葛根異黃酮對高尿酸血癥小鼠炎癥、應激反應的影響研究

李桐，朱天麒，方少婷，歐陽軍艷，向惠芳，陳賽珍，王耀霆，姚雨涵，黃春霞

隨著居民飲食習慣的改變，高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）發(fā)病率逐年遞增，已成為臨床常見病、多發(fā)病，受到諸多學者的高度關注，且尋求安全、有效的治療方法對改善患者臨床癥狀非常關鍵。HUA是因嘌呤代謝紊亂而導致的尿酸排泄異常的代謝性疾病，其作為痛風的前期狀態(tài)，不僅會侵犯骨和關節(jié)，而且易累及腎臟和心血管系統(tǒng)，導致肥胖癥、高脂血癥、高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化等慢性病發(fā)生風險增加［1］。當前，臨床主要采用西藥抑制尿酸合成和促進尿酸排泄，諸如丙磺舒、磺吡酮、苯溴馬隆的效果較好，但易導致肝腎功能損傷，極大地限制其臨床應用；尿酸酶可催化尿酸轉化為尿囊素，但其價格高昂而不宜推廣應用。因此，尋找避免HUA患者腎功能損傷的天然藥物具有重要意義［2］。中醫(yī)學對HUA的認識已有數(shù)千年的歷史，朱丹溪《格致余論》：“痛風者，因血受熱……或涉冷水，或立濕地，或扇風取涼，或臥當風……汗?jié)崮凉宰魍?，夜則痛甚，行于陰也”。因此，基于中醫(yī)學相關理論，探究中草藥材或食物組分對疾病的長期影響，可為疾病癥狀、療效改善提供依據［3］；研究還顯示，HUA病情持續(xù)會加速脂類物質沉積到血管壁，引發(fā)炎癥反應，繼而導致血管內皮損傷、應激反應過度，甚至介導細胞因子而影響腎小球內皮細胞的通透性，若能有效抑制內皮細胞炎癥或應激狀態(tài)，或許能對腎臟起到一定的保護作用，而現(xiàn)有研究已證實葛根異黃酮具有明確的降糖、降脂作用［4］?；谏鲜鲅芯勘尘凹袄碚摶A，本研究旨在探究葛根異黃酮對HUA小鼠炎癥、應激反應的影響，以期為其推廣應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2020年12月至2021年6月。

1.2 實驗動物 48只SPF級昆明小鼠（2月齡）由長沙醫(yī)學院動物實驗中心提供（動物許可證SCXK湘2020-110504），雌雄各半，初始體質量30～50 g、平均（36.8±4.2）g，分籠飼養(yǎng)，室內晝夜溫度維持在（25.0±3.0）℃，適應性飼養(yǎng)7 d后開始實驗。本研究獲長沙醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會批準（批準號：CY倫20201102）。

1.3 實驗主要藥品、試劑和儀器

1.3.1 主要藥品 葛根（陜西康盛堂藥業(yè)有限公司生產，產品批號：20140506），羧甲基纖維素鈉（天津市恒興化學試劑制造有限公司生產，產品批號：20110728），鹽酸乙胺丁醇（杭州民生藥業(yè)集團有限公司生產，產品批號：20110547），非布司溶液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司生產，產品批號：20144060）。

1.3.2 主要試劑配制 （1）葛根異黃酮提取和純化：①粉碎：葛根用蒸餾水多次沖洗，隨后用恒溫干燥箱于60 ℃烘干至恒重，用料理機粉碎，80目過篩待用；②脫脂：用石油醚對藥材進行脫脂處理，再用70%乙醇加熱回流提取2 h（投料比為1∶8），趁熱過濾，棄去藥渣，用旋轉蒸發(fā)儀回收乙醇，濃縮至無醇味，用LS-46D大孔樹脂純化；③提?。河靡掖冀莞鸶筮M行漉液提取，將濾液濃縮成稠膏狀，真空干燥后得到干浸膏；④純化：用樹脂法進行純化（采用AB-8大孔吸附樹脂串聯(lián)柱，洗脫劑乙醇體積分數(shù)為70%，工作液流速28 V/h，浸提濃縮液pH=5）。（2）造模試劑的配制：稱取4 000 mg腺嘌呤和40片鹽酸乙胺丁醇（研成粉末狀），先用少量的0.5%鹽酸乙胺丁醇溶解，然后再定容到400 ml，此時腺嘌呤濃度為100 mg/kg、鹽酸乙胺丁醇濃度為250 mg/kg，混勻待用［5］。（3）0.5%羧甲基纖維素鈉的配制：稱取羧甲基纖維素鈉4 g，而后用蒸餾水配成800 ml。

1.3.3 主要儀器 電子分析天平（奧豪斯公司），TG-16W型高速離心機（長沙湘銳離心機有限公司），BK-400型全自動生化分析儀（濟南好來寶醫(yī)療器材有限公司），DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司），JJ-12J型脫水機（武漢俊杰電子有限公司），RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司），DS-U3型正置光學顯微鏡成像系統(tǒng)（日本尼康公司）。

1.4 實驗分組和干預方法 采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為正常組、模型組、條件對照組、實驗組，各12只。正常組小鼠每天灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉（給藥劑量1 ml/20 g體質量）；其余三組小鼠每天灌胃等體積造模試劑制備HUA模型［6］，共計30 d。造模成功后正常組小鼠繼續(xù)用混合飼料飼養(yǎng)，不予其他藥物；模型組小鼠繼續(xù)灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉（給藥劑量1 ml/10 g體質量），不予其他藥物；條件對照組小鼠繼續(xù)灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉（給藥劑量1 ml/20 g體質量），同時灌胃非布司溶液（給藥劑量20 mg/d）；實驗組小鼠繼續(xù)灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉（給藥劑量1 ml/20 g體質量），同時灌胃葛根異黃酮（給藥劑量20 mg/d）；四組干預時間均為30 d。

1.5 觀察指標 （1）分別于干預前和干預后（30 d后）取小鼠空腹狀態(tài)下尾部靜脈血，3 500 r/min離心15 min（離心半徑13.5 cm），檢測血清尿酸（uric acid，UA）、炎癥指標〔包括P物質（substance P，SP）、紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白介素6（interleukin 6，IL-6）〕、應激反應指標〔包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）〕。（2）干預結束后處死小鼠，取主動脈弓，置于甲醛溶液中固定，采用蒸餾水反復漂洗，用超薄切片機制作薄切片，用伊紅染色液或蘇木素染液進行染色處理，顯微鏡觀察主動脈弓內皮細胞病理學特征。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料經K-S檢驗均符合正態(tài)分布且方差齊，以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，組內干預前后比較采用配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四組小鼠干預前后血清UA比較 干預前，四組小鼠血清UA比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；干預后，四組小鼠血清UA比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。干預后，模型組、條件對照組、實驗組小鼠血清UA高于正常組，條件對照組、實驗組小鼠血清UA低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組、條件對照組、實驗組小鼠干預后血清UA分別高于本組干預前，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 四組小鼠干預前后血清UA比較（±s，n=12，μmol/L）Table 1 Comparison of serum UA in four groups before and after intervention

表1 四組小鼠干預前后血清UA比較（±s，n=12，μmol/L）Table 1 Comparison of serum UA in four groups before and after intervention

注：a表示與正常組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05；c表示與本組干預前比較，P＜0.05

組別 干預前 干預后正常組 161.0±16.8 157.5±14.7模型組 155.2±16.1 215.1±11.6ac條件對照組 153.4±15.7 180.2±12.3abc實驗組 154.7±13.9 173.3±17.2abc F值 0.556 35.246 P值 0.647 ＜0.001

2.2 四組小鼠干預前后血清炎癥指標比較 干預前，四組小鼠血清SP、ESR、CRP、TNF-α、IL-6比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；干預后，四組小鼠血清SP、ESR、CRP、TNF-α比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；干預后，四組小鼠血清IL-6比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。干預后，模型組、條件對照組、實驗組小鼠血清SP、ESR、CRP、TNF-α高于正常組，條件對照組、實驗組小鼠血清SP、ESR、CRP、TNF-α低于模型組，實驗組小鼠血清SP、ESR、CRP低于條件對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組、條件對照組、實驗組小鼠干預后血清SP、ESR、CRP、TNF-α分別高于本組干預前，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 四組小鼠干預前后血清炎癥指標比較（±s，n=12）Table 2 Comparison of serum inflammatory indexes in four groups before and after intervention

表2 四組小鼠干預前后血清炎癥指標比較（±s，n=12）Table 2 Comparison of serum inflammatory indexes in four groups before and after intervention

注：a表示與正常組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05；c表示與條件對照組比較，P＜0.05；d表示與本組干預前比較，P＜0.05；P物質=SP，ESR=紅細胞沉降率，CRP=C反應蛋白，TNF-α=腫瘤壞死因子α，IL-6=白介素6

組別 SP（pg/ml） ESR（mm/1 h） CRP（μg/ml） TNF-α（pg/ml） IL-6（pg/ml）干預前 干預后 干預前 干預后 干預前 干預后 干預前 干預后 干預前 干預后正常組 72.6±4.6 72.0±3.5 28.3±3.4 28.5±4.4 20.0±4.1 20.5±4.5 25.3±3.3 25.0±4.4 126.2±12.7 127.0±13.5模型組 73.0±6.6 102.4±8.4ad 27.9±5.5 44.2±4.4ad 20.7±3.3 49.7±5.7ad 25.2±2.1 36.7±1.5ad 125.6±11.3 127.4±13.6條件對照組 73.0±7.2 88.5±6.3abd 28.7±4.1 36.2±4.0abd 21.1±4.5 40.2±4.8abd 24.9±3.6 30.0±3.4abd 126.2±10.7 128.4±10.8實驗組 72.6±5.3 79.7±2.5abcd 28.5±5.1 32.5±2.1abcd 21.0±4.1 25.6±3.0abcd 25.0±3.6 28.0±2.6abd 125.7±4.2 126.0±3.3 F值 0.018 63.430 0.066 36.283 0.183 101.484 0.039 29.599 0.018 0.085 P值 0.997 ＜0.001 0.978 ＜0.001 0.908 ＜0.001 0.990 ＜0.001 0.997 0.962

2.3 四組小鼠干預前后血清應激反應指標比較 干預前，四組小鼠血清SOD、GSH-Px、MDA、NO、NOS比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；干預后，四組小鼠血清SOD、GSH-Px、MDA比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；干預后，四組小鼠血清NO、NOS比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。干預后，模型組、條件對照組、實驗組小鼠血清SOD高于正常組，血清GSH-Px低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；干預后，模型組、條件對照組小鼠血清MDA高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；干預后，條件對照組、實驗組小鼠血清SOD、MDA低于模型組，血清GSH-Px高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；干預后，實驗組小鼠血清SOD、MDA低于條件對照組，血清GSH-Px高于條件對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組、條件對照組、實驗組小鼠干預后血清SOD、MDA分別高于本組干預前，血清GSH-Px分別低于本組干預前，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 四組小鼠干預前后血清應激反應指標比較（±s，n=12）Table 3 Comparison of serum stress response indexes in four groups before and after intervention

表3 四組小鼠干預前后血清應激反應指標比較（±s，n=12）Table 3 Comparison of serum stress response indexes in four groups before and after intervention

注：a表示與正常組比較，P＜0.05；b表示與模型組比較，P＜0.05；c表示與條件對照組比較，P＜0.05；d表示與本組干預前比較，P＜0.05；SOD=超氧化物歧化酶，GSH-Px=谷胱甘肽過氧化物酶，MDA=丙二醛，NO=一氧化氮，NOS=一氧化氮合酶

組別 SOD（U/ml） GSH-Px（mg/L） MDA（μmol/L） NO（μmol/ml） NOS（mol/L）干預前 干預后 干預前 干預后 干預前 干預后 干預前 干預后 干預前 干預后正常組 68.3±7.4 69.3±8.3 205.3±12.8 207.2±11.3 1.69±0.25 1.72±0.51 43.7±6.3 44.8±5.7 13.6±4.5 14.0±6.2模型組 69.1±6.7 136.5±9.3ad 206.0±10.7 127.6±15.0ad 1.73±0.29 3.03±0.17ad 45.0±7.3 44.9±6.4 14.2±5.5 13.9±4.7條件對照組 67.2±8.3 118.3±9.5abd 204.9±14.5 147.8±12.8abd 1.58±0.43 2.42±0.26abd 43.8±7.0 45.2±4.8 14.0±3.6 14.2±4.2實驗組 71.5±8.4 89.6±9.0abcd 207.1±15.8 160.1±12.6abcd 1.65±0.39 1.99±0.25bcd 45.2±5.8 44.4±5.1 14.4±3.5 13.9±4.9 F值 0.668 130.833 0.060 453.547 0.406 37.391 0.168 0.043 0.074 0.010 P值 0.576 ＜0.001 0.980 ＜0.001 0.749 ＜0.001 0.917 0.988 0.974 0.999

2.4 四組小鼠干預后主動脈弓內皮細胞病理學特征正常組小鼠主動脈弓內皮細胞排列規(guī)則，結構清晰，無壞死區(qū)域，無明顯裂縫。模型組小鼠主動脈弓內皮細胞有明顯水樣變性，胞質以及細胞核有輕微腫脹，部分區(qū)域有淋巴細胞聚集和炎癥細胞浸潤。條件對照組和實驗組小鼠主動脈弓部分內皮細胞有雙核，為增生表現(xiàn)，水樣變形不明顯；此外，條件對照組仍有少量炎癥細胞浸潤表現(xiàn)，實驗組小鼠內皮細胞恢復情況較好，細胞形態(tài)比較完整，少見空洞、排列緊密，見圖1。

圖1 四組小鼠干預后主動脈弓內皮細胞病理學特征（HE染色，×40）Figure 1 Pathological characteristics of aortic arch endothelial cells in four groups of mice after intervention

3 討論

眾所周知，HUA可引發(fā)心血管疾病，其機制主要為血液中持續(xù)高水平尿酸激活了人體的腎素-血管緊張素系統(tǒng)，微觀層面引發(fā)平滑肌細胞增殖，同時促進血小板黏附作用加強，使血栓形成風險增加，進而加速動脈粥樣硬化形成［7］。近年隨著對HUA的深入研究，HUA的治療藥物也呈現(xiàn)多樣化趨勢，嘌呤類似物及非甾體類、糖皮質激素類、秋水仙堿類藥物對其治療效果明顯，但不良反應較多［8］，因此研發(fā)新型、高效、安全的HUA治療藥物仍為諸多學者的重點研究方向。黃酮是臨床研究較為廣泛且富含于眾多中藥材中的化學物質，根據三碳鏈的氧化程度、B環(huán)連接的位置及三碳是否成環(huán)，黃酮類化合物可分為黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、異黃酮等銜生物［9］。葛根是從豆科植物野葛或干葛藤的根中提取的一種異黃酮類化合物，具有提高免疫力、擴血管、降壓等藥理作用。現(xiàn)有研究表明，葛根可通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性而減少UA的生成，但關于其對內皮細胞影響的研究甚少［10］。能否緩解內皮細胞炎癥或應激狀態(tài)，繼而增加機體清除氧自由基的能力，甚至通過減少脂質過氧化來降低UA，是近年來異黃酮類化合物藥理機制的研究熱點。葛根是富含異黃酮類化合物的古老中藥材，本實驗前期準備期間對原材料葛根進行了成分提取和純化，顯示葛根包含葛根素、羥基葛根素、甲氧基葛根素、葛根素-木糖苷、大豆苷元、大豆苷等組分，其中異黃酮含量較多，因此從葛根中提取異黃酮有一定實用及經濟價值［11］。

本實驗結果顯示，干預后，模型組血清UA、SP、ESR、CRP、TNF-α、SOD、MDA高于正常組，血清GSH-Px低于正常組，說明HUA小鼠血管內皮細胞普遍存在異常炎癥、應激反應，也客觀說明本實驗使用的造模方法可行，HUA的發(fā)生會對小鼠體內炎癥或應激狀態(tài)造成明顯影響。原因在于血液中高水平UA會誘發(fā)胰腺β細胞功能障礙，繼而導致晶體沉積于組織、關節(jié)，若嘌呤代謝持續(xù)紊亂或UA排泄障礙，則會引發(fā)急性特征性關節(jié)炎或相關腎臟疾病［12］。本實驗結果還顯示，條件對照組、實驗組小鼠干預后血清UA、SP、ESR、CRP、TNF-α、SOD、MDA分別高于本組干預前，血清GSH-Px分別低于本組干預前，說明羧甲基纖維素鈉聯(lián)合非布司溶液、羧甲基纖維素鈉聯(lián)合葛根異黃酮均可在一定程度上降低HUA小鼠血清UA，并有效緩解體內炎癥或應激反應。HUA小鼠發(fā)病時，基本病理特征表現(xiàn)為飽和狀態(tài)的UA持續(xù)沉積于腎小管，持續(xù)刺激局部并引起淋巴細胞、單核細胞及漿細胞浸潤［13］。TNF-α作為影響多種病理生理過程的重要炎癥因子，兼有激活單核細胞和巨噬細胞、抗腫瘤的作用，其水平升高與實驗組小鼠應用葛根異黃酮后組織局部抗炎作用有關［14-15］。但本實驗尚未對小鼠腎臟進行病理學觀察，非布司溶液和葛根異黃酮能否對腎小管功能產生長遠的積極影響尚不得知。此外，本實驗結果顯示，干預后，實驗組小鼠血清SP、ESR、CRP、SOD、MDA低于條件對照組，血清GSH-Px高于條件對照組，提示非布司溶液的治療效果不及葛根異黃酮，這主要與HUA疾病進展過程的特殊性有關。HUA會嚴重損傷模型小鼠的腎功能，長期使用非布司溶液雖然會在一定程度上減輕病灶局部應激程度，但亦會進行性加重小鼠腎臟負擔，而葛根異黃酮主要通過影響黃嘌呤氧化還原酶活性而改善HUA病情，持久使用亦不會對小鼠腎臟產生過重的額外負擔［16-17］。有研究顯示，葛根異黃酮可通過調節(jié)嘌呤核苷酸代謝來有效促進UA排泄，從而極大程度地減少UA對動脈血管的刺激或破壞作用［18］。因此，葛根異黃酮發(fā)揮HUA治療作用不局限于控制UA的產生途徑，還通過改善心血管功能來促進UA的排泄，并最終促進HUA病情轉歸［19-20］，這為其藥理機制研究、藥效開發(fā)應用奠定了一定基礎。本實驗結果還顯示，條件對照組和實驗組小鼠主動脈弓部分內皮細胞有雙核，說明經過非布司溶液或葛根異黃酮治療后，HUA小鼠病灶局部有明顯的細胞增殖現(xiàn)象；實驗組小鼠內皮細胞恢復情況較好，細胞形態(tài)比較完整，進一步說明葛根異黃酮可更有效地改善HUA小鼠的心血管功能。

綜上所述，與非布司溶液相比，葛根異黃酮可更有效地減輕HUA小鼠的病情嚴重程度，同時減輕炎癥和應激反應，改善心血管功能。但本研究僅闡釋了葛根異黃酮對HUA小鼠血清炎癥、應激反應指標的影響，尚未深入探究其影響血管內皮細胞炎癥和應激反應的具體信號通路，因此無法從代謝組學角度透徹地闡述葛根異黃酮治療HUA的機制，尚需后續(xù)研究進一步探索。

作者貢獻：李桐、朱天麒進行文章的構思與設計、數(shù)據整理，撰寫論文；李桐進行研究的實施與可行性分析；朱天麒、方少婷進行數(shù)據收集；歐陽軍艷、向惠芳進行統(tǒng)計學處理；李桐、歐陽軍艷、向惠芳、陳賽珍進行結果的分析與解釋；李桐、朱天麒、王耀霆、姚雨涵、黃春霞進行論文的修訂；黃春霞負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。