甲氰菊酯對大鼠格列喹酮口服吸收及腸道緊密連接蛋白表達(dá)的影響

徐 莉，劉 揚，楊 曄，2，3，芮雪琳，李嘉誠，尹登科，2，3

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，安徽合肥 230012；3.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012）

甲氰菊酯（fenpropathrin，F(xiàn)en）是一類具有光穩(wěn)定性的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，其殺蟲譜廣，持效期長，防治效果好，適合在害蟲、害螨并發(fā)時使用，被廣泛應(yīng)用于蔬菜水果等農(nóng)作物及中藥材中防治鱗翅目、同翅目、半翅目、鞘翅目等害蟲及螨蟲［1］，因此農(nóng)產(chǎn)品及中藥材上的農(nóng)藥殘留可能使人類長期處于低劑量暴露狀態(tài)。格列喹酮（gliquidone，Gli），商品名糖適平，是第二代磺酰脲類口服降血糖藥物，與第一代相比，其與磺脲類受體結(jié)合力更強(qiáng)，可促進(jìn)胰腺β細(xì)胞釋放內(nèi)源性胰島素，有效降低血糖［2-3］。Gli腸道吸收快，絕大部分經(jīng)膽汁排泄，尤其適用于腎功能不全的患者［4］。Gli治療應(yīng)用的時間較長，具有所需劑量小、不良反應(yīng)少的優(yōu)點，因此在臨床使用中仍較為穩(wěn)定和廣泛［5］。臨床使用Gli的主要不良反應(yīng)是低血糖，產(chǎn)生這種不良反應(yīng)的原因難以直接判斷，而糖尿病患者血糖變化與Gli血藥濃度密切相關(guān)［6］，所以藥物的相互作用及其他原因造成的Gli血藥濃度增加或蓄積通常被認(rèn)為是其誘發(fā)低血糖的因素之一［3，7-8］。患者在長期使用治療藥物時，除同時使用的其他臨床藥物，機(jī)體內(nèi)蓄積的環(huán)境污染物引起的機(jī)體變化也可能導(dǎo)致藥物吸收異常［9］。Fen的急性毒性已有明確記錄［10-11］，而Fen長期低劑量暴露對Gli的吸收是否產(chǎn)生影響尚不清楚。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織規(guī)定，F(xiàn)en的日容許攝入量（allowable daily intake，ADI）為0.03 mg·kg-1，根據(jù)公式ADI=無可見有害作用水平（no observed adverse effect level，NOAEL）/安全系數(shù)，通常取安全系數(shù)為100，換算出Fen的NOAEL為3 mg·kg-1［12-13］。根據(jù)成人每日臨床劑量（2.5 mg·kg-1）以及人與大鼠間的劑量換算，確定Gil劑量為15 mg·kg-1。本研究觀察Fen 3 mg·kg-1對Gli 15 mg·kg-1在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)及腸道緊密連接蛋白表達(dá)的影響，為Fen暴露對藥物吸收影響提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

Gli標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥98%，批號0830A02）和羧甲纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）（批號116Q022），北京索萊寶科技有限公司；Fen標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥98%，批號20200317），北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；Gli（批號D07F6J1），上海源葉生物科技有限公司。肝素鈉注射液（批號152007040A），常州千紅生化制藥股份有限公司；二氯甲烷（批號20200619），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（批號20110508G103，色譜純）和乙腈（批號20100628G104，色譜純），瑞典Oceanpak公司；兔抗大鼠密封蛋白1（claudin-1）抗體（批號 JJ1210）、兔抗大鼠閉合蛋白（occludin）抗體（批號JJ1210）和Cy3-山羊抗兔IgG抗體（批號KK0406），成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司；兔抗大鼠閉鎖小帶蛋白1（zonula occludens protein-1，ZO-1）抗體（批號 BJ07087592），北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（批號2117D0107）和DAB顯色試劑盒（批號2060A0824），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

Ultimate 3000高效液相色譜，美國賽默飛世爾科技有限公司；Hypersil BDS C18色譜柱，大連依利特公司；220-A型數(shù)顯電熱恒溫干燥箱，上海陽光實驗儀器有限公司；KQ2200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；ZXZ-Z型循環(huán)水式真空泵，河南一恒儀器有限公司。

1.2 動物

健康SD大鼠15只，雌雄不限，SPF級，體重230～270 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（皖）2017-001。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18～26℃,光照12 h，黑暗12 h，自由飲水及飲食。本研究通過安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審批，動物倫理編號為AHUCM-rats-2021043。

1.3 血漿樣品處理及分析

大鼠眼眶靜脈叢取血，分離血漿200 μL，加入二氯甲烷1 mL，渦旋混勻3 min，1600×g離心10 min，吸取有機(jī)層，50℃氮氣吹干后用100 μL流動相復(fù)溶，14 000×g離心15 min，取20 μL上清進(jìn)樣進(jìn)行高效液相色譜分析。色譜條件為：Hypersil BDS C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（65∶35，V∶V）；柱溫：25℃；波長：310 nm；進(jìn)樣量：20 μL；進(jìn)樣時間：10 min；流速：1 mL·min-1。

1.4 樣品分析方法驗證

1.4.1 專屬性

空白大鼠眼眶靜脈叢取血得空白血漿，空白血漿內(nèi)加入0.25 mg·L-1Gli標(biāo)準(zhǔn)品，得含藥標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，大鼠ig給予Gli 15 mg·kg-130 min后眼眶取血得給藥后樣品，將空白血漿、含藥標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品、大鼠給藥后血漿樣品以1.3方法處理進(jìn)樣，考察血漿內(nèi)源性物質(zhì)是否干擾Gli檢測。

1.4.2 殘留效應(yīng)

配置Gli高濃度（10 mg·L-1）以及定量下限（0.25 mg·L-1）標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品。進(jìn)樣高濃度樣品檢測后，進(jìn)空白樣品及定量下限樣品?？瞻讟悠分蠫li的測定信號與定量下限樣品測定信號的比值應(yīng)≤20%。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制含標(biāo)準(zhǔn)品 Gli 0.25，0.5，1.0，2.5，5.0 和10.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，經(jīng)1.3方法處理進(jìn)樣。以峰面積為y，藥物濃度為x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 精密度和準(zhǔn)確度

空白血漿加Gli標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配制成質(zhì)量濃度0.5，2.5和10.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，每濃度設(shè)5個平行樣。按1.3方法處理進(jìn)樣。計算各濃度平行樣品測定結(jié)果的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation，RSD）。樣品重復(fù)測定3 d，計算測定結(jié)果的日間RSD，代表精密度。根據(jù)峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算Gli的濃度，測得濃度與實際濃度之比計算準(zhǔn)確度。

1.4.5 穩(wěn)定性

空白血漿加入Gli標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配制成0.5，2.5和10.0 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，每濃度5個樣品。室溫放置24 h和-20℃放置1周后，按1.3方法處理進(jìn)樣，測定各樣品的實測濃度，計算測定結(jié)果的RSD和相對誤差（relative error，RE）。

1.5 藥動學(xué)測定

取15只SD大鼠隨機(jī)分為玉米油組、Gli組和Fen+Gli組，每組5只。Gli用1%CMC-Na配制為1.5 g·L-1混懸液，F(xiàn)en用玉米油溶解配制為3 g·L-1溶液。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，Gli組ig給予玉米油 1 mL·kg-1，14 d后 ig給予 Gli混懸液10 mL·kg-1；Fen+Gli組 ig 給予 Fen 玉米油溶液14 d后，ig給予Gli混懸液10 mL·kg-1。玉米油組僅ig給予等體積玉米油。大鼠在ig給予Gli前禁食12 h，自由飲水，ig給予 Gli后，分別于 0.25，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，6.0和8.0 h經(jīng)眼眶靜脈叢取血0.5 mL置肝素抗凝管中，離心10 min（900×g）取上清，按1.3方法處理，檢測Gli血藥濃度，繪制血藥濃度-時間曲線圖，并采用DAS 2.0軟件計算藥時曲線下面積（area under the curve，AUC）、清除率（clearance rate，CL）、消除速率常數(shù)（elimination rate constant，Ke）、吸收速率常數(shù)（absorption rate constant，Ka）、半衰期（eliminate half life，t1/2）、達(dá)峰時間（peak time，Tmax）和峰濃度（maximum plasma concentration，Cmax）等藥動學(xué)參數(shù)。

1.6 HE染色法觀察大鼠小腸組織形態(tài)

1.5中Gli組、Fen+Gli組和玉米油組大鼠取血結(jié)束后立即處死，取小腸組織用4%多聚甲醛固定、包埋、切片，切片用染液染色，顯微鏡下觀察大鼠小腸組織形態(tài)。

1.7 免疫組化和免疫熒光法檢測大鼠小腸組織中緊密連接蛋白的表達(dá)

取1.6中Gli組、Fen+Gli組和玉米油組大鼠小腸組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)后PBS溶液沖洗，加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，孵育20 min，PBS溶液沖洗。山羊血清封閉1 h，甩去血清后，滴加兔抗大鼠密封蛋白1抗體（1∶200），4℃孵育過夜，TBST溶液沖洗。滴加適量辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育20 min，TBST溶液沖洗。滴加適量配制好的DAB顯色劑，顯色10 s。自來水沖洗，蘇木精復(fù)染10 s，1%鹽酸分化，溫水返藍(lán)。梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片，倒置顯微鏡下觀察，采集圖片，棕黃色為陽性表達(dá)區(qū)域。同樣取小腸組織切片，脫蠟水化，抗原修復(fù)后，用0.2%TritonX-100通透20 min，過氧化物酶阻斷，山羊血清孵育，滴加兔抗大鼠閉合蛋白和閉鎖小帶蛋白1抗體（1∶200），4℃下孵育過夜，PBST漂洗，滴加Cy3-山羊抗兔IgG抗體（二抗）（1∶300），37℃避光孵育1 h，PBST漂洗，滴加DAPI染細(xì)胞核，室溫避光孵育5 min，PBST漂洗，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光為陽性表達(dá)區(qū)域。采用Image J圖像分析系統(tǒng)分析各組積分吸光度值定量待測蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗證

2.1.1 專屬性

大鼠空白血漿、標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品、大鼠給藥后樣品的色譜見圖1。Gli的保留時間為8.7 min，血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾Gli的檢測。

Fig.1 Chromatograms of gliquidone（Gli）in rat plasma.A：blank plasma；B：standard plasma sample containing Gli 0.25 mg·L-1；C：plasma sample acquired 30 min after being ig given Gli 15 mg·kg-1.

2.1.2 殘留

高濃度標(biāo)準(zhǔn)品血漿樣品（10 mg·L-1）進(jìn)樣后，在空白樣品中的殘留為定量下限的16.72%（＜20%），符合要求。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以Gli的峰面積為y，藥物濃度為x，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.1311x+0.0038，R2=0.9989，表明Gli在0.25～10.0 mg·L-1范圍內(nèi)線性良好，定量下限為0.25 mg·L-1。

2.1.4 精密度和準(zhǔn)確度

Gli定量下限（0.25 mg·L-1）及質(zhì)量濃度（0.5，2.5和10.0 mg·L-1）標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的精密度和準(zhǔn)確度見表1。RSD均＜15%，準(zhǔn)確度85%～115%，滿足生物樣品分析要求。

Tab.1 Precision and accuracy of analysis method for determination gliquidone

2.1.5穩(wěn)定性

Gli高、中、低質(zhì)量濃度（0.5，2.5，10 mg·L-1）的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的穩(wěn)定性見表2。RSD均＜15%，RE為-15%～15%，表明Gli在儲存和分析過程中穩(wěn)定性良好。

Tab.2 Stability of gliquidone in rat standard plasma samples

2.2 Fen對大鼠灌胃Gli藥動學(xué)的影響

大鼠ig給予Gli后的藥時曲線見圖2，相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)見表3。結(jié)果表明，與Gli組大鼠相比，ig給予Fen 14 d后，F(xiàn)en+Gli組AUC0-t由4.0 mg·L-1·h增加到8.3 mg·L-1·h（P＜0.05），Ka由1.0 h-1增加到14.6h-1（P＜0.05），Cmax由1.3 mg·L-1增加到3.8 mg·L-1（P＜0.05），Tmax由2.80 h縮短到0.90 h（P＜0.05）。2組Ke和半衰期均無顯著性差異。

Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of gliquidone in rat plasma.The SD rats were randomly divided into corn oil control group(ig given corn oil only),Gil group and Fen+Gli group.The Fen+Gli group and the Gli group were ig given 3 mg·kg-1of Fen or an equal volume of corn oil for 14 d,then ig given Gli 15 mg·kg-1and blood was taken from the orbital venous plexus at different time points after administration.The plasma concentration of Gli was detected by high performance liquid chromatography.x±s，n=5.

Tab.3 Effect of fenpropathrin on pharmacokinetic parameters of gliquidone

2.3 Fen對大鼠小腸組織形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果（圖3）表明，與Gli組比較，F(xiàn)en+Gli組小腸絨毛頂端出現(xiàn)損傷，固有層與腸上皮細(xì)胞分離，杯狀細(xì)胞減少；Gli組與玉米油組比較無明顯差異。

Fig.3 Effect of fenpropathrin on intestinal morphology and structure by HE staining.See Fig.2 for the rat treatment.Arrows indicate structural damage.

2.4 Fen對大鼠小腸組織緊密連接蛋白表達(dá)的影響

大鼠小腸組織緊密連接蛋白表達(dá)檢測結(jié)果（圖4）顯示，F(xiàn)en+Gli組大鼠小腸組織中密封蛋白1、閉合蛋白和閉鎖小帶蛋白1表達(dá)水平較Gil組均顯著下降（P＜0.05），Gli組與玉米油組比較無顯著差異。

Fig.4 Effect of Fen on protein expressions of claudin-1,occludin and zonula occludens protein-1（ZO-1）in rat intestine by immunohistochemistry.See Fig.2 for the rat treatment.Arrows indicate positive expression.B was the semiquantitative result of A.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with Gil group.

3 討論

本研究結(jié)果表明，F(xiàn)en 3 mg·kg-1長期暴露可影響 Gli藥動學(xué)參數(shù)，增加 Gli的 AUC0-t，AUC0-∞，Ka，Cmax和Tmax，而未影響Gli的Ke和t1/2。由此推測，2組結(jié)果的差異可能主要是由于Fen影響Gli的吸收所致。Fen+Gli組中 Gli的Cmax增加到 3.8 mg·L-1，相當(dāng)于ig給予大鼠Gli 120 mg·kg-1時的血藥濃度，遠(yuǎn)超臨床安全劑量180 mg·d-1換算的大鼠劑量（16 mg·kg-1）［14］。有研究表明，溴氰菊酯暴露誘發(fā)了擔(dān)尼魚（斑馬魚）腸壁黏膜組織細(xì)胞病理改變［15］，Adeyemi等［16］得到了相似結(jié)果，即氯氰菊酯暴露引起魚的組織結(jié)構(gòu)改變，如黏膜層嚴(yán)重糜爛，固有層退化，肌肉層解體。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)en一定程度上損傷了腸道組織屏障，并降低密封蛋白1、閉合蛋白和閉鎖小帶蛋白1這3種緊密連接蛋白的表達(dá)，提示Fen對腸道的損傷可能是導(dǎo)致Gli吸收增加的原因。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的毒性有眾多文獻(xiàn)報道，其對機(jī)體造成損傷的一個重要原因是可誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、肝和腎等器官的氧化損傷［17］。同時，氧化應(yīng)激也會導(dǎo)致腸道線粒體功能障礙，細(xì)胞間緊密連接破壞和腸細(xì)胞凋亡，大規(guī)模腸細(xì)胞凋亡和細(xì)胞間緊密連接中斷也是腸道屏障功能障礙的主要機(jī)制。Fen對腸道屏障的損傷作用是否與Fen誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)，尚需進(jìn)一步實驗驗證。

綜上所述，F(xiàn)en長期暴露增加了Gli的生物利用度和吸收速率，且達(dá)峰時間顯著提前，這可能是由于其促進(jìn)Gli的相關(guān)吸收途徑的作用所致，提示Gli口服吸收的個體差異可能與農(nóng)藥暴露有關(guān)。因此，需注意其臨床使用時的飲食和環(huán)境安全性，以規(guī)避可能導(dǎo)致的低血糖及其他不良反應(yīng)。