦精品一区二区三区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 在线观看av片永久免费下载| av中文乱码字幕在线| 午夜a级毛片| 十八禁网站免费在线| 中文字幕熟女人妻在线| 免费搜索国产男女视频| 99在线视频只有这里精品首页| 成人鲁丝片一二三区免费| 老女人水多毛片| 欧美高清成人免费视频www| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品一区二区免费观看| 亚洲图色成人| 窝窝影院91人妻| 欧美区成人在线视频| 村上凉子中文字幕在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看| av在线天堂中文字幕| 给我免费播放毛片高清在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产单亲对白刺激| 真实男女啪啪啪动态图| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 精品国产三级普通话版| 久久亚洲精品不卡| 婷婷六月久久综合丁香| 国产亚洲91精品色在线| 中文字幕熟女人妻在线| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美激情在线99| 欧美成人a在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 99热网站在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 日本a在线网址| 很黄的视频免费| 观看免费一级毛片| 亚洲在线自拍视频| 成年版毛片免费区| 欧美日韩黄片免| 日日啪夜夜撸| 香蕉av资源在线| 男女边吃奶边做爰视频| 18禁在线播放成人免费| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 毛片女人毛片| 欧美成人免费av一区二区三区| 赤兔流量卡办理| 动漫黄色视频在线观看| 美女大奶头视频| 亚洲精品色激情综合| 99视频精品全部免费 在线| 窝窝影院91人妻| 麻豆成人av在线观看| 久久精品人妻少妇| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美日韩国产亚洲二区| .国产精品久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 99久久中文字幕三级久久日本| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 人妻久久中文字幕网| 国产激情偷乱视频一区二区| 在线观看66精品国产| 村上凉子中文字幕在线| 88av欧美| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲成a人片在线一区二区| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产乱人伦免费视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产精品爽爽va在线观看网站| 干丝袜人妻中文字幕| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品野战在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 高清毛片免费观看视频网站| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 亚洲av免费在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 欧美激情久久久久久爽电影| 九色成人免费人妻av| 在线免费观看不下载黄p国产 | www.www免费av| 免费观看精品视频网站| 欧美bdsm另类| 俺也久久电影网| 窝窝影院91人妻| 免费看a级黄色片| 成人午夜高清在线视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产精品一区二区性色av| 国国产精品蜜臀av免费| 九九爱精品视频在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 色5月婷婷丁香| 午夜福利欧美成人| 成人av在线播放网站| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品一区二区三区四区久久| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 在线免费观看的www视频| 一进一出抽搐动态| 亚洲,欧美,日韩| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲第一电影网av| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲中文日韩欧美视频| eeuss影院久久| 俺也久久电影网| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 亚洲国产欧洲综合997久久,| 特大巨黑吊av在线直播| 国产高清视频在线播放一区| 毛片一级片免费看久久久久 | 国产91精品成人一区二区三区| 国产成人aa在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 91麻豆精品激情在线观看国产| 可以在线观看的亚洲视频| 免费看光身美女| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲经典国产精华液单| 久久精品综合一区二区三区| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产成人aa在线观看| 国产精品国产高清国产av| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲成人久久爱视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 此物有八面人人有两片| 午夜免费激情av| 久久久久久久久中文| 在线观看一区二区三区| 国产麻豆成人av免费视频| 少妇高潮的动态图| 午夜福利成人在线免费观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 精品一区二区三区人妻视频| netflix在线观看网站| 乱码一卡2卡4卡精品| 成人综合一区亚洲| 国产午夜福利久久久久久| 舔av片在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日韩欧美 国产精品| 深爱激情五月婷婷| 在线播放国产精品三级| 深夜a级毛片| 中国美女看黄片| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 中国美白少妇内射xxxbb| 美女 人体艺术 gogo| 欧美潮喷喷水| 欧美人与善性xxx| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 丰满乱子伦码专区| 免费观看的影片在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产伦在线观看视频一区| 成年女人看的毛片在线观看| 精品久久久久久久久亚洲 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 日韩国内少妇激情av| 无遮挡黄片免费观看| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美色视频一区免费| 日本一本二区三区精品| 熟女电影av网| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 欧美+日韩+精品| 午夜影院日韩av| 日本免费a在线| 成人亚洲精品av一区二区| 成人av一区二区三区在线看| 欧美激情在线99| 赤兔流量卡办理| 国产精品一及| 日本在线视频免费播放| av国产免费在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 在线观看66精品国产| 免费看美女性在线毛片视频| 国产精品电影一区二区三区| 99热只有精品国产| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久精品人妻少妇| 好男人在线观看高清免费视频| 99久久九九国产精品国产免费| a级毛片a级免费在线| 观看免费一级毛片| 精品一区二区免费观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 成人国产一区最新在线观看| 久9热在线精品视频| 看十八女毛片水多多多| 精品免费久久久久久久清纯| 在线观看舔阴道视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产aⅴ精品一区二区三区波| av国产免费在线观看| 无人区码免费观看不卡| 麻豆久久精品国产亚洲av| 性插视频无遮挡在线免费观看| 在线观看舔阴道视频| 欧美精品国产亚洲| 精品久久久久久久久久久久久| 日韩欧美精品v在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 黄色日韩在线| 亚洲国产精品成人综合色| 国产亚洲精品av在线| 天堂√8在线中文| 久久精品国产亚洲av天美| 久久人人精品亚洲av| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美日韩黄片免| 亚洲五月天丁香| 欧美日韩国产亚洲二区| a级毛片a级免费在线| 国内精品久久久久精免费| 国产免费av片在线观看野外av| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲专区中文字幕在线| 国产精品一区www在线观看 | 亚洲成a人片在线一区二区| 国产高潮美女av| 高清毛片免费观看视频网站| 日本成人三级电影网站| 欧美日韩乱码在线| 国产 一区 欧美 日韩| 国产熟女欧美一区二区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产精品一区二区性色av| 69人妻影院| 中文在线观看免费www的网站| 精品一区二区三区人妻视频| 成人午夜高清在线视频| 99精品在免费线老司机午夜| 黄片wwwwww| 亚洲av免费高清在线观看| av专区在线播放| 亚洲专区中文字幕在线| 岛国在线免费视频观看| 国产久久久一区二区三区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚州av有码| 久久99热6这里只有精品| 搞女人的毛片| 婷婷六月久久综合丁香| 一本一本综合久久| 亚洲午夜理论影院| 在线观看一区二区三区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 午夜激情福利司机影院| 在线观看免费视频日本深夜| 一个人免费在线观看电影| 美女高潮的动态| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 热99re8久久精品国产| 小说图片视频综合网站| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲男人的天堂狠狠| 看十八女毛片水多多多| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产淫片久久久久久久久| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| av在线蜜桃| 成年女人永久免费观看视频| 日韩欧美在线二视频| 欧美又色又爽又黄视频| 丝袜美腿在线中文| 91麻豆av在线| 我的老师免费观看完整版| 国产黄色小视频在线观看| av在线老鸭窝| 亚洲图色成人| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 免费一级毛片在线播放高清视频| 在线a可以看的网站| 一a级毛片在线观看| 成人国产一区最新在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 一级黄片播放器| 亚洲午夜理论影院| АⅤ资源中文在线天堂| 美女高潮的动态| 国产毛片a区久久久久| 国产私拍福利视频在线观看| 一级av片app| ponron亚洲| 免费搜索国产男女视频| 久久精品国产亚洲av天美| 搡老岳熟女国产| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产 一区 欧美 日韩| 精品人妻1区二区| 亚洲国产精品成人综合色| netflix在线观看网站| 久久久久久伊人网av| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产精品久久久久久久久免| 国内精品美女久久久久久| 搡老妇女老女人老熟妇| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久久久久久久大av| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久9热在线精品视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 天堂动漫精品| 国产精品三级大全| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲真实伦在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 真实男女啪啪啪动态图| 国产精品久久久久久精品电影| 午夜精品久久久久久毛片777| 一级黄色大片毛片| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲内射少妇av| 级片在线观看| avwww免费| 国产精品伦人一区二区| av在线观看视频网站免费| 精品人妻熟女av久视频| 国产免费一级a男人的天堂| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲性久久影院| 国产一区二区激情短视频| 成人综合一区亚洲| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品一区二区性色av| 午夜福利视频1000在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 天天躁日日操中文字幕| 日本熟妇午夜| 超碰av人人做人人爽久久| 少妇的逼水好多| 国产精品日韩av在线免费观看| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 夜夜爽天天搞| av在线亚洲专区| 九九热线精品视视频播放| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 男女那种视频在线观看| 久久久久久伊人网av| 亚洲第一电影网av| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 男女啪啪激烈高潮av片| 禁无遮挡网站| 免费看光身美女| 精品免费久久久久久久清纯| 成人永久免费在线观看视频| av在线天堂中文字幕| 国产av麻豆久久久久久久| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 午夜影院日韩av| 亚洲四区av| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国内揄拍国产精品人妻在线| 能在线免费观看的黄片| 亚洲色图av天堂| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产v大片淫在线免费观看| 高清日韩中文字幕在线| 午夜激情欧美在线| 精品一区二区三区人妻视频| 一区二区三区免费毛片| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 毛片一级片免费看久久久久 | 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产一区二区激情短视频| 国产 一区 欧美 日韩| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 91精品国产九色| 亚洲乱码一区二区免费版| 人妻久久中文字幕网| 91麻豆精品激情在线观看国产| 免费人成在线观看视频色| 日韩强制内射视频| 国产精品国产高清国产av| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 两人在一起打扑克的视频| 一a级毛片在线观看| 久久人妻av系列| 男女边吃奶边做爰视频| 日本熟妇午夜| 免费观看的影片在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 色av中文字幕| 国产男人的电影天堂91| 成人永久免费在线观看视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 日韩一本色道免费dvd| 最新在线观看一区二区三区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 成人综合一区亚洲| 日本免费a在线| 日本成人三级电影网站| 国产麻豆成人av免费视频| 国产 一区精品| 日本在线视频免费播放| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲,欧美,日韩| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 麻豆久久精品国产亚洲av| 麻豆av噜噜一区二区三区| 精品一区二区免费观看| 午夜视频国产福利| 久久久久久久精品吃奶| 色哟哟哟哟哟哟| 成年免费大片在线观看| 国产精品一及| 中文资源天堂在线| 日韩欧美精品免费久久| 男人舔奶头视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 韩国av一区二区三区四区| 毛片一级片免费看久久久久 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 中文字幕av成人在线电影| 精品日产1卡2卡| 亚洲18禁久久av| 国产午夜精品论理片| 欧美成人一区二区免费高清观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲avbb在线观看| 有码 亚洲区| 日本熟妇午夜| 春色校园在线视频观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美高清性xxxxhd video| 长腿黑丝高跟| 日韩国内少妇激情av| videossex国产| 嫩草影视91久久| 日韩欧美在线二视频| 国产av不卡久久| 韩国av一区二区三区四区| 日韩av在线大香蕉| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| x7x7x7水蜜桃| 色综合亚洲欧美另类图片| 99久久精品一区二区三区| 嫩草影院新地址| 在线观看免费视频日本深夜| 美女 人体艺术 gogo| 最新中文字幕久久久久| 免费一级毛片在线播放高清视频| 免费搜索国产男女视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久精品国产清高在天天线| netflix在线观看网站| 久久久久国内视频| 国产三级在线视频| 久久人妻av系列| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 日日摸夜夜添夜夜添小说| 男女之事视频高清在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品久久久久久久久免| АⅤ资源中文在线天堂| 婷婷亚洲欧美| 欧美xxxx性猛交bbbb| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久久久久久久中文| 97热精品久久久久久| 国产av在哪里看| 乱码一卡2卡4卡精品| 免费大片18禁| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲午夜理论影院| 桃红色精品国产亚洲av| 91av网一区二区| 成人一区二区视频在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 午夜福利在线在线| 国产色爽女视频免费观看| 嫩草影院新地址| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲不卡免费看| 嫩草影院精品99| 欧美三级亚洲精品| 老司机福利观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| .国产精品久久| 99热这里只有是精品在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 日韩国内少妇激情av| 国产淫片久久久久久久久| 国产主播在线观看一区二区| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 少妇高潮的动态图| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产精品一及| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 99精品久久久久人妻精品| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 在线播放无遮挡| 亚洲四区av| 一区福利在线观看| 18+在线观看网站| 亚洲五月天丁香| 午夜影院日韩av| 免费观看精品视频网站| 亚洲精品影视一区二区三区av| 日韩欧美国产一区二区入口| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 校园人妻丝袜中文字幕| 悠悠久久av| 午夜福利成人在线免费观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 在线观看免费视频日本深夜| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 中国美女看黄片| 成人三级黄色视频| 窝窝影院91人妻| 性色avwww在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 淫妇啪啪啪对白视频| 日本a在线网址| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产精品一区二区免费欧美| 丝袜美腿在线中文| 人人妻人人澡欧美一区二区| 99热精品在线国产| 久久久久国内视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 午夜日韩欧美国产| 精品欧美国产一区二区三| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 尾随美女入室|