急性腦梗死患者血清微小RNA-145、程序性細(xì)胞死亡因子4 mRNA水平變化及診斷價(jià)值研究

高倩，王建宇，孟偉建，李靜，崔永健，魏琰

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）又稱急性缺血性腦卒中，是指多種原因引起的腦部血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧性壞死，并伴有不同程度的神經(jīng)功能缺損，是腦血管疾病最常見的類型［1］。ACI發(fā)病率、致殘率均較高，可威脅患者健康，故早期診斷ACI有助于臨床針對(duì)性治療方案的制定，從而改善患者預(yù)后［2］。目前ACI的診斷主要依靠CT、MRI及相關(guān)量表，具有一定局限性，而尋找相關(guān)血清生物標(biāo)志物可能有助于ACI的早期診斷［3］。微小RNA-145（microRNA-145，miR-145）可通過介導(dǎo)氧化應(yīng)激、血管生成等在腦血管疾病進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］。研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-145水平降低與老年腦梗死患者頸動(dòng)脈狹窄程度密切相關(guān)［5］。程序性細(xì)胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是一類細(xì)胞死亡因子，其可阻斷含5'非翻譯區(qū)（5' untranslated region，5'UTR）結(jié)構(gòu)域的mRNA的翻譯過程，參與細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程［6］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-145靶向下調(diào)PDCD4水平可緩解缺血性腦卒中引起的炎性反應(yīng)［7］。但PDCD4是否可作為ACI的診斷指標(biāo)尚有待研究。因此，本研究分析ACI患者血清miR-145、PDCD4水平，并探討二者單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)ACI的診斷價(jià)值，以期為臨床上ACI的早期診斷提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2019年1月至2020年6月衡水市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的ACI患者185例為ACI組，其中男98例、女87例，年齡42～78歲、平均年齡（61.2±8.6）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合ACI的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］；（2）經(jīng)顱腦CT、MRI檢查確診為ACI；（3）首次發(fā)病，且于發(fā)病24 h內(nèi)就診；（4）具有ACI所致神經(jīng)功能缺損等癥狀；（5）患者或家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并心、肝、腎等重要臟器功能不全者；（2）伴有血液病、自身免疫性疾病者；（3）伴有急、慢性感染者；（4）合并惡性腫瘤者；（5）近期使用激素或免疫抑制劑者。根據(jù)入院時(shí)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）［8］評(píng)分將ACI患者進(jìn)一步分為輕度損傷亞組（NIHSS評(píng)分≤15分，72例）、中度損傷亞組（NIHSS評(píng)分為16～29分，64例）、重度損傷亞組（NIHSS評(píng)分≥30分，49例）。根據(jù)ACI患者腦梗死體積大小，將其進(jìn)一步分為小體積亞組（腦梗死體積＜5 cm3，69例）、中等體積亞組（腦梗死體積為5～10 cm3，62例）、大體積亞組（腦梗死體積＞10 cm3，54例）［9］。同期選擇在本院體檢的健康者150例為對(duì)照組，其中男82例、女68例，年齡40～79歲、平均年齡（60.8±9.1）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）對(duì)本研究知情同意；（2）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在溝通障礙者。本研究經(jīng)衡水市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集 收集所有受試者一般資料，包括性別、年齡、吸煙史（近半年內(nèi)每日吸煙≥1支定義為有吸煙史）、飲酒史（每周飲啤酒、白酒等含有酒精成分的飲料≥1次，且連續(xù)時(shí)間至少半年定義為有飲酒史）、疾病史（高血壓、糖尿病、高脂血癥史）和入院/體檢時(shí)收縮壓、舒張壓及三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、同型半胱氨酸、胱抑素C水平。

1.2.2 血清miR-145、PDCD4 mRNA水平檢測(cè) 采集ACI患者入院次日清晨、對(duì)照組體檢當(dāng)日清晨的外周靜脈血3 ml，于4 ℃下3 000 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），轉(zhuǎn)移血清至新離心管中，于-80 ℃冰箱中保存待用。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清miR-145、PDCD4 mRNA水平。按照上海通蔚生物科技有限公司生產(chǎn)的Trizol試劑盒中的方法提取血清總RNA，并通過核酸定量檢測(cè)儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司生產(chǎn)）檢測(cè)其濃度和純度，隨后按照武漢科昊佳生物科技有限公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-145、PDCD4 mRNA及內(nèi)參U6、β-actin的引物均由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，見表1。PCR反應(yīng)條件為95 ℃、5 min，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，利用公式2-??Ct計(jì)算血清miR-145、PDCD4 mRNA水平。

表1 miR-145、PDCD4 mRNA及內(nèi)參U6、β-actin的引物序列Table 1 Primer sequences of miR-145，PDCD4 mRNA and internal reference U6 and β-actin

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用 χ2檢驗(yàn)；ACI患者血清miR-145水平與血清PDCD4 mRNA水平間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析；ACI影響因素分析采用多因素Logistic回歸分析；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析胱抑素C及血清miR-145、PDCD4 mRNA水平對(duì)ACI的診斷價(jià)值，計(jì)算曲線下面積（area under curve，AUC），確定最佳截?cái)嘀担?jì)算靈敏度、特異度，AUC的比較采用Z檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組與ACI組一般資料比較 對(duì)照組與ACI組性別、年齡、吸煙史、飲酒史、有糖尿病史者所占比例、有高脂血癥史者所占比例、三酰甘油、總膽固醇、HDL-C比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；ACI組有高血壓史者所占比例、收縮壓、舒張壓、LDL-C、同型半胱氨酸、胱抑素C高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 對(duì)照組與ACI組一般資料比較Table 2 Comparison of general data between control group and ACI group

2.2 對(duì)照組與ACI組血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比較ACI組血清miR-145水平低于對(duì)照組，血清PDCD4 mRNA水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 對(duì)照組與ACI組血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比較（±s）Table 3 Comparison of serum miR-145 and PDCD4 mRNA levels between control group and ACI group

表3 對(duì)照組與ACI組血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比較（±s）Table 3 Comparison of serum miR-145 and PDCD4 mRNA levels between control group and ACI group

組別 例數(shù) miR-145 PDCD4 mRNA對(duì)照組 150 1.00±0.26 1.01±0.28 ACI組 185 0.59±0.17 1.44±0.39 t值 17.358 11.339 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 輕度損傷亞組、中度損傷亞組、重度損傷亞組血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比較 輕度損傷亞組、中度損傷亞組、重度損傷亞組血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中度損傷亞組、重度損傷亞組血清miR-145水平低于輕度損傷亞組，血清PDCD4 mRNA水平高于輕度損傷亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；重度損傷亞組血清miR-145水平低于中度損傷亞組，血清PDCD4 mRNA水平高于中度損傷亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 輕度損傷亞組、中度損傷亞組、重度損傷亞組血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比較（±s）Table 4 Comparison of serum miR-145 and PDCD4 mRNA levels in mild injury subgroup，moderate injury subgroup and severe injury subgroup

表4 輕度損傷亞組、中度損傷亞組、重度損傷亞組血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比較（±s）Table 4 Comparison of serum miR-145 and PDCD4 mRNA levels in mild injury subgroup，moderate injury subgroup and severe injury subgroup

注：a表示與輕度損傷亞組比較，P＜0.05；b表示與中度損傷亞組比較，P＜0.05

組別 例數(shù) miR-145 PDCD4 mRNA輕度損傷亞組 72 0.72±0.19 1.31±0.35中度損傷亞組 64 0.60±0.18a 1.45±0.38a重度損傷亞組 49 0.43±0.12ab 1.62±0.44ab F值 42.143 9.443 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.4 小體積亞組、中等體積亞組、大體積亞組血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比較 小體積亞組、中等體積亞組、大體積亞組血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中等體積亞組、大體積亞組血清miR-145水平低于小體積亞組，血清PDCD4 mRNA水平高于小體積亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；大體積亞組血清miR-145水平低于中等體積亞組，血清PDCD4 mRNA水平高于中等體積亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表5 小體積亞組、中等體積亞組、大體積亞組血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比較（±s）Table 5 Comparison of serum miR-145 and PDCD4 mRNA levels in small volume subgroup，medium volume subgroup and large volume subgroup

表5 小體積亞組、中等體積亞組、大體積亞組血清miR-145、PDCD4 mRNA水平比較（±s）Table 5 Comparison of serum miR-145 and PDCD4 mRNA levels in small volume subgroup，medium volume subgroup and large volume subgroup

注：a表示與小體積亞組比較，P＜0.05；b表示與中等體積亞組比較，P＜0.05

組別 例數(shù) miR-145 PDCD4 mRNA小體積亞組 69 0.69±0.18 1.33±0.34中等體積亞組 62 0.57±0.16a 1.47±0.39a大體積亞組 54 0.40±0.11ab 1.65±0.42ab F值 52.662 10.657 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.5 ACI患者血清miR-145水平與血清PDCD4 mRNA水平間的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，ACI患者血清miR-145水平與血清PDCD4 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.327，P＜0.001），見圖1。

圖1 ACI患者血清miR-145水平與血清PDCD4 mRNA水平間相關(guān)性的散點(diǎn)圖Figure 1 Scatter plot of correlation between serum miR-145 level and serum PDCD4 mRNA level in patients with ACI

2.6 ACI影響因素的多因素Logistic回歸分析 以受試者是否發(fā)生ACI作為因變量（賦值：未發(fā)生=0，發(fā)生=1），以高血壓史（賦值：無=0，有=1）、收縮壓（賦值：實(shí)測(cè)值）、舒張壓（賦值：實(shí)測(cè)值）、LDL-C（賦值：實(shí)測(cè)值）、同型半胱氨酸（賦值：實(shí)測(cè)值）、胱抑素C（賦值：實(shí)測(cè)值）、血清miR-145水平（賦值：實(shí)測(cè)值）、血清PDCD4 mRNA水平（賦值：實(shí)測(cè)值）作為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，胱抑素C及血清miR-145、PDCD4 mRNA水平是ACI的影響因素（P＜0.05），見表6。

表6 ACI影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 6 Multivariate Logistic regression analysis of influencing factors of ACI

2.7 胱抑素C及血清miR-145、PDCD4 mRNA水平對(duì)ACI的診斷價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-145水平聯(lián)合血清PDCD4 mRNA水平診斷ACI的AUC大于胱抑素C（Z=2.421，P=0.015）、血清miR-145水平（Z=3.605，P<0.001）、血清PDCD4 mRNA水平（Z=2.954，P=0.003）單獨(dú)診斷ACI的AUC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表7、圖2。

圖2 胱抑素C及血清miR-145、PDCD4 mRNA水平診斷ACI的ROC曲線Figure 2 ROC curve of cystatin C，serum miR-145 and PDCD4 mRNA levels in the diagnosis of ACI

表7 胱抑素C及血清miR-145、PDCD4 mRNA水平對(duì)ACI的診斷價(jià)值Table 7 Diagnostic value of cystatin C，serum miR-145 and PDCD4 mRNA levels in ACI

3 討論

隨著社會(huì)的發(fā)展和人們飲食習(xí)慣的改變，ACI發(fā)病率呈上升趨勢(shì)且趨向年輕化，威脅人們健康。ACI的診療重點(diǎn)在于早發(fā)現(xiàn)、早治療、早預(yù)防，需要在短時(shí)間內(nèi)對(duì)疾病做出準(zhǔn)確、快速的診斷［10］。目前，臨床上主要依靠影像學(xué)檢查和醫(yī)生臨床經(jīng)驗(yàn)對(duì)ACI進(jìn)行診斷，然而CT檢查診斷早期ACI的靈敏度欠佳，MRI檢查耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高，醫(yī)生臨床經(jīng)驗(yàn)缺乏客觀性，因而選取有效的生物標(biāo)志物可能有助于臨床上ACI的診斷。

微小RNA是一類非編碼內(nèi)源性小RNA，可通過抑制轉(zhuǎn)錄或降解mRNA而參與、調(diào)控腦血管疾病的發(fā)展進(jìn)程。近年來，越來越多的研究證實(shí)，微小RNA表達(dá)水平在ACI患者中升高或降低［11-12］。miR-145定位于5q32-33，其在缺血性腦卒中進(jìn)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，如miR-145可通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶通路而保護(hù)缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)干細(xì)胞［13］。本研究結(jié)果顯示，ACI組血清miR-145水平低于對(duì)照組；中度損傷亞組、重度損傷亞組血清miR-145水平低于輕度損傷亞組，重度損傷亞組血清miR-145水平低于中度損傷亞組；中等體積亞組、大體積亞組血清miR-145水平低于小體積亞組，大體積亞組血清miR-145水平低于中等體積亞組；提示血清miR-145水平降低可能與ACI發(fā)病及病情嚴(yán)重程度有關(guān)。PDCD4是在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)現(xiàn)的一種特定調(diào)節(jié)基因，其表達(dá)水平在多種細(xì)胞凋亡過程中明顯升高，如梁麗英等［14］研究報(bào)道，微小RNA-21可通過靶向調(diào)控PDCD4而抑制心肌細(xì)胞凋亡。此外，REN等［15］研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-424通過靶向PDCD4可減輕缺血性腦卒中細(xì)胞模型中的神經(jīng)元損傷。本研究結(jié)果顯示，ACI組血清PDCD4 mRNA水平高于對(duì)照組，提示血清PDCD4 mRNA水平可能參與ACI的發(fā)病過程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，中度損傷亞組、重度損傷亞組血清PDCD4 mRNA水平高于輕度損傷亞組，重度損傷亞組血清PDCD4 mRNA水平高于中度損傷亞組；中等體積亞組、大體積亞組血清PDCD4 mRNA水平高于小體積亞組，大體積亞組血清PDCD4 mRNA水平高于中等體積亞組；提示血清PDCD4 mRNA水平可能在ACI病情進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

劉宏偉等［7］通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，PDCD4是miR-145的靶基因，通過過表達(dá)miR-145靶向下調(diào)PDCD4可抑制缺血性腦卒中的病情進(jìn)展。本研究Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，ACI患者血清miR-145水平與血清PDCD4 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-145與PDCD4 mRNA可能相互作用并參與ACI的病情進(jìn)展過程。推測(cè)miR-145可通過靶向PDCD4而抑制腫瘤壞死因子α、白介素6的表達(dá)及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，從而在ACI病情進(jìn)展中發(fā)揮作用［7］。本研究多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，胱抑素C及血清miR-145、PDCD4 mRNA水平是ACI的影響因素，提示檢測(cè)胱抑素C及血清miR-145、PDCD4 mRNA水平可能對(duì)早期評(píng)估ACI有幫助。研究發(fā)現(xiàn)，異常升高的血清胱抑素C與ACI的發(fā)生密切相關(guān)，可作為診斷ACI的常規(guī)指標(biāo)［16］。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-145水平聯(lián)合血清PDCD4 mRNA水平診斷ACI的AUC大于胱抑素C、血清miR-145水平、血清PDCD4 mRNA水平單獨(dú)診斷ACI的AUC，提示臨床上通過聯(lián)合檢測(cè)血清miR-145、PDCD4 mRNA水平可能更有利于早期診斷ACI。

綜上所述，ACI患者血清miR-145水平下降、血清PDCD4 mRNA水平升高，其均與患者神經(jīng)功能缺損程度和腦梗死體積有關(guān)，且二者聯(lián)合對(duì)ACI具有較高的診斷價(jià)值，其可能是臨床上早期診斷ACI的潛在生物標(biāo)志物。但由于本研究屬于單中心小樣本研究，結(jié)果可能存在一定局限性，下一步需要擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步探討血清miR-145、PDCD4 mRNA水平在ACI早期診斷中的價(jià)值。

作者貢獻(xiàn)：高倩進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、研究的實(shí)施與可行性分析、結(jié)果的分析與解釋，撰寫論文，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；王建宇、魏琰進(jìn)行數(shù)據(jù)收集與整理；孟偉建進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；高倩、李靜進(jìn)行論文的修訂；高倩、崔永健負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。