異鼠李素通過抑制泡沫細胞形成增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的機制研究

王婷婷，李妍，張明明，蔣國健，郭文怡，張東偉

冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成被認為是導致急性心血管事件的重要原因［1］。巨噬細胞脂質(zhì)代謝異常進而演變成泡沫細胞并在內(nèi)皮下不斷聚集是動脈粥樣硬化斑塊起始和發(fā)展的關(guān)鍵。研究表明，泡沫細胞是巨噬細胞中脂質(zhì)代謝失調(diào)形成的，當巨噬細胞中積累大量的脂質(zhì)時會導致脂滴的形成，而脂滴作為一種特殊的細胞器，將導致巨噬細胞呈泡沫狀［2］。大量泡沫細胞的不斷聚集將導致斑塊中新生血管形成、大量脂質(zhì)池和壞死核心的形成，最終導致斑塊不穩(wěn)定。因此，探討動脈粥樣硬化斑塊形成過程中泡沫細胞形成的機制，并制定通過減少泡沫細胞形成、減小斑塊中脂質(zhì)核心面積來增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的治療策略，對減少急性心血管事件的發(fā)生具有重要意義。

異鼠李素是一種可從銀杏、沙棘及大量花、果實和葉中提取的黃酮類化合物，已有研究發(fā)現(xiàn)其具有抗血小板聚集、擴張冠狀動脈、降血脂的藥理作用［3］，其作用機制可能是由于異鼠李素能夠抑制促炎因子的釋放，從而抑制動脈粥樣硬化病程進展［4］。但異鼠李素是否可通過減少巨噬細胞中脂滴數(shù)目、抑制泡沫細胞形成、減少泡沫細胞的浸潤、減小動脈粥樣硬化斑塊中的脂質(zhì)核心面積，最終增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性，目前尚不得知。本研究在前期研究［1-4］基礎(chǔ)上，通過高脂飲食和氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）干預分別構(gòu)建動脈粥樣硬化動物模型和細胞模型，探索異鼠李素是否可以通過改善巨噬細胞脂質(zhì)代謝、抑制泡沫細胞形成，進而增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性，并進一步探尋其具體分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2020年8月至2021年10月。

1.2 實驗材料

1.2.1 實驗動物 體質(zhì)量為25～30 g的6～8周雄性C57BL小鼠10只，購自空軍軍醫(yī)大學動物中心；體質(zhì)量為25～30 g的6～8周雄性ApoE-/-小鼠20只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。所有小鼠飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學動物中心，SPF級環(huán)境，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在18～29 ℃，相對濕度控制在40%～70%。構(gòu)建動脈粥樣硬化模型所需要的高脂飼料成分包括15%脂肪、1.25%膽固醇、0.2%膽酸鹽。

1.2.2 實驗細胞 RAW 264.7巨噬細胞，購自美國ATCC公司。

1.2.3 主要實驗試劑與儀器 異鼠李素（批號：MED80003，純度≥98%）購自湖南康都制藥有限公司，ox-LDL購自廣州益源生物科技有限公司，SIRT6抗體（貨號：#8864S）、GAPDH抗體（貨號：#8864S）購自美國CST公司，CD68（1∶100；型號Ab955；Abcam公司），熒光二抗（兔抗鼠，1∶100稀釋；Abcam公司），二抗（山羊抗兔）購自西安壯志生物科技有限公司，BODIPY 493/503染料（批號：GC42959，純度≥98%）購自美國GlpBio公司，小鼠麻醉用異氟烷購自河北一品制藥股份有限公司，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司，Ad-sh-SIRT6腺病毒購自上海漢恒生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物實驗

1.3.1.1 實驗動物分組及干預方法 將10只雄性C57BL小鼠作為空白對照組；將20只ApoE-/-小鼠隨機分為動脈粥樣硬化組和動脈粥樣硬化+異鼠李素組，每組10只。參考文獻［5］，采用高脂飼料喂養(yǎng)動脈粥樣硬化組和動脈粥樣硬化+異鼠李素組小鼠16周以構(gòu)建動脈粥樣硬化小鼠模型。其中動脈粥樣硬化+異鼠李素組小鼠于高脂飼料喂養(yǎng)第9周開始給予異鼠李素，腹腔注射，20 mg?kg-1?d-1，連續(xù)給藥8周［6］。持續(xù)監(jiān)測各組小鼠血脂指標，16周后用異氟烷麻醉并處死各組小鼠，分離小鼠主動脈，通過油紅O染色發(fā)現(xiàn)小鼠動脈管腔內(nèi)形成了動脈粥樣硬化斑塊，視為造模成功。

1.3.1.2 油紅O染色檢測小鼠動脈粥樣硬化斑塊中脂質(zhì)核心面積百分比 干預16周后，采用異氟烷麻醉并處死各組小鼠，分離小鼠主動脈，取出動脈粥樣硬化斑塊組織，送病理科進行包埋后制作冰凍切片，取出冰凍切片，置于常溫磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中進行復溫，干燥10 min后置于新鮮油紅O染色液中孵育10～15 min；在75%乙醇溶液中分化2～3 s，清水中洗1 min。將切片放置在Harris蘇木素中復染1～2 min，流水下沖洗，使用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，流水下沖洗，使用氨水返藍，流水下沖洗；用蓋玻片封固后利用顯微鏡通過Image J軟件分析小鼠動脈粥樣硬化斑塊中脂質(zhì)核心面積與管腔總橫截面積，計算小鼠動脈粥樣硬化斑塊中脂質(zhì)核心面積百分比［5］。

1.3.1.3 免疫熒光染色檢測小鼠動脈粥樣硬化斑塊中泡沫細胞所占比例 取動脈粥樣硬化斑塊組織，置于多聚甲醛中固定，采用石蠟包埋并切片（3～5 mm），抗原修復，山羊血清封閉60 min。加一抗CD68，在4 ℃冰箱中孵育過夜，然后加Flour-Cy3標記的熒光二抗均勻覆蓋組織，避光，在濕盒中孵育60 min。PBS輕柔洗滌后用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）復染細胞核，甘油封固后在激光共聚焦顯微鏡下觀察動脈粥樣硬化斑塊中CD68（泡沫細胞標志物）陽性細胞所占比例，即泡沫細胞所占比例。

1.3.2 細胞實驗

1.3.2.1 細胞培養(yǎng) 將RAW 264.7巨噬細胞置于含15%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為消毒滅菌細胞孵箱（37 ℃，含5% CO2，濕度95%），24 h后觀察貼壁細胞情況，培養(yǎng)基渾濁后及時更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3.2.2 Western blotting法檢測巨噬細胞中SIRT6表達水平 取對數(shù)生長期的巨噬細胞，將其分為空白對照組（不進行干預）、ox-LDL干預組（采用50 g/ml的ox-LDL干預24 h以體外誘導泡沫細胞形成）、ox-LDL+異鼠李素干預組（采用20 μmol/L的異鼠李素孵育8 h［6］，之后采用50 g/ml的ox-LDL干預24 h以體外誘導泡沫細胞形成）。用PBS洗滌各組巨噬細胞并充分消化，提取蛋白后按照操作流程進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。提前按1∶100配好SIRT6、GAPDH抗體；脫脂奶粉封閉后于4 ℃冰箱中過夜進行一抗孵育，滴加山羊抗兔IgG抗體孵育1 h，采用化學發(fā)光法利用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)檢測各組巨噬細胞中SIRT6表達水平。實驗獨立重復3次。

1.3.2.3 BODIPY 493/503染色檢測巨噬細胞中脂滴數(shù)目取對數(shù)生長期的巨噬細胞，將其分為空白對照組（不進行干預）、ox-LDL組（采用50 g/ml的ox-LDL干預24 h以體外誘導泡沫細胞形成）、ox-LDL+異鼠李素組（采用20 μmol/L 異鼠李素孵育8 h［6］，之后采用50 g/ml的ox-LDL干預24 h以體外誘導泡沫細胞形成）、ox-LDL+異鼠李素+Ad-sh-SIRT6組〔采用20 μmol/L異鼠李素孵育8 h［6］，轉(zhuǎn)染Ad-sh-SIRT6腺病毒以干擾SIRT6的表達，病毒感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值是100∶1，12 h后用50 g/ml的ox-LDL干預24 h以體外模擬動脈粥樣硬化狀態(tài)〕。室溫下用提前配置好的10 μg/ml BODIPY 493/503染料對各組巨噬細胞進行染色，1 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察巨噬細胞中脂滴數(shù)目。實驗獨立重復3次。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism 5.01進行統(tǒng)計分析。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 空白對照組、動脈粥樣硬化組、動脈粥樣硬化+異鼠李素組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中脂質(zhì)核心面積百分比比較 空白對照組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中脂質(zhì)核心面積百分比為0。動脈粥樣硬化+異鼠李素組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中脂質(zhì)核心面積百分比為（20.3±1.8）%，低于動脈粥樣硬化組的（40.1±2.7）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=19.30，P＜0.001），見圖1。

圖1 油紅O染色檢測空白對照組、動脈粥樣硬化組、動脈粥樣硬化+異鼠李素組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中脂質(zhì)核心面積百分比Figure 1 Percentage of lipid core area detected by oil red O staining in atherosclerotic plaque of blank control group，atherosclerosis group and atherosclerosis+isorhamnetin group

2.2 空白對照組、動脈粥樣硬化組、動脈粥樣硬化+異鼠李素組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中泡沫細胞所占比例比較 空白對照組、動脈粥樣硬化組、動脈粥樣硬化+異鼠李素組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中泡沫細胞所占比例分別為0、（9.31±0.08）%、（4.04±0.38）%。動脈粥樣硬化組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中泡沫細胞所占比例高于動脈粥樣硬化+異鼠李素組，差異有統(tǒng)計學意義（t=42.92，P＜0.001），見圖2。

圖2 免疫熒光染色檢測空白對照組、動脈粥樣硬化組、動脈粥樣硬化+異鼠李素組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中泡沫細胞所占比例Figure 2 Proportion of foam cells in atherosclerotic plaques of mice detected by immunofluorescence staining in blank control group，atherosclerosis group and atherosclerosis+isorhamnetin group

2.3 空白對照組、ox-LDL干預組、ox-LDL+異鼠李素干預組巨噬細胞中SIRT6表達水平比較 空白對照組、ox-LDL干預組、ox-LDL+異鼠李素干預組巨噬細胞中SIRT6表達水平分別為（1.00±0）、（0.31±0.07）、（0.61±0.06）?？瞻讓φ战M、ox-LDL干預組、ox-LDL+異鼠李素干預組巨噬細胞中SIRT6表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=326.50，P＜0.001）；ox-LDL干預組、ox-LDL+異鼠李素干預組巨噬細胞中SIRT6表達水平低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t值分別為25.36、15.79，P值均＜0.001）；ox-LDL+異鼠李素干預組巨噬細胞中SIRT6表達水平高于ox-LDL干預組，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.29，P＜0.001），見圖3。

圖3 Western blotting法檢測空白對照組、ox-LDL干預組、ox-LDL+異鼠李素干預組巨噬細胞中SIRT6表達水平的SDS-PAGE圖Figure 3 SDS-PAGE graph of SIRT6 expression level in macrophages detected by Western blotting method in blank control group，ox-LDL intervention group and ox-LDL+isorhamnetin intervention group

2.4 空白對照組、ox-LDL組、ox-LDL+異鼠李素組、ox-LDL+異鼠李素+Ad-sh-SIRT6組巨噬細胞中脂滴數(shù)目比較 空白對照組、ox-LDL組、ox-LDL+異鼠李素組、ox-LDL+異鼠李素+Ad-sh-SIRT6組巨噬細胞中脂滴數(shù)目分別為（3.00±0.27）、（18.00±1.61）、（9.00±0.80）、（35.00±3.13）。四組巨噬細胞中脂滴數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=593.00，P＜0.001）；ox-LDL組、ox-LDL+異鼠李素組、ox-LDL+異鼠李素+Ad-sh-SIRT6組巨噬細胞中脂滴數(shù)目多于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t值分別為29.06、22.47、32.21，P值均＜0.001）；ox-LDL+異鼠李素組巨噬細胞中脂滴數(shù)目少于ox-LDL組，差異有統(tǒng)計學意義（t=15.83，P＜0.001）；ox-LDL+異鼠李素+Ad-sh-SIRT6組巨噬細胞中脂滴數(shù)目多于ox-LDL組、ox-LDL+異鼠李素組，差異有統(tǒng)計學意義（t值分別為15.27、25.45，P值均＜0.001），見圖4。

圖4 BODIPY 493/503染色檢測空白對照組、ox-LDL組、ox-LDL+異鼠李素組、ox-LDL+異鼠李素+Ad-sh-SIRT6組巨噬細胞中脂滴數(shù)目（×60）Figure 4 The number of lipid droplets in macrophages detected by BODIPY 493/503 staining in blank control group，ox-LDL group，ox-LDL+isorhamnetin group，ox-LDL+isorhamnetin+Ad-sh-SIRT6 group

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，急性和持續(xù)性心肌缺血導致的突然血流中斷會導致急性心肌梗死和惡性心律失常的發(fā)生［1］。尸檢數(shù)據(jù)表明，心源性猝死的大多數(shù)罪犯血管在造影檢查中均發(fā)現(xiàn)有40%～69%的管腔狹窄［7］。幾十年來，學者普遍認為，易損斑塊是導致急性冠脈綜合征的罪魁禍首［8］，其中纖維帽變薄在易損斑塊的形成中扮演了重要角色。斑塊中浸潤的巨噬細胞能夠分泌蛋白水解酶，進而降解富含膠原的纖維帽基質(zhì)，最后導致纖維帽變薄。尸檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，破裂的纖維帽通常被巨噬細胞衍生的泡沫細胞所浸潤［9-10］。而泡沫細胞的形成會促進炎癥反應，導致斑塊中壞死核心的形成，最終導致斑塊不穩(wěn)定［11］。泡沫細胞是通過哺乳動物巨噬細胞中脂質(zhì)代謝失調(diào)形成的：當脂質(zhì)積累超過巨噬細胞的平衡能力時會觸發(fā)脂滴的形成，從而導致這些巨噬細胞呈泡沫狀［2］。脂滴是所有細胞中三酰甘油和膽固醇酯被單層膜包裹從而儲存脂質(zhì)的細胞器，幾乎存在于每種細胞類型中，如肝細胞、神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和淋巴母細胞［12-13］。近年研究表明，脂滴作為一種特殊的細胞器，促進了泡沫細胞的形成，并且在動脈粥樣硬化病程進展中發(fā)揮重要作用。因此，減少巨噬細胞中脂滴形成，抑制泡沫細胞浸潤，對增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性至關(guān)重要。為此，本研究在前期研究［1-4］基礎(chǔ)上，通過高脂飲食和ox-LDL干預分別構(gòu)建動脈粥樣硬化動物模型和細胞模型，探索異鼠李素是否可以通過改善巨噬細胞脂質(zhì)代謝、抑制泡沫細胞形成，進而增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性，并進一步探尋其具體分子機制。

異鼠李素作為沙棘屬植物沙棘果實的主要提取物，富含多種活性物質(zhì)，如黃酮類、維生素類、類胡蘿卜素等［14］。研究表明，異鼠李素可減弱ox-LDL對內(nèi)皮細胞的損傷、抑制脂質(zhì)堆積、抑制血管平滑肌細胞增殖與遷移，從而延緩或抑制動脈粥樣硬化病情進展［15］。上述研究表明異鼠李素參與了動脈粥樣硬化斑塊的病程進展，但其能否調(diào)控巨噬細胞中的脂質(zhì)代謝，抑制脂滴在巨噬細胞中的聚集及其具體的分子機制，目前研究甚少。本研究結(jié)果顯示，動脈粥樣硬化+異鼠李素組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中脂質(zhì)核心面積百分比、泡沫細胞所占比例低于動脈粥樣硬化組，提示異鼠李素能夠明顯縮小和減少ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊中的脂質(zhì)核心面積和泡沫細胞。SIRT6作為哺乳動物Sirtuin家族的重要成員之一，主要定位在細胞質(zhì)中，具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙?；富钚裕ㄟ^在組蛋白H3上第9位賴氨酸和第56位賴氨酸脫乙?；l(fā)揮作用，通過調(diào)控脂質(zhì)代謝參與心血管疾病的病情進展［16］。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT6能調(diào)控三酰甘油的合成和脂質(zhì)代謝，在小鼠肝細胞中敲除SIRT6可以增加三酰甘油的合成，導致三酰甘油在肝細胞中過度積累，最終導致脂肪肝或肝脂肪變性［17］。既往研究表明，糖尿病患者頸動脈粥樣硬化斑塊形成與SIRT6表達水平下降密切相關(guān)，其機制可能是由于SIRT6的表達降低導致斑塊中炎癥反應增強、膠原含量降低，斑塊的易損性增加［18］。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL干預組、ox-LDL+異鼠李素干預組巨噬細胞中SIRT6表達水平低于空白對照組，ox-LDL+異鼠李素干預組巨噬細胞中SIRT6表達水平高于ox-LDL干預組，表明異鼠李素能夠提升ox-LDL干預的巨噬細胞中SIRT6表達水平。ox-LDL組、ox-LDL+異鼠李素組、ox-LDL+異鼠李素+Ad-sh-SIRT6組巨噬細胞中脂滴數(shù)目多于空白對照組，ox-LDL+異鼠李素組巨噬細胞中脂滴數(shù)目少于ox-LDL組，ox-LDL+異鼠李素+Ad-sh-SIRT6組巨噬細胞中脂滴數(shù)目多于ox-LDL組、ox-LDL+異鼠李素組，提示下調(diào)SIRT6表達水平后異鼠李素抑制巨噬細胞中脂滴聚集的作用被減弱。由此本研究組認為，異鼠李素在動脈粥樣硬化斑塊的病程進展中發(fā)揮的保護作用主要體現(xiàn)在：縮小ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊中的脂質(zhì)核心面積，減少巨噬細胞演變的泡沫細胞在動脈粥樣硬化斑塊中的聚集，從而增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性，而這些作用的發(fā)揮是依靠上調(diào)SIRT6表達水平來實現(xiàn)的，而下調(diào)SIRT6表達水平后巨噬細胞中聚集了大量脂滴，在一定程度上加劇了巨噬細胞中的脂質(zhì)代謝紊亂，促進了泡沫細胞的形成。

本研究尚存在一定局限性：首先，影響動脈粥樣硬化斑塊形成及其穩(wěn)定性的因素是多方面的，異鼠李素是否通過影響內(nèi)皮細胞來源的外泌體，即通過旁分泌途徑減少單核細胞在內(nèi)皮細胞表面的黏附而減少泡沫細胞形成；此外，異鼠李素是否可通過促進線粒體融合而促進脂滴的代謝，從而改善巨噬細胞中的脂質(zhì)代謝紊亂，減少泡沫細胞形成，這些具體分子調(diào)控機制尚不明確，還需要后期進一步驗證。

綜上所述，異鼠李素通過上調(diào)SIRT6表達水平，減少巨噬細胞中脂滴數(shù)目，抑制動脈粥樣硬化斑塊中泡沫細胞形成，縮小動脈粥樣硬化斑塊中脂質(zhì)核心面積，進而增加動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性。本研究為異鼠李素在冠心病患者中的應用提供了實驗依據(jù)，為減少急性心肌梗死的發(fā)生提供了新的中醫(yī)藥治療方案。

作者貢獻：王婷婷、張東偉進行研究的構(gòu)思與設計、可行性分析及文章的撰寫，負責文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責、監(jiān)督管理；王婷婷、李妍負責文章修訂；張明明負責結(jié)果分析；蔣國健負責文獻資料收集；郭文怡負責圖片整理。

本文無利益沖突。