通心絡(luò)對小鼠鈣化性主動(dòng)脈瓣膜病早期病變的影響研究

宗永輝李欣欣張 寧陳 云劉新燦*

(1.濮陽市油田總醫(yī)院,河南 濮陽 457000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué),鄭州 450000；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,鄭州 450000)

鈣化性主動(dòng)脈瓣膜病(calcified aortic valve disease, CAVD)又稱為“退行性”主動(dòng)脈瓣膜病,是目前引起主動(dòng)脈狹窄的最常見原因。 由于CAVD的發(fā)生呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性和被動(dòng)性的鈣沉積,以往很長一段時(shí)間被認(rèn)為是一種退行性病變。 隨著對瓣膜組織病理學(xué)和流行病學(xué)研究的深入,發(fā)現(xiàn)其是一種類似于動(dòng)脈粥樣硬化的主動(dòng)進(jìn)展性疾病。 首先越來越多的證據(jù)顯示CAVD 具有與動(dòng)脈粥樣硬化相同的病理特點(diǎn):脂質(zhì)在內(nèi)皮下的大量堆積,炎癥細(xì)胞的浸潤,內(nèi)皮功能障礙以及鈣化等；其次是在流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)二者之間具有多種危險(xiǎn)因素的重疊,包括:年齡、吸煙、高血壓、糖尿病、高脂血癥和腎功能不全等[1-2]。 這些觀察結(jié)果表明,CAVD 發(fā)病機(jī)制可能與動(dòng)脈粥樣硬化的早期機(jī)制相似,同樣也有被防治的可能。 通心絡(luò)具有多效性作用,是動(dòng)脈粥樣硬化疾病治療中常用的中成藥。 研究表明通心絡(luò)通過劑量依賴型作用在降血脂,抗氧化和抗炎以及調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能障礙等方面與他汀類藥物藥理作用相當(dāng)[3-4]。 基于CAVD 早期發(fā)病機(jī)制與動(dòng)脈粥樣硬化相似,本研究擬通過導(dǎo)絲損傷瓣膜內(nèi)皮機(jī)制建立CAVD 動(dòng)物模型[5-7],在早期階段進(jìn)行中藥通心絡(luò)超微粉干預(yù),嘗試探討通心絡(luò)對CAVD 早期階段脂質(zhì)、炎癥、氧化應(yīng)激等方面的影響,觀察是否能夠延緩CAVD 的進(jìn)展。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取 50 只 10 周齡 SPF 級(jí)雄性 C57BL/6J 小鼠,體重25～28 g,購自鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場[SCXK(豫)2019-0002]。 小鼠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)一附院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心動(dòng)物房[SYXK(豫)2017-0001],室內(nèi)環(huán)境清潔,室溫恒定(22±2)℃,12 h 為明/暗周期,并隨意接受食物和飲用水。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究方案已經(jīng)過河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)(YFYDW2019039),實(shí)驗(yàn)研究過程中對實(shí)驗(yàn)鼠嚴(yán)格遵守3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

總膽固醇(TC) 含量檢測液(BC1980,Elabscience)；蘇木素伊紅(HE) 染色液(G1120,Solarbio)； 髓過氧化物酶檢測液(SEKM-0118,Elabscience)；鈣鹽染色液(改良茜素紅S 法,G3280,Solarbio)； anti-CD68 單 克 隆 抗 體 (K200071 M,Solarbio)；anti-ACTA2 單克隆抗體(K200017 M,Solarbio)；anti-OPN 單克隆抗體(ABclonal)；anti-NOS3 多克隆抗體(K009697P,Solarbio)。 通心絡(luò)超微粉劑,主要成分:人參、水蛭、全蝎、赤芍、蟬蛻、土鱉蟲、蜈蚣、檀香、降香、乳香(制)、酸棗仁(炒)、冰片,均購自以嶺藥業(yè)。

1.3 方法

1.3.1 模型建立

10～12 周齡雄性 C57BL/6J(野生型)小鼠,體重25～28 g,抽取適量1.25%阿佛丁以0.2 mL/10 g劑量麻醉；待小鼠充分麻醉后,用脫毛膏清除頸部及胸前區(qū)(主要為左側(cè)心前區(qū))毛發(fā),然后固定于鼠板上；持手術(shù)剪縱向剪開頸前皮膚,然后持無齒鑷子和止血鉗鈍性分離出右頸動(dòng)脈,并使其充分暴露；預(yù)留2～3 根結(jié)扎線,結(jié)扎遠(yuǎn)端頸動(dòng)脈；右手持穿刺針先45°進(jìn)針后平行血管向前推進(jìn)一段距離,固定穿刺針外鞘后拔出針芯；將雅培直導(dǎo)絲(HITORQUE 0.014’’)沿穿刺鞘管在超聲引導(dǎo)下緩慢送入主動(dòng)脈瓣膜處,前后移動(dòng)50 次后再以每秒2 次的速度旋轉(zhuǎn)100 次。 結(jié)束后退出導(dǎo)絲立即對主動(dòng)脈瓣處行多普勒超聲檢測,確定是否反流。 然后進(jìn)行近段結(jié)扎,在傷口處滴灑2 滴抗生素預(yù)防感染。 假手術(shù)組模型的建立,同樣是鈍性分離右頸動(dòng)脈,送入導(dǎo)絲但不進(jìn)入主動(dòng)脈瓣膜處,其余操作方法相同。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組和給藥

建立模型1 周后將所有動(dòng)物行彩超多普勒檢測主動(dòng)脈流速檢測,除假手術(shù)組(8 只)外把主動(dòng)脈流速相對增加值(上下差值＜10%)相近的組成一組,再在進(jìn)行隨機(jī)分配成4 組分別為:模型組(12 只)、通心絡(luò)大劑量組(10 只)、通心絡(luò)中劑量組(10 只)、通心絡(luò)小劑量組(10 只)。 根據(jù)973 項(xiàng)目關(guān)于通心絡(luò)藥物藥效試驗(yàn)的配置和劑量規(guī)定:依據(jù)動(dòng)物數(shù)量將通心絡(luò)超微粉溶于純水中配制成大中小劑量(中劑量為臨床等效劑量)分別為1.5、0.75、0.38 g/kg,每天灌胃1 次。

1.3.3 多普勒超聲心動(dòng)圖檢測

M 型超聲心動(dòng)圖和彩色多普勒超聲分別檢測左室心功能和主動(dòng)脈瓣狹窄情況。 M 模式下在胸骨旁長軸切面測量左室射血分?jǐn)?shù)。 壁厚測量采用胸骨旁長向M 型和短向M 型。 彩色多普勒模式在胸骨旁長軸和胸骨上切面對主動(dòng)脈瓣峰值流速及反流進(jìn)行成像,超聲探頭角度校正范圍為40°～50°。峰值流速較基線增加15%～50%定義為輕度狹窄,50%～75%定義為中度狹窄,＞75%定義為重度主動(dòng)脈瓣狹窄。 整個(gè)操作過程有1 人獨(dú)自完成,減少個(gè)體間差異性；所有操作方法和檢測結(jié)果都在超聲科老師指導(dǎo)下完成。

1.3.4 血清指標(biāo)檢測

取材后采用腹主動(dòng)脈采血法收集血液,將采集血樣室溫靜置2 h,然后放入離心機(jī)以3500 r/min離心10 min 后分離血清備用,采用比色法檢測血清髓過氧化物酶(MPO)活力和總膽固醇(TC)的濃度。

1.3.5 主動(dòng)脈瓣瓣葉厚度和鈣鹽沉積情況檢測

取新鮮主動(dòng)脈瓣組織,10%中性福爾馬林固定,乙醇梯度脫水,石蠟包埋。 用組織切片機(jī)切3 和5 μm 超薄石蠟切片,分別進(jìn)行HE 染色和茜素紅鈣鹽染色觀察主動(dòng)脈瓣形態(tài)變化和鈣鹽沉積情況。

1.3.6 免疫組化檢測分析

取脫水包埋后主動(dòng)脈瓣組織,切3 μm 超薄石蠟切片,免疫組化SP 法檢測各組標(biāo)本中巨噬細(xì)胞,α-SMA 和OPN 陽性細(xì)胞表達(dá)情況。 采用 Image J 圖像軟件分析切片的陽性染色面積(平均光密度值表示)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(),若數(shù)據(jù)方差齊且符合正態(tài)分布,采用單因素方差分析,當(dāng)數(shù)據(jù)不是正態(tài)分布或方差不相等時(shí),采用Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多普勒超聲心動(dòng)圖檢測結(jié)果

通心絡(luò)灌胃6 周后對各組主動(dòng)脈峰值流速進(jìn)行多普勒超聲檢測。 與假手術(shù)組比較,其它各組主動(dòng)脈瓣峰值流速明顯增加,其中模型組增加最為顯著；與模型組相比,經(jīng)通心絡(luò)干預(yù)后主動(dòng)脈瓣峰值流速明顯降低,而通心絡(luò)1.5 g/kg 組降低最多,如表1 所示。

表1 通心絡(luò)干預(yù)6 周后主動(dòng)脈流速檢測值(,n=8)Table 1 Aortic flow velocity after 6 weeks of Tongxinluo intervention

表1 通心絡(luò)干預(yù)6 周后主動(dòng)脈流速檢測值(,n=8)Table 1 Aortic flow velocity after 6 weeks of Tongxinluo intervention

注:與假手術(shù)組相比,*P＜0.05；與模型組相比,＃P＜0.05；與通心絡(luò) 1.5 g/kg 相比,△P＜0.05。Note. Compared with sham operation group,*P＜0.05. Compared with the model group, ＃P＜0.05. Compared with Tongxinluo 1.5 g/kg,△P＜0.05.

組別Groups假手術(shù)組Sham group模型組Model group通心絡(luò)1.5 g/kg Tongxinluo 1.5 g/kg通心絡(luò)0.75 g/kg Tongxinluo 0.75 g/kg通心絡(luò)0.38 g/kg Tongxinluo 0.38 g/kg主動(dòng)脈流速(m/s)AV Peak velocity 589.77±25.90 1024.98±81.67* 788.36±48.05*＃ 848.68±54.20*＃ 949.73±32.61*＃△

2.2 血清指標(biāo)檢測

通心絡(luò)超微粉灌胃6 周后,檢測各實(shí)驗(yàn)組血清中總膽固醇和髓過氧化物酶的水平,結(jié)果顯示:通心絡(luò)各組血清總膽固醇含量較假手術(shù)組、模型組明顯降低(P＜0.05),表明通心絡(luò)在降低膽固醇方面效果顯著；髓過氧化物酶作為氧化應(yīng)激的來源,以此檢測實(shí)驗(yàn)各組氧化應(yīng)激水平。 與假手術(shù)相比,其它實(shí)驗(yàn)組MPO 活力明顯升高(P＜0.05),但通心絡(luò)干預(yù)各組較模型組MPO 活力顯著下降(P＜0.05),如表2 所示。

表2 血清膽固醇和髓過氧化物酶的變化(,n=8)Table 2 Changes of serum cholesterol and myeloperoxidase

表2 血清膽固醇和髓過氧化物酶的變化(,n=8)Table 2 Changes of serum cholesterol and myeloperoxidase

注:與假手術(shù)組相比,*P＜0.05；與模型組相比,＃P＜0.05；與通心絡(luò) 1.5 g/kg 相比,△P＜0.05。Note. Compared with sham operation group,*P＜0.05. Compared with the model group, ＃P＜0.05. Compared with Tongxinluo 1.5 g/kg,△P＜0.05.

組別Groups假手術(shù)組Sham group模型組Model group通心絡(luò)1.5 g/kg Tongxinluo 1.5 g/kg通心絡(luò)0.75 g/kg Tongxinluo 0.75 g/kg通心絡(luò)0.38 g/kg Tongxinluo 0.38 g/kg總膽固醇(mmol/L)TC 2.43±0.34 2.24±0.26 1.61±0.11*＃ 1.65±0.21*＃ 1.86±0.18*＃髓過氧化物酶(U/L)MPO 47.44±14.50 453.40±63.83* 116.30±28.74*＃ 166.22±29.81*＃ 208.46±35.21*?！?/p>

2.3 各組主動(dòng)脈瓣HE 和茜素紅鈣鹽染色

通過HE 和茜素紅鈣鹽染色分別觀察主動(dòng)脈瓣小葉的形態(tài)變化和鈣鹽沉積情況,如圖1、表3 所示。 HE 染色結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,其它實(shí)驗(yàn)各組主動(dòng)脈瓣小葉海綿層內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂,有不同程度的膠原纖維增(P＜0.05),其中模型組增厚較為明顯,通心絡(luò)干預(yù)各組隨著劑量的增加,主動(dòng)脈瓣增厚和分化程度逐漸減少。

表3 主動(dòng)脈瓣小葉厚度比較(,n=8)Table 3 Comparison of aortic leaflet thickness

表3 主動(dòng)脈瓣小葉厚度比較(,n=8)Table 3 Comparison of aortic leaflet thickness

注:與假手術(shù)組相比,*P＜0.01；與模型組相比,＃P＜0.01。Note. Compared with sham operation group,*P＜0.01. Compared with model group, ＃P＜0.01.

組別Groups假手術(shù)組Sham group模型組Model group通心絡(luò)1.5 g/kg Tongxinluo 1.5 g/kg通心絡(luò)0.75 g/kg Tongxinluo 0.75 g/kg通心絡(luò)0.38 g/kg Tongxinluo 0.38 g/kg主動(dòng)脈瓣葉厚度(μm)Aortic leaflet thickness 23.55±2.11 58.24±2.40* 37.72±1.67*＃ 40.87±1.58*＃ 42.04±1.45*＃

圖1 各組主動(dòng)脈瓣小葉HE 染色Figure 1 HE staining of aortic valve leaflets in each group

茜素紅鈣鹽染色結(jié)果顯示,如圖2 所示,模型組出現(xiàn)少量鈣鹽沉積,通心絡(luò)干預(yù)各組均未出現(xiàn)。

圖2 各組主動(dòng)脈瓣小葉茜素紅鈣鹽染色Figure 2 Alizarin red calcium salt staining of aortic leaflets in each group

2.4 免疫組化檢測分析

CD68 抗體主要用于檢測瓣膜病變部位炎性巨噬細(xì)胞浸潤情況；如圖3 所示,巨噬細(xì)胞主要分布在主動(dòng)脈瓣根部和病變部位瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞下；與假手術(shù)組比,各實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞陽性率均增加,模型組最為顯著；與模型組相比,通心絡(luò)干預(yù)各組其陽性細(xì)胞占比均明顯減少；通心絡(luò)干預(yù)各組隨著劑量增加,瓣膜內(nèi)巨噬細(xì)胞陽性率逐漸減少,但差異不顯著。

圖3 主動(dòng)脈瓣內(nèi)巨噬細(xì)胞免疫組化DAB 染色Note. Compared with sham operation group,*P＜0.05. Compared with model group, ＃P＜0.05.Figure 3 Immunohistochemical DAB staining of macrophages in aortic valve

ACTA2 單克隆抗體標(biāo)記的平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)主要檢測瓣膜肌成纖維的分布；如圖4 所示,假手術(shù)組中幾乎未表達(dá)α-SMA,模型組中陽性細(xì)胞分布向內(nèi)皮下層延伸,并且陽性細(xì)胞分布面積均高于其他各組；通心絡(luò)干預(yù)各組陽性細(xì)胞分布面積較模型組減少但高于假手術(shù)組。

圖4 主動(dòng)脈瓣內(nèi)α-SMA 免疫組化DAB 染色Note. Compared with sham operation group,*P＜0.01. Compared with model group,＃P＜0.01.Figure 4 Immunohistochemical DAB staining of α-SMA in aortic valve

骨橋蛋白(OPN)抗體染色陽性細(xì)胞主要分布在瓣膜病變部位,在所有各組中模型組陽性率最高,通心絡(luò)干預(yù)各組有少量陽性細(xì)胞,但明顯少于模型組,假手術(shù)組僅有極少量陽性細(xì)胞,如圖5所示。

圖5 主動(dòng)脈瓣內(nèi)OPN 免疫組化DAB 染色Note. Compared with sham operation group,*P＜0.01. Compared with model group,＃P＜0.01.Figure 5 Immunohistochemical DAB staining of OPN in aortic valve

3 討論

CAVD 是一個(gè)慢性演變過程,涉及遺傳易感性、內(nèi)皮切應(yīng)力、慢性炎癥、脂質(zhì)沉積和瓣膜鈣化,并以進(jìn)行性纖維化組織重塑和礦化為特征[8-9]。 在初期階段由于機(jī)械和(振蕩)剪切應(yīng)力會(huì)誘發(fā)瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞層(VEC)的內(nèi)皮功能障礙,從而導(dǎo)致脂蛋白在內(nèi)皮下的沉積并引起炎癥細(xì)胞浸潤[10-11]。 基于CAVD 與動(dòng)脈硬化性疾病早期發(fā)病機(jī)制的相似性,他汀類藥物也被應(yīng)用于CAVD 中,非?？上У氖窃诙鄠€(gè)大型臨床研究中被證實(shí)是不能減緩鈣化性瓣膜病的進(jìn)展[12-13],原因可能是干預(yù)時(shí)已經(jīng)進(jìn)展到鈣化不可逆階段。 近年來有研究發(fā)現(xiàn)在CAVD 的早期進(jìn)行他汀藥物的干預(yù)能夠延緩疾病的進(jìn)程[14],而且在疾病早期階段能夠有效延緩病程進(jìn)展這一假設(shè)在其他動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)被驗(yàn)證。 本實(shí)驗(yàn)研究通過超聲引導(dǎo)下導(dǎo)絲損傷瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞,并在早期階段使用通心絡(luò)藥物干預(yù)CAVD 動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn):通心絡(luò)能夠通過抑制炎性巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生,減少超氧化物的氧化應(yīng)激以及抑制瓣膜骨化的信號(hào)通路中主要蛋白的表達(dá)；實(shí)驗(yàn)證實(shí)通心絡(luò)能夠在早期對CAVD的鈣化具有延緩作用。

通心絡(luò)作為心血管疾病中最常用的中成藥已在臨床實(shí)踐中用于治療心絞痛患者十多年了[15],其主要成分包括人參、赤芍、冰片和酸棗仁等。 正是因?yàn)橛啥辔恫菟幒现贫?導(dǎo)致提取物中多種化合物的累積或協(xié)同作用,這也是為什么通心絡(luò)具有包括改進(jìn)內(nèi)皮功能、降脂、抗氧化、血管舒張、抗血栓、抗發(fā)炎、抗凋亡和增強(qiáng)血管生成等多效性作用的原因[16-17]。 例如,通心絡(luò)藥物中的人參,其主要成分為人參皂甙。 據(jù)報(bào)道,人參皂苷Rb1 可有效阻斷高半胱氨酸誘導(dǎo)的豬冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙,超氧陰離子產(chǎn)生和內(nèi)皮一氧化氮合酶下調(diào)[18]；人參皂甙Rb2 能夠降低經(jīng)高脂培養(yǎng)基中3T3-L1 脂肪細(xì)胞的TC 和TG 的水平[19]。 研究發(fā)現(xiàn),赤芍同樣具有抗氧化、血管舒張、抗血小板、降脂和抗炎能力[20-21]。 此外,酸棗仁也具有提升免疫力和降脂的作用。

目前研究表明瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞的破壞是CAVD形成的首要因素[22-23]。 同動(dòng)脈粥樣硬化一樣,CAVD 的觸發(fā)事件是機(jī)械應(yīng)力增加和剪切應(yīng)力減少引起的內(nèi)皮損傷。 剪應(yīng)力改變后的內(nèi)皮損傷允許脂質(zhì)的浸潤,尤其是LDL 和脂蛋白-a(Lp-a),開始將炎癥細(xì)胞招募到瓣膜中。 在手術(shù)切除的鈣化主動(dòng)脈瓣中發(fā)現(xiàn)炎性浸潤主要是有巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞和 CD8+T 細(xì)胞組成[24]。 這些炎癥是先天免疫的主要反應(yīng),發(fā)生在內(nèi)皮細(xì)胞受損后,伴隨著炎癥的激活和脂質(zhì)沉積。 先天性免疫反應(yīng)及其它細(xì)胞和體液反應(yīng)都牽涉到這一過程。 作為對外來生物體、細(xì)胞殘骸或物理刺激物引起的損傷的反應(yīng),先天免疫系統(tǒng)代表了對外部或內(nèi)部觸發(fā)的第一反應(yīng),并啟動(dòng)了組織再生的過程。 一旦炎癥過程被觸發(fā),它將沿著一定的過程進(jìn)行,直到炎癥刺激被根除,愈合機(jī)制可以開始。 然而,如果炎癥源不能被消除,炎癥將會(huì)進(jìn)展,隨著時(shí)間的推移強(qiáng)度不同[25]。 CAVD 中的先天性免疫反應(yīng)最初是由幾種氧化類脂物質(zhì)通過toll 樣受體和NF-κB 途徑引起的。 VICs 表達(dá)TLRs,已知在炎癥和抗原特異性適應(yīng)性免疫反應(yīng)的啟動(dòng)中起關(guān)鍵作用。 TLRs 可以被幾種脂類物質(zhì)激活,特別是ox-LDL,信號(hào)通過特定適配分子的補(bǔ)充進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB[26]。 通過這種方式TLRs 信號(hào)通過核因子NF-κB 途徑調(diào)整炎癥,對維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。 通心絡(luò)不僅能夠下調(diào)TLR4、NF-κB 的表達(dá),而且可以通過抑制血管損傷引起的巨噬細(xì)胞浸潤,分泌炎癥因子TNF-α 下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子 KLF5 而改善新生內(nèi)膜的形成,從而起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用[27],這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

我們的實(shí)驗(yàn)研究和其他人一樣存在不足之處。首先,由于對導(dǎo)絲損傷瓣膜的力度無法做到嚴(yán)格的一致性,導(dǎo)致對瓣膜損傷程度的差異性；對此我們在建立模型時(shí)此部分操作都有同一人完成,同時(shí)根據(jù)術(shù)后瓣膜流速的變化進(jìn)行區(qū)組隨機(jī)分組以保證實(shí)驗(yàn)各組間的可比性。 第二,由于小鼠瓣膜組織較小并且在該實(shí)驗(yàn)中樣本量較少,我們沒有對主要蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析的蛋白質(zhì)印跡分析。 第三,盡管已經(jīng)驗(yàn)證了通心絡(luò)的降脂,抗炎,抗氧化作用對早期CAVD 的影響,但這些作用背后的詳細(xì)分子機(jī)制仍需進(jìn)一步大樣本量驗(yàn)證。