帕瑞昔布鈉對(duì)宮頸癌細(xì)胞COX-2/PGE2通路及細(xì)胞學(xué)行為的影響①

容鳳嬌 杜佳楠 蔣良 富徐夏

（三亞中心醫(yī)院麻醉科，三亞 572000）

宮頸癌是世界范圍內(nèi)女性最常見(jiàn)的癌癥之一，且有80%都是在發(fā)展中國(guó)家，對(duì)女性健康造成了嚴(yán)重威脅［1］。病毒感染和環(huán)境因素是引起宮頸癌發(fā)生的主要因素，手術(shù)切除和放化療是治療宮頸癌的常用手段［2］。雖然對(duì)于宮頸癌的治療策略不斷發(fā)展和進(jìn)步，但是仍然沒(méi)有顯著提高患者的生存率［3］。帕瑞昔布鈉是一種環(huán)氧化合酶-2（COX-2）特異性抑制劑，屬于鎮(zhèn)痛藥物，臨床上常用于中度或重度術(shù)后急性疼痛的治療，療效高且不良反應(yīng)低，能夠減輕宮頸癌患者腹腔鏡手術(shù)后的術(shù)后疼痛，提高治愈率［4］。COX-2在不同類型的腫瘤細(xì)胞中常發(fā)生過(guò)表達(dá)，其下游因子前列腺素E2（PGE2）可促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲，抑制COX-2/PGE2/轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）信號(hào)通路可抑制前列腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及相關(guān)基因的表達(dá)［5-6］。而帕瑞昔布鈉可以濃度依賴性的方式降低癌細(xì)胞存活率，在MG-63人骨肉瘤細(xì)胞系中可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞壞死以達(dá)到抗腫瘤效果［7］。但是，帕瑞昔布鈉對(duì)宮頸癌細(xì)胞EMT及遷移侵襲能力的影響，目前尚未有報(bào)道。本研究以宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)帕瑞昔布鈉在不同濃度和不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HeLa細(xì)胞存活率的影響，篩選出合適的濃度和時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞行為學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)，旨在揭示帕瑞昔布鈉對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞COX-2/PGE2通路及其EMT和遷移、侵襲能力的影響，為帕瑞昔布鈉用于宮頸癌患者的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及藥品人宮頸癌細(xì)胞株HeLa（批號(hào)：TCHu187）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保存委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；帕瑞昔布鈉（規(guī)格：40 mg，批號(hào)：20200219）購(gòu)自瑞典法瑪西亞公司。

1.1.2 主要試劑及儀器胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶（批號(hào)：25300-057、25300-081）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DMEM/F12培養(yǎng)基（批號(hào)：SH30023K）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；Matrigel基質(zhì)膠（批號(hào)：354471）和8 μm 24孔Transwell小室（批號(hào)：350619）購(gòu)自美國(guó)Corning公司；碘化丙啶（PI）、磺酰羅丹明B（SRB）、GAPDH單克隆抗體和聚偏氟乙烯（PVDF）膜（批號(hào)：CD-100603G、CD-1007G、CD-1006L、CD-08193）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)：39224）和ECL顯色試劑盒（批號(hào)：31007）購(gòu)自北京中山金橋生物科技有限公司；96孔培養(yǎng)板（批號(hào)：B615006）購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；COX-2、PGE2、STAT3、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化STAT3（p-STAT3）、磷酸化AKT（p-AKT）、E-鈣黏蛋白（E-cad?herin）、波形蛋白（vimentin）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑2（TIMP2）單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鼠抗人IgG二抗（批號(hào)：ab10940、ab14307、ab10225、ab26357、ab24771、ab50119、ab51276、ab60135、ab43107、ab57112、ab00317）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。酶標(biāo)儀（型號(hào)：Fax-20100）購(gòu)自美國(guó)INStat公司；光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：尼康SMZ745）購(gòu)自上海普赫生物科技有限公司；全能型凝膠成像分析系統(tǒng)（型號(hào)：ChemiDoc-MP）購(gòu)自山東三瑞科技有限公司；轉(zhuǎn)膜儀和電泳儀（型號(hào)：170-3940、Mini Protean 3）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HeLa細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 SRB法檢測(cè)不同濃度帕瑞昔布鈉在不同時(shí)間上對(duì)細(xì)胞存活率的影響將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為3×107~5×107個(gè)/ml，接種于96孔板中，每孔100 μl。培養(yǎng)24 h后，分別加入0、50、100、150、200、250、300μmol/L濃度的帕瑞昔布鈉，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，取出細(xì)胞，加入預(yù)冷后的50%三氯乙酸，至終濃度為10%，4℃條件下固定1 h，然后用去離子水沖洗5次，晾干，加入0.4%SRB染料染色10 min，0.1%醋酸洗5次，過(guò)夜晾干，最后加入150μl 1%Tris堿溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光值（OD值），計(jì)算細(xì)胞存活率。每組各設(shè)6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)孔。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD570nm-空白組OD570nm）/（對(duì)照組OD570nm-空白組OD570nm）×100%?？瞻捉M只加培養(yǎng)液，對(duì)照組藥物濃度為零。

1.2.3 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力取HeLa細(xì)胞，用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109個(gè)/ml，取100μl細(xì)胞懸液接種到Transwell小室上室，同時(shí)加入不同濃度帕瑞昔布鈉，下室加入600 μl含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后用棉簽頭擦掉小室內(nèi)未遷移的細(xì)胞，下室膜上遷移過(guò)去的細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗3次，甲醇再固定15 min，0.1%結(jié)晶紫室溫染色40 min。用水沖洗多余的染液，晾干后，光學(xué)顯微鏡下，每組隨機(jī)選取9個(gè)視野拍照，用Image J軟件計(jì)數(shù)穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.4 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力取Matrigel基質(zhì)膠，用預(yù)冷的DMEM/F12培養(yǎng)基按Matrigel基質(zhì)膠∶培養(yǎng)基=1∶8的比例稀釋成工作液，然后取50 μl鋪于Transwell小室的上室，鋪膠后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜，待Matrigel基質(zhì)膠凝固。取HeLa細(xì)胞，用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×109個(gè)/ml，其余操作與1.2.3細(xì)胞遷移能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)相同。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞COX-2、PGE2、STAT3、AKT、p-STAT3、p-AKT、E-cadherin、vimentin、MMP2和TIMP2蛋白表達(dá)水平取即將長(zhǎng)滿單層的HeLa細(xì)胞，加入不同濃度帕瑞昔布鈉，37℃培養(yǎng)24 h后，1 200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入RIPA裂解液，于冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min后取上清，使用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕式轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，之后將PVDF膜置于1∶2 000濃度稀釋后的COX-2、PGE2、STAT3、AKT、p-STAT3、p-AKT、E-cadherin、vimentin、MMP2和TIMP2一抗中4℃過(guò)夜孵育，緩沖液沖洗后，加入含辣根過(guò)氧化物酶綴合的二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色，凝膠成像儀拍照，以GAPDH為內(nèi)參，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本研究所得數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不用濃度帕瑞昔布鈉在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HeLa細(xì)胞存活率的影響如表1所示，與0 μmol/L帕瑞昔布鈉處理相比，除50 μmol/L帕瑞昔布鈉處理和100 μmol/L處理24 h外，其余各時(shí)間點(diǎn)不同濃度的帕瑞昔布鈉對(duì)HeLa細(xì)胞存活均有顯著抑制作用（P<0.05），且呈濃度和時(shí)間依賴性。由于100μmol/L帕瑞昔布鈉處理24 h對(duì)HeLa細(xì)胞存活率的抑制與0 μmol/L帕瑞昔布鈉處理24 h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），因此選擇最大濃度100μmol/L處理24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)遂將后續(xù)實(shí)驗(yàn)分別采用0 μmol/L、25μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L帕瑞昔布鈉處理HeLa細(xì)胞，24 h后檢測(cè)其細(xì)胞學(xué)行為。

表1 不同濃度帕瑞昔布鈉在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HeLa細(xì)胞存活率的影響（±s，n=6，%）Tab.1 Effects of different concentrations of parecoxib sodium on survival rate of HeLa cells at different time points（±s，n=6，%）

表1 不同濃度帕瑞昔布鈉在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HeLa細(xì)胞存活率的影響（±s，n=6，%）Tab.1 Effects of different concentrations of parecoxib sodium on survival rate of HeLa cells at different time points（±s，n=6，%）

Note：1）P<0.05 vs 0μmol/L.

Concentration 0μmol/L 50μmol/L 100μmol/L 150μmol/L 200μmol/L 250μmol/L 300μmol/L Cell survival rate 24 h 100 87.38±9.98 74.79±9.54 40.25±9.211）37.33±8.861）34.96±8.551）30.54±8.191）48 h 100 82.98±9.67 62.36±9.361）38.37±8.891）35.27±8.541）31.98±8.231）26.38±7.731）72 h 100 75.95±9.48 60.13±9.161）36.57±8.771）32.32±8.361）27.26±7.831）24.22±7.551）

2.2 帕瑞昔布鈉對(duì)HeLa細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響與帕瑞昔布鈉0 μmol/L組相比，帕瑞昔布鈉25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L組HeLa細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)依次減少（均P<0.05），呈劑量依賴性，即表示細(xì)胞遷移和侵襲能力依次降低。見(jiàn)表2和圖1。

圖1 各組HeLa細(xì)胞遷移和侵襲（結(jié)晶紫染色，×200）Fig.1 Migration and invasion of HeLa cells in each group（crystal violet staining，×200）

表2 帕瑞昔布鈉對(duì)HeLa細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（±s，n=6）Tab.2 Effect of parecoxib sodium on migration and inva?sion of HeLa cells（±s，n=6）

表2 帕瑞昔布鈉對(duì)HeLa細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（±s，n=6）Tab.2 Effect of parecoxib sodium on migration and inva?sion of HeLa cells（±s，n=6）

Note：1）P<0.05 vs parecoxib sodium 0 μmol/L group；2）P<0.05 vs parecoxib sodium 25μmol/L group；3）P<0.05 vs parecoxib sodium 50μmol/L group.

Groups Parecoxib sodium 0μmol/L Parecoxib sodium 25μmol/L Parecoxib sodium 50μmol/L Parecoxib sodium 100μmol/L Number of penetrating cells in migration test 264.83±27.52 207.91±21.391）166.73±17.851）2）71.29±10.351）2）3）Number of penetrating cells in invasion test 147.58±15.32 109.25±12.141）78.29±9.431）2）33.45±4.281）2）3）

2.3 帕瑞昔布鈉對(duì)HeLa細(xì)胞MMP2/TIMP2蛋白比值及E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)的影響與帕瑞昔布鈉0 μmol/L組相比，帕瑞昔布鈉25 μmol/L、50μmol/L、100μmol/L組HeLa細(xì)胞vimentin蛋白表達(dá)水平和MMP2/TIMP2蛋白比值依次降低，E-cad?herin蛋白表達(dá)水平依次升高（均P<0.05），呈劑量依賴性。見(jiàn)圖2、3。

圖2 各 組HeLa細(xì) 胞E-cadherin、vimentin、MMP2和TIMP2蛋白表達(dá)條帶圖Fig.2 Protein expression bands of E-cadherin，vimentin，MMP2 and TIMP2 in HeLa cells of each group

2.4 帕瑞昔布鈉對(duì)HeLa細(xì)胞COX-2、PGE2、p-STAT3、STAT3、p-AKT和AKT蛋白表達(dá)水平的影響與帕瑞昔布鈉0 μmol/L組相比，帕瑞昔布鈉25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L組HeLa細(xì) 胞COX-2、PGE2蛋白表達(dá)水平和STAT3、AKT磷酸化水平依次降低（均P<0.05），呈劑量依賴性。見(jiàn)圖4、5。

圖4 各 組HeLa細(xì) 胞COX-2、PGE2、p-STAT3、STAT3、p-AKT和AKT蛋白表達(dá)條帶圖Fig.4 Expression bands of COX-2，PGE2，p-STAT3，STAT3，p-AKT and AKT in HeLa cells of each group

圖3 帕瑞昔布鈉對(duì)HeLa細(xì)胞E-cadherin、vimentin、MMP2/TIMP2蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of parecoxib sodium on expression of E-cad?herin，vimentin and MMP2/TIMP2 in HeLa cells

圖5 帕瑞昔布鈉對(duì)HeLa細(xì)胞COX-2、PGE2、p-STAT3、STAT3、p-AKT和AKT蛋白表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of parecoxib sodium on expression of COX-2，PGE2，p-STAT3，STAT3，p-AKT and AKT in HeLa cells

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)中較為常見(jiàn)的腫瘤，惡性程度極高，癌細(xì)胞的遷移和侵襲是導(dǎo)致患者病情惡化，甚至死亡的原因［8］。宮頸癌復(fù)發(fā)率高，總體預(yù)后不理想［9］，尋找新的治療藥物和策略是研究熱點(diǎn)。

帕瑞昔布鈉是纈昔布的前藥，應(yīng)用于創(chuàng)傷性和術(shù)后患者，避免阿片類藥物引起的副作用，在術(shù)后的多模式鎮(zhèn)痛和增強(qiáng)康復(fù)中發(fā)揮重要作用［10］。帕瑞昔布鈉可抑制乳腺癌患者的炎癥反應(yīng)，改善患者的免疫功能，能有效增強(qiáng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的免疫治療效果，抑制其增殖、遷移和侵襲［11-12］。誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞EMT，可促進(jìn)細(xì)胞侵襲和遷移，細(xì)胞發(fā)生EMT后，上皮組織不再具有保護(hù)作用，上皮標(biāo)記因子E-cad?herin表達(dá)量減少，同時(shí)間質(zhì)標(biāo)記因子vimentin表達(dá)量升高［13-14］。MMP2和TIMP2為遷移侵襲相關(guān)蛋白，MMP2蛋白表達(dá)水平的降低可抑制HeLa細(xì)胞的侵襲和遷移，TIMP2為MMP2抑制物，調(diào)控MMP2/TIMP2的平衡可起到抗肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用［15-16］。本研究采用宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，使用帕瑞昔布鈉處理HeLa細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)帕瑞昔布鈉作用24、48、72 h后均可降低HeLa細(xì)胞存活率，25 μmol/L、50μmol/L、100μmol/L帕瑞昔布鈉作用24 h，可顯著降低其遷移侵襲能力、vimentin蛋白表達(dá)水平及MMP2/TIMP2蛋白比值，提高E-cadherin蛋白表達(dá)水平，提示帕瑞昔布鈉可降低HeLa細(xì)胞的EMT和遷移侵襲能力，但是否影響COX-2/PGE2通路，尚需進(jìn)一步研究。

COX-2通路參與結(jié)腸癌細(xì)胞EMT發(fā)生，COX-2的上調(diào)可導(dǎo)致PGE2過(guò)度合成，而PEG2可通過(guò)顯著提高M(jìn)MP2活性，增加癌細(xì)胞的侵襲和遷移，因此，降低COX-2表達(dá)，可通過(guò)減少PGE2的合成降低MMP-2活性，進(jìn)而減弱癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡［17-19］。COX-2/PGE2/STAT3/AKT參與癌癥干細(xì)胞EMT，抑制STAT3和AKT磷酸化，可使細(xì)胞遷移能力受阻［20-21］。本研究發(fā)現(xiàn)，帕瑞昔布鈉能劑量依賴性地降低COX-2和PGE2蛋白表達(dá)水平及其下游因子STAT3和AKT磷酸化水平。另外，COX-2/PGE2通路參與婦科腫瘤發(fā)生及炎癥反應(yīng)［22］。ZHANG等［23］研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能夠通過(guò)抑制COX-2的表達(dá)，降低宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，從而達(dá)到抗宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的效果。結(jié)合本研究提示帕瑞昔布鈉亦可能通過(guò)抑制COX-2/PGE2通路，進(jìn)而抑制HeLa細(xì)胞EMT及遷移侵襲能力。

綜上所述，帕瑞昔布鈉可劑量依賴性抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞EMT和遷移侵襲能力，可能與抑制COX-2/PGE2通路有關(guān)，為臨床上使用帕瑞昔布鈉治療宮頸癌提供了理論依據(jù)，但是帕瑞昔布鈉對(duì)宮頸癌細(xì)胞行為學(xué)的作用機(jī)制十分復(fù)雜，尚需深入研究。