正交試驗(yàn)法優(yōu)選瞿麥總黃酮的提取工藝

鄺敏賢，區(qū)展龍，黃友安

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510360

瞿麥?zhǔn)纵d于《神農(nóng)本草經(jīng)》，2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定其來源為石竹科植物瞿麥Dianthus superbusL.或石竹Dianthus chinensisL.的干燥地上部分，味苦，性寒，有通淋利尿、活血通經(jīng)的功效，常用于治療熱淋、血淋、石淋、小便不通等病癥［1］。瞿麥的主要化學(xué)成分有皂苷類、黃酮類、環(huán)肽類、酚酸類、多糖類等，其中黃酮類成分有山柰酚、槲皮素等。黃酮類成分具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生物活性［2-3］。現(xiàn)代藥理研究表明，瞿麥具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化等藥理活性，臨床上具有廣泛療效［2］。瞿麥?zhǔn)轻t(yī)院泌尿外科的常用中藥品種，進(jìn)行臨床處方調(diào)劑時(shí)經(jīng)?？梢增柠溑c萹蓄、車前子等共用。

目前，有關(guān)瞿麥中有效成分的提取工藝研究主要圍繞總生物堿、總酚、總皂苷等，而有關(guān)黃酮類成分的提取工藝研究卻鮮有報(bào)道。2021 年國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布第二批中藥配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，其中瞿麥配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)選擇瞿麥總黃酮作為含量測(cè)定的指標(biāo)。因此，本研究將瞿麥總黃酮提取率作為指標(biāo)，分別對(duì)超聲時(shí)間、乙醇濃度、料液比、超聲提取功率4 個(gè)影響因素分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)選瞿麥黃酮類成分的超聲提取工藝，為瞿麥黃酮類化合物的合理開發(fā)和臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-2600i 型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津儀器有限公司），Milli-Q Direct 型超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck 公司），XP26 型百萬分之一天平、ME204E 型萬分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），HWS-28 型恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），KQ-500DE 型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）。

1.2 試劑與試藥

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-202012，純度：91.6%）購自中國(guó)食品藥品檢定研究院，無水乙醇和三氯化鋁均為分析純。瞿麥藥材產(chǎn)地為河南，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥學(xué)部黃志輝副主任中藥師鑒定為石竹科植物石竹Dianthus chinensisL.的干燥地上部分，符合2020 年版《中國(guó)藥典》一部瞿麥項(xiàng)下要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，置100 mL 量瓶中，加入50%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成蘆丁質(zhì)量濃度為38.618 6 μg/mL 的對(duì)照品貯備液。依次精密量取蘆丁對(duì)照品貯備液0、1、3、5、7、8 mL，置10 mL 量瓶中，加0.1 mol/L的三氯化鋁溶液2 mL，加50%乙醇至刻度，搖勻。在40 ℃水浴中保溫放置20 min，取出，快速冷卻，放置20 min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則0401），在410 nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線［4］。其回歸方程為Y=0.029 3X-0.003 1，r=0.999 9，結(jié)果表明蘆丁在0～30.894 8 μg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.1.2 瞿麥供試品溶液吸光度的測(cè)定取瞿麥藥材（過二號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入100 mL 50%乙醇，密塞，稱定重量，超聲提?。üβ?50 W，頻率40 kHz）1 h，取出，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL 量瓶中，加0.1 mol/L 的三氯化鋁溶液2 mL，加50%乙醇至刻度，搖勻。于40 ℃水浴中保溫20 min，取出，快速冷卻，放置20 min，以未加入0.1 mol/L 的三氯化鋁溶液的瞿麥供試品溶液為空白，照紫外-可見分光光度法（《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則0401），在410 nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度［4］。并根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮濃度（μg/mL），按下式計(jì)算總黃酮提取率：總黃酮提取率（%）=樣品中總黃酮濃度（μg/mL）×稀釋倍數(shù)/106/樣品質(zhì)量（g）×100。

2.1.3 最大吸收波長(zhǎng)的選擇取蘆丁對(duì)照品貯備液適量按“2.1.1”項(xiàng)下操作，在150～700 nm 進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果蘆丁在410 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，因此測(cè)定波長(zhǎng)選定為410 nm。

2.1.4 精密度試驗(yàn)取蘆丁對(duì)照品貯備液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下方法操作并測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定6 次，記錄吸光度。結(jié)果蘆丁吸光度的RSD 為0.86%，表明該儀器的精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取樣品適量，共6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法分別平行制備瞿麥供試品溶液6份，記錄瞿麥供試品溶液在410 nm 下的吸光度。結(jié)果6份瞿麥樣品中蘆丁吸光度的RSD 為1.43%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一份瞿麥供試品溶液適量，分別于0、10、20、30、40、50、60 min 測(cè)定并記錄吸光度。結(jié)果蘆丁吸光度的RSD 為1.32%，表明瞿麥供試品溶液在60 min 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收試驗(yàn)取已知含量的瞿麥樣品適量，精密稱取9 份，每份約0.1 g，置具塞錐形瓶中，分為3 組，每組分別精密加入相當(dāng)于含有量50%、100%、150%的蘆丁對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法分別制備瞿麥供試品溶液，測(cè)定并記錄吸光度。結(jié)果平均回收率為100.48%，RSD 為2.06%，見表1，表明該方法準(zhǔn)確性良好。

表1 總黃酮加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲時(shí)間固定乙醇濃度為50%，料液比為1∶500，提取功率為250 W，分別在超聲時(shí)間為20、30、40、50、60 min 的條件下進(jìn)行超聲提取，考察不同超聲提取時(shí)間對(duì)瞿麥中總黃酮提取率的影響，總黃酮提取率結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，隨著超聲時(shí)間的增加，瞿麥總黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)，由于瞿麥樣品中總黃酮的總量為定值，大部分總黃酮析出后，其含量便不再升高；且延長(zhǎng)提取時(shí)間，可能導(dǎo)致瞿麥中黃酮化合物結(jié)構(gòu)受到破壞。當(dāng)超聲50 min 時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最高，故選擇超聲時(shí)間范圍為40～60 min。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

2.2.2 乙醇濃度固定超聲時(shí)間為60 min，料液比為1∶500，提取功率為250 W，分別在乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%的條件下進(jìn)行超聲提取，考察不同乙醇濃度對(duì)瞿麥總黃酮提取效果的影響，總黃酮提取率結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，隨著乙醇濃度的升高，瞿麥的總黃酮提取率變化較為微弱，呈先上升隨后降低的趨勢(shì)，可能是因?yàn)楦邼舛纫掖家鸺?xì)胞壁鈣化，使總黃酮提取率下降［5］。當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最高但與50%濃度的提取率無明顯區(qū)別，同時(shí)從節(jié)約成本的角度出發(fā)，故后續(xù)試驗(yàn)乙醇濃度固定為50%。

圖2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

2.2.3 料液比固定超聲時(shí)間為60 min，乙醇濃度為50%，提取功率為250 W，分別在料液比為1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶600 的條件下進(jìn)行超聲提取，考察不同料液比對(duì)瞿麥中總黃酮提取效果的影響，總黃酮提取率結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，隨著料液比的增加，瞿麥中總黃酮提取率呈先升高后基本保持不變的趨勢(shì)。由于瞿麥總黃酮總量為一定值，當(dāng)大部分總黃酮均溶出后，隨著料液比的繼續(xù)增加，其含量便不再升高，故總黃酮提取率不再升高［6］。當(dāng)料液比1∶600 時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最大值，故選擇料液比范圍為1∶400～1∶600。

圖3 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

2.2.4 提取功率固定超聲時(shí)間為60 min，乙醇濃度為50%，料液比為1∶500，分別在提取功率為200、250、300、350、400 W 的條件下進(jìn)行超聲提取，考察不同提取功率對(duì)瞿麥中總黃酮提取效果的影響，總黃酮提取率結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，隨著功率的增加，總黃酮提取率呈先上升后降低的趨勢(shì)，可能是因?yàn)楣β蔬^大容易引起溫度升高，總黃酮結(jié)構(gòu)受到影響，且過高的溫度也可能使溶劑加速揮發(fā)，引起總黃酮提取率下降［7］。當(dāng)提取功率為250 W 時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大值，故選擇提取功率范圍為250 W～350 W。

圖4 提取功率對(duì)總黃酮提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)

2.3.1 因素水平設(shè)計(jì)根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以超聲時(shí)間（A）、料液比（B）、提取功率（C）為考察因素，以總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，選定的因素水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平表

2.3.2 結(jié)果分析按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，測(cè)定各試驗(yàn)組總黃酮提取率，并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行直觀分析以及方差分析，試驗(yàn)結(jié)果見表3 及表4。由表3 極差R 值可知，各因素對(duì)總黃酮提取率的影響順序由大到小依次為超聲時(shí)間（A）>料液比（B）>提取功率（C），各因素不同水平影響由大到小分別為A2>A3>A1、B2>B1>B3、C1>C3>C2。由表4 離差平方和可知，各因素對(duì)總黃酮提取率貢獻(xiàn)率順序由大到小依次為超聲時(shí)間（A）>料液比（B）>提取功率（C），與直觀分析結(jié)果一致。其中超聲時(shí)間（A）及料液比（B）對(duì)總黃酮提取率影響顯著（P<0.05），提取功率（C）對(duì)總黃酮提取率影響不顯著（P>0.05）。綜合直觀分析及方差分析結(jié)果，確定采用的最佳提取工藝為A2B2C1，即最佳提取工藝條件為取瞿麥藥材（過二號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入100 mL 50%乙醇，密塞，稱定重量，超聲提?。üβ?50 W，頻率40 kHz）50 min。

表4 方差分析結(jié)果

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)根據(jù)優(yōu)選的提取工藝條件A2B2C1，取瞿麥藥材（過二號(hào)篩）共3 份，每份約0.2 g，精密稱定，進(jìn)行三份平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表5。測(cè)得的瞿麥總黃酮提取率分別為0.288 3%，0.286 6%，0.280 1%，3 次測(cè)定的平均值為0.285 0%，RSD 為1.52%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

3 討論

近年來，黃酮類化合物因具有抗菌、抗炎、抗氧化等藥理活性［8］，其提取工藝、含量測(cè)定、抗氧化活性等相關(guān)研究已逐漸成為研究領(lǐng)域熱點(diǎn)之一。2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）瞿麥項(xiàng)下并無含量測(cè)定項(xiàng)，故本研究將瞿麥總黃酮提取率作為指標(biāo)?？傸S酮含量測(cè)定方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、紫外-可見分光光度法（UV-Vis）等［9-10］。紫外-可見分光光度法設(shè)備要求低、成本相對(duì)低廉、檢測(cè)速度快，故選用紫外-可見分光光度法測(cè)定瞿麥總黃酮提取率。與回流提取方法相比，超聲提取法可借助超聲波的空化效應(yīng)，將植物細(xì)胞壁破壞，促進(jìn)提取溶媒穿透植物細(xì)胞壁，從而達(dá)到較好的提取效果，具有操作簡(jiǎn)便、提取率較高的特點(diǎn)［11］。綜合考慮提取效率及經(jīng)濟(jì)成本，以乙醇作為溶劑，既能達(dá)到較好的提取效果，又具有綠色環(huán)保的特點(diǎn)。

本研究通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)綜合考察，確定瞿麥總黃酮提取的最優(yōu)工藝條件。單因素結(jié)果表明，瞿麥中總黃酮提取率隨著超聲時(shí)間、乙醇濃度、提取功率的升高都有呈先上升后降低的趨勢(shì)，隨著料液比的增加而呈升高后基本保持不變的趨勢(shì)。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)總黃酮提取率影響主次順序?yàn)槌晻r(shí)間＞料液比＞提取功率，同時(shí)總黃酮的最優(yōu)工藝條件為A2B2C1，即乙醇濃度為50%、料液比為1∶500、超聲提取功率為250 W、超聲時(shí)間為50 min。該提取條件下，瞿麥總黃酮提取率均值為0.285 0%，RSD<3%，表明該優(yōu)選工藝的提取效果穩(wěn)定，可為瞿麥總黃酮的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，也為瞿麥總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的數(shù)據(jù)支持。