白果內酯激活Nrf2/HO-1通路抑制星形膠質細胞的氧化應激緩解CPZ誘導的髓鞘脫失①

鞠文媛 陳陽陽 褚果果 李曉慧 張海飛 宋麗娟 王青 尉杰忠 肖保國 馬存根

（山西中醫(yī)藥大學神經生物學研究中心，國家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點研究室，晉中 030619）

星形膠質細胞是大腦中最大的膠質細胞群體，中樞一旦受損，星形膠質細胞迅速被激活，修復受損組織，恢復神經功能［1］。同時，星形膠質細胞作為血腦屏障后的第一類實質細胞，是抵抗外源性氧化損傷的第一道防線，有其自身的抗氧化防御系統(tǒng)。高活性的抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶（glutathi?one peroxidase，GSH-Px）、過 氧 化 氫 酶（catalase，CAT）和超氧化 物 歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶-1

（nuclear factor erythroid-2-related factor 2/heme oxy?genase 1，Nrf2/HO-1）抗氧化通路等共同抵抗氧化損傷［2］。但在中樞神經系統(tǒng)（central nervous system，CNS）變性疾病中，持續(xù)的致病因素的刺激，使得星形膠質細胞的抗氧化體系失控，造成氧化產物釋放增多，抗氧化酶的表達降低［3］。所以在該類疾病中，調控星形膠質細胞的抗氧化體系，對于治療疾病是一種重要的策略。

白果內酯（bilobalide，BB）是從銀杏葉中提取出的一種倍半萜內酯，本課題組既往的研究顯示其可緩解雙環(huán)己酮草酰二腙（cuprizone，CPZ）誘導的髓鞘脫失，同時發(fā)現BB對CPZ模型病灶區(qū)的星形膠質細胞的數量和形態(tài)有明顯的影響，但是否有抗氧化機制參與并不清楚［4］。另外，有報道在缺血/再灌注模型中，BB可通過對抗缺血/再灌注誘導的氧化應激反應而發(fā)揮神經保護作用［5］?；谘趸瘧ぴ谒枨拭撌е械闹匾饔?，本研究初步探索了BB對CPZ誘導的脫髓鞘模型中星形膠質細胞氧化應激的影響和作用機制，以期為進一步的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物10~12周齡的C57BL/6雄性小鼠共24只，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。實驗經山西中醫(yī)藥大學倫理委員會批準。動物在清潔級動物房進行適應性喂養(yǎng)1周后，再進行實驗。

1.1.2 試劑與儀器BB（中國南京道斯夫生物科技有限公司）；CPZ（美國Sigma公司）；脂多糖（lipo?polysaccharide，LPS）（中國北京索萊寶科技有限公司）；氧化和抗氧化試劑盒（中國上海泛柯實業(yè)有限公司）；抗體如anti-GFAP（美國Abcam）；anti-Nrf2（美國Cell signaling technology）；anti-HO-1（中國愛必信）；DAPI溶液（中國北京索萊寶科技有限公司）；TRITC標記的山羊抗兔IgG二抗（美國Jackson immunoResearch）；Alex Flour 488標記的驢抗雞IgG二抗（美國Jackson immunoResearch）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（中國武漢博士德生物工程有限公司）；熒光顯微鏡（美國Leica）；冷凍切片機（德國Leica）。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥24只小鼠按照體質量隨機分為正常組、模型組和BB治療組，每組8只。在飼料粉末中混入0.2%的CPZ制成CPZ飼料。模型組和BB治療組每天喂食CPZ飼料，正常組喂養(yǎng)正常飼料，共6周。BB治療組從喂食CPZ飼料的第4周末開始，每天腹腔注射BB 40 mg/（kg·d）1次，200 μl/只，持續(xù)給藥到第6周末，共2周。正常對照組和模型組每天持續(xù)腹腔注射等量的生理鹽水2周。

1.2.2 組織制備小鼠用10%水合氯醛麻醉完全后，解剖胸部，暴露心臟，每組隨機選取4只，用生理鹽水進行心臟灌注后，再用4%多聚甲醛進行心臟灌注，固定完全后取出完整的腦組織，4%多聚甲醛4℃固定2 h，蔗糖梯度脫水，OCT包埋腦組織，制成10 μm的冷凍切片，用于組織的免疫熒光染色。每組中剩下的4只，用生理鹽水進行心臟灌注后，冰上取出腦組織，置于玻璃研磨器中，并按照每20 mg組織加入150 μl的比例加入組織裂解液進行研磨，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，即為各組腦蛋白提取液，-80℃冰箱保存。

1.2.3 盧卡斯快藍染色檢測胼胝體區(qū)域髓鞘脫失情況將腦切片放入提前配好的固藍染液中，56℃浸泡過夜。次日，95%乙醇和去離子水洗滌，以去除多余的固藍染液，碳酸鋰溶液、75%乙醇溶液和去離子水中反復浸洗，直到能夠明顯區(qū)分灰質和白質。最后，置于梯度乙醇溶液中進行脫水，二甲苯中透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并收集圖片，Image-ProPlus6.0計算胼胝體區(qū)域的累積光密度。

1.2.4 免疫熒光染色檢測腦組織中Nrf2和HO-1的表達腦組織切片從-80℃冰箱取出，室溫中靜置片刻，置于4%多聚甲醛固定20 min。PBS淋洗，1%BSA封 閉1 h，加入 一 抗anti-GFAP、anti-Nrf2、anti-HO-1，4℃冰箱過夜。次日，PBS淋洗后，加入相應的二抗，室溫孵育2 h，PBS淋洗，加入DAPI溶液染10 min，PBS淋洗，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照，Image-ProPlus6.0軟件分析結果。

1.2.5 原代星形膠質細胞的制備新生的C57BL/6小鼠（24 h內出生）若干，75%的乙醇消毒皮膚，無菌超凈臺中斷頭，分離出大腦皮層，放于DMEM基礎培養(yǎng)液中，用吸管反復吹打，制成細胞懸液。4℃、3 000 r/min離心10 min，棄掉上清，細胞沉淀重懸于DMEM完全培養(yǎng)液（10%胎牛血清，1%青鏈霉素混合液）中，濾網過濾后，用吸管吹打成單細胞懸液，置于75 cm2培養(yǎng)瓶，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天更換DMEM完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第7天，待細胞生長密度達到90%時，置于搖床上，180 r/min持續(xù)搖晃12 h，去除小膠質細胞，以達到純化星形膠質細胞的目的。以上過程重復2~3次。

1.2.6 氧化和抗氧化指標檢測收集各組細胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min，離心15 min，取上清液備用。各組腦蛋白提取液，用BCA法定量至相同的蛋白濃度。參照氧化和抗氧化試劑盒說明書檢測相關氧化指標如活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮（reactive nitrogen species，RNS）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平和抗氧化指標如CAT、GSH-Px和SOD水平。

1.2.7 Western blot檢測原代星形膠質細胞Nrf2和HO-1的表達各組細胞蛋白提取液，按每40 μl的蛋白樣本加入10 μl的5×loading Buffer后，沸水煮10 min。根據檢測指標的蛋白分子量制膠，進行SDS-PAGE凝膠電泳，后轉到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h后，用TBST稀釋一抗Nrf2（1∶500）和HO-1（1∶300），加入到PVDF膜上，4℃過夜。次日，TBST洗去膜上多余的一抗，加入相對應的二抗，室溫孵育2 h，TBST漂洗，加入ECL顯色液進行顯色、拍照。Image J計算每組的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析應用Graph Pad8.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數據符合正態(tài)分布用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間均數比較選用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BB改善了CPZ小鼠的行為學和髓鞘脫失對小鼠進行高架十字迷宮和T迷宮測試，以檢測小鼠的焦慮狀態(tài)和學習能力。如圖1所示，高架十字迷宮結果顯示，與正常組相比，CPZ組小鼠進入開放臂的次數減少（P<0.001）。與CPZ組相比，BB治療組小鼠進入開放臂的次數增多（P<0.05）。T迷宮測試結果顯示，與正常組相比，CPZ組小鼠在食物臂的運動距離明顯縮短（P<0.001）。與CPZ組相比，BB治療組小鼠在食物臂的運動距離增長（P<0.05）。以上結果表明，BB用藥后改善了小鼠的焦慮情緒，提高了學習能力。盧卡斯快藍染色結果顯示，與正常組相比，CPZ組胼胝體區(qū)域的髓鞘脫失嚴重（P<0.01），與CPZ組相比，BB用藥組減輕了胼胝體區(qū)域的髓鞘脫失（P<0.01）。

圖1 各組小鼠的行為學測試和病理學染色（×50）Fig.1 Behavioral test and pathological staining of mice in each group（×50）

2.2 BB抑制CPZ小鼠氧化應激如圖2所示，體內實驗結果表明，與正常組相比，CPZ組腦組織中ROS、RNS和MDA等氧化產物的含量增加（P<0.01或P<0.05）；CAT、GSH-Px和SOD等抗氧化酶的含量減少（P<0.01或P<0.001）。與CPZ組相比，BB干預后顯著下調了小鼠腦組織中氧化產物ROS、RNS和MDA水平（P<0.05），上調了抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD水平（P<0.05）。

圖2 BB對CPZ小鼠氧化應激的影響Fig.2 Effects of BB on oxidative stress in CPZ mice

2.3 BB激活CPZ小鼠Nrf2/HO-1信號通路為探究星形膠質細胞是否參與CPZ小鼠腦內的抗氧化過程，小鼠腦片的星形膠質細胞和Nrf2/HO-1抗氧化通路進行免疫熒光染色。如圖3所示，與正常組相比，CPZ組小鼠腦內GFAP+Nrf2+/HO-1+的細胞表達增多，并出現Nrf2核轉移的情況（P<0.01或P<0.001），表明在氧化應激下，激活了Nrf2/HO-1抗氧化通路。與CPZ組相比，BB用藥組小鼠腦內GFAP+Nrf2+/HO-1+細胞表達進一步增多，并且出現Nrf2核轉移的星形膠質細胞表達增多（P<0.01），表明BB治療后可進一步激活腦內Nrf2/HO-1抗氧化通路，并且星形膠質細胞參與到CPZ小鼠體內的抗氧化過程。

圖3 BB對CPZ小鼠Nrf2/HO-1通路的影響（×100）Fig.3 Effect of BB on Nrf2/HO-1 pathway in CPZ mice（×100）

2.4 BB抑制LPS刺激的原代星形膠質細胞的氧化應激如圖4所示，與正常組相比，LPS組的星形膠質細胞分泌的ROS、RNS和MDA氧化產物增多（P<0.01或P<0.001），分泌的CAT、GSH-Px和SOD抗氧化酶減少（P<0.01或P<0.001）。與LPS組相比，BB用藥組顯著下調了星形膠質細胞的ROS、RNS和MDA水平（P<0.05或P<0.01），上調了原代星形膠質細胞抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD水平（P<0.05）。

圖4 BB對原代星形膠質細胞氧化應激的影響Fig.4 Effect of BB on oxidative stress of primary astrocytes

2.5 BB增加LPS刺激的原代星形膠質細胞Nrf2和HO-1蛋白表達如圖5所示，與正常組相比，LPS組中原代星形膠質細胞中Nrf2/HO-1的表達增加（P<0.05）；與LPS組相比，BB用藥組中原代星形膠質細胞中Nrf2和HO-1蛋白表達顯著增加（P<0.01或P<0.001）。

圖5 各組原代星形膠質細胞中Nrf2和HO-1蛋白表達Fig.5 Expressions of Nrf2 and HO-1 protein in primary astrocytes of each group

3 討論

實驗結果證實了BB具有良好的抗氧化作用，可以通過抑制星形膠質細胞的氧化應激反應緩解髓鞘脫失。在CPZ小鼠模型中，BB可抑制腦組織中ROS、RNS和MDA氧化產物的產生，上調抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD的水平，并且激活腦內的Nrf2/HO-1抗氧化通路。在星形膠質細胞的體外模型中，BB用藥后抑制了氧化產物ROS、RNS和MDA的產生，增加抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD的表達，并且促進了原代星形膠質細胞中Nrf2和HO-1蛋白的表達，表明BB的抗氧化作用可能與其促進星形膠質細胞中Nrf2和HO-1蛋白的表達有關。

星形膠質細胞的異?；罨嵌喟l(fā)性硬化（multiple slerosis，MS）等CNS炎癥變性疾病的主要病理標志之一［6］。在該類疾病中，大多都存在星形膠質細胞功能障礙和抗氧化系統(tǒng)的紊亂，造成神經元死亡等，這可能是其重要的發(fā)病機制［7-8］。所以，靶向星形膠質細胞成為當前治療CNS炎癥變性疾病的研究熱點。本實驗中，本課題組重點關注了星形膠質細胞的氧化應激，通過減輕星形膠質細胞的氧化損傷，達到了保護髓鞘的目的。BB是從銀杏葉中提取出的一種安全有效的活性單體［9］，文獻報道了BB對于神經系統(tǒng)的保護作用［10-11］。另外，文獻對BB是否能夠通過血腦屏障進行了論述，在體外實驗中使用血腦屏障滲透率的模型檢測了BB的血腦屏障透過率，體內實驗中使用大鼠模型評估了BB的腦內分布，結果發(fā)現BB可以較好地通過血腦屏障［12］。在之前的研究中發(fā)現，BB具有很好的抗氧化的作用，但是沒有關于BB在靶向星形膠質細胞緩解髓鞘脫失方面的研究。

氧化損傷在多種CNS疾病中起關鍵作用［13］。ROS和RNS的過量產生會導致線粒體功能障礙和細胞死亡［14］，研究發(fā)現在MS等疾病患者的腦內，氧化應激導致ROS等氧化產物增多，與膠質細胞異常活化和神經元損傷有很大的關系［15-16］。因此，減輕氧化應激是治療和預防MS等神經炎癥變性疾病的潛在策略。在機體的抗氧化防御體系中，CAT、GSH-Px和SOD是最常見的抗氧化酶，也是清除ROS、RNS和MDA等氧化產物的重要指標［17］。SOD是活性氧損傷的第一道防線，可降低過高濃度的活性氧物質，并把他們分解為危害較小的過氧化氫和水，保護細胞免受損傷［18］。CAT則通過將過氧化氫分解水和氧分子，進一步對抗氧化損傷［19］。GSH-Px是一種體內抵抗氧化應激過程中重要的過氧化物分解酶，通過把有毒的氧化產物谷胱甘肽催化為無毒的氧化型谷胱甘肽，從而保護細胞免受氧化物的損傷［20］。本研究發(fā)現，BB可增加星形膠質細胞中這些抗氧化酶的表達，其機制可能與激活Nrf2/HO-1抗氧化通路有關?？寡趸男盘柾酚泻芏喾N，Nrf2/HO-1信號通路是其中一條重要的通路［21］。Nrf2是抗氧化反應中不可或缺的調控因子，在正常情況下，其活性被抑制，kelch樣ech相關蛋白1（kelch-like ech-associated protein 1，Keap1）與Nrf2在細胞質中結合，這時Nrf2是處于未激活狀態(tài)；如果一直未激活，Nrf2會被泛素化進而被降解；在氧化應激狀態(tài)下，Nrf2被激活。Nrf2從Keap1中釋放，轉移至細胞核，激活下游抗氧化基因的表達，包括HO-1以及抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD［22-23］。本次研究表明，BB干預促進Nrf2向細胞核內的轉移，促進Nrf2下 游 基 因HO-1及 抗 氧 化 酶CAT、GSH-Px和SOD的表達。研究顯示，通過上調Nrf2和HO-1的表達來保護細胞損傷，對MS等疾病都有神經保護作用［24］。在臨床上，靶向Nrf2的藥物富馬酸二甲酯是治療進展型MS的高效藥物，與其可以透過血腦屏障、減少炎癥細胞遷移、減少細胞的氧化損傷有關，從而可降低患者的復發(fā)率［25］。而BB對星形細胞Nrf2/HO-1信號通路的作用，為其治療MS等脫髓鞘疾病提供了新的理論支持。

大量實驗研究提示氧化應激和脫髓鞘之間存在某種因果關系［25-27］。氧化應激是導致CPZ模型中發(fā)生脫髓鞘病變的主要原因之一。氧化應激可產生過多的氧自由基及其代謝產物，引發(fā)細胞脂質和線粒體損傷，導致髓鞘脫失。在疾病的早期階段，氧化應激是導致腦內脫髓鞘的主要病因，而隨著病情的發(fā)展，體內內環(huán)境的紊亂，使得體內氧化應激和脫髓鞘病變互為因果，使得病情進一步加重［28］。本課題組利用CPZ誘導的中樞脫髓鞘模型，發(fā)現BB干預可有效保護髓鞘脫失，誘導Nrf2/HO-1信號通路，從而增加抗氧化產物形成，抑制氧化應激反應，推測可能與髓鞘保護有關。在此基礎上，利用體外原代星形膠質細胞，驗證了BB干預可誘導星形膠質細胞Nrf2/HO-1信號分子表達，從而增加抗氧化產物形成，抑制氧化應激反應?；谇叭搜芯亢捅疚牡慕Y果，本課題組推測BB干預緩解髓鞘脫失，可能與促進星形膠質細胞Nrf2/HO-1信號通路，產生抗氧化產物，抑制氧化應激有關。但鑒于星形膠質細胞氧化應激與脫髓鞘之間的重要關系，下一步將進行深入的探討。

綜上所述，本實驗表明，BB可以抑制星形膠質細胞的氧化應激反應，可能通過激活Nrf2/HO-1抗氧化通路發(fā)揮髓鞘保護作用，為下一步深入的研究奠定了基礎。