參味寧郁片對三種藥物誘發(fā)動物模型的抗抑郁作用研究

王雅欣郭姍姍高英杰圖 婭崔曉蘭*

(1.中國中醫(yī)科學院中藥研究所,北京 100700； 2.北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院,北京 100029)

抑郁癥已經(jīng)成為近年來嚴重危害人類健康的常見精神類疾病之一,約有3.5 億人正受抑郁癥的困擾[1],重度抑郁癥在全球范圍內(nèi)患病率逐年升高,給公共衛(wèi)生系統(tǒng)帶來極大的負擔[2],然而因其致病因素復雜、臨床表現(xiàn)多樣[3]、發(fā)病年齡跨度較大,且常作為其他疾病的并發(fā)癥,這些因素都極大阻礙了抑郁癥的治療及相關藥物的研發(fā)工作,且常用的抗抑郁藥物通常具有副作用大且病情易復發(fā)等缺點[4],所以近年來的天然抗抑郁藥物逐漸受到廣泛關注[5]。

抗抑郁新藥-參味寧郁片是由郁金、酸棗仁、西洋參、五味子4 味中藥材組成,其中郁金的重量份為600 ～ 1200、酸棗仁為 600 ～ 1200、西洋參為 100 ～600、五味子為 400 ～ 1000。 該藥在 2005 年獲得CFDA 臨床研究批件(批件號:2005L02629),并于2007 年 2 月 獲 國 家 發(fā) 明 專 利 ( 專 利 號:ZL031531040),它作為國內(nèi)首個批準進入臨床試驗的治療抑郁癥的純中藥小復方制劑(6.1 類)能夠調(diào)節(jié)慢性束縛模型大鼠的免疫炎性反應,臨床試驗證實該藥對于治療氣陰兩虛型抑郁癥有顯著療效[6]。

目前關于抑郁癥發(fā)病機制的研究主要有單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說、受體假說、下丘腦-垂體-腎上腺軸假說等[7]。 本次研究主要以單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說為依據(jù)展開,因使用單一抑郁癥模型易產(chǎn)生假陽性或受到主觀偏好的影響,而使用多種抑郁模型進行試驗能更準確判斷藥物的抗抑郁效果[8]。 故本實驗中使用3 種藥物誘發(fā)的不同動物模型來探索參味寧郁片的抗抑郁作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗納入6 周齡雄性SPF 級SD 大鼠60 只,體重 160～180 g；KM 小鼠雄性 120 只,體重 13 ～15 g。 實驗動物均由北京維通利華公司實驗動物中心提供[SCXK(京)2016-0011]。 動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中藥研究所屏障動物實驗設施[SYXK(京)2016-0013],并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。 本實驗中所有操作均遵循國家衛(wèi)生研究院(national institutes of health, NIH)及北京市實驗動物倫理委員會的規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器

受試藥物:參味寧郁片(實驗采用壓片前的藥粉),由郁金、酸棗仁、西洋參、五味子4 味中藥材組成,經(jīng)中國中醫(yī)科學院中藥研究所劑型室提供,批號:030802。 性狀:淺棕色粉末。 陽性對照:百憂解,英國禮來公司產(chǎn)品,批號(98)衛(wèi)藥準字J-23 號。 臨床適應癥:抑郁癥。 劑型:膠囊。 用法用量:20 ～40 mg/d,口服給藥。 實驗試劑:重酒石酸去甲腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品,批號:滬衛(wèi)藥準字(1995) 第 010044 號)；5-羥色胺酸(Sigma 公司產(chǎn)品,批號:035G4672)；鹽酸帕吉林(Sigmag 公司產(chǎn)品,批號:053K3675)；鹽酸色胺(中國醫(yī)藥公司北京采購供應站提供,批號850906)。 實驗儀器:小鼠自主活動記錄儀(DPOT-VARIMEX.3 型,美國產(chǎn)品)；小鼠懸尾平衡支架(自制)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組

將實驗動物進行適應性喂養(yǎng)后采用隨機數(shù)字表(隨機數(shù)字由SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件產(chǎn)生)將大鼠及小鼠分為正常組、模型組、百優(yōu)解組、參味寧郁片高劑量、中劑量組和低劑量組共6 組,每組10 只。

1.3.2 給藥方法

劑量設計:參味寧郁片:人臨床用量為34 g/60(kg·d),即0.57 g/(kg·d),換算成小鼠用量即為3、6、12 g/(kg·d),大鼠用量即為 1.5、3、6 g/(kg·d),均分別相當于人臨床用量的1/2 倍、等倍和2倍。 百憂解:臨床人用量為40 mg/60(kg·d),實驗時小鼠用量為5.2 mg/(kg·d)；大鼠用量為2.6 g/(kg·d)；均為臨床等效用藥量。

給藥方式:小鼠按0.2 mL/10 g 灌胃給藥,大鼠按1 mL/100 g 灌胃給藥。

1.3.3 實驗方法

加強單胺作用實驗-5-HTP 誘發(fā)小鼠甩頭模型[9-10]:各給藥組灌胃給藥,正常、模型組給予等量的生理鹽水,每天1 次,連續(xù)6 d,第7 天除正常對照組外,其余各組動物腹腔注射鹽酸帕吉林100 mg/kg,濃度為 6 mg/mL。 1 h 后給藥 1 次,再過 30 min,尾靜脈注射10 mg/kg 的5-HTP,濃度為0.8 mg/mL,正常對照組給予生理鹽水。 之后立即放入24 cm×15 cm×15 cm 的小鼠箱內(nèi),觀察小鼠每5 min 內(nèi)的甩頭次數(shù),共測定25 min。 5-HTP 誘發(fā)小鼠甩頭模型是預先給予5-HTP 藥物后使外源性5-HT 水平上升進而出現(xiàn)甩頭行為[11]。

抑制NE 重吸收實驗-增強NE 對小鼠的毒性實驗[12]:各給藥組灌胃給藥,正常、模型組給予等量的生理鹽水,每天1 次,給藥量為0.2 mL/10 g,連續(xù)給藥1 周。 除正常對照組外,其余各組于第7 天灌胃1 h 后,皮下注射NE(12 mg/kg),藥物濃度為1.2 mg/mL 然后將小鼠置于塑料籠中,自由飲水、進食。觀察各組小鼠的死亡數(shù),48 h 后統(tǒng)計死亡率,死亡率=(死亡數(shù)/動物總數(shù))×100%。 能夠抑制 NE 重攝取的抗抑郁藥可以顯著提高NE 的濃度,也能增強外源性給予NE 的毒性,此模型主要適用于NE 重攝取抑制劑[13]。

MAO 抑制實驗-對增強色胺引起大鼠驚厥模型的影響:各給藥組灌胃給藥,正常、模型組給予等量的生理鹽水,每天1 次,連續(xù)7 d。 第7 天給藥后除正常組外各組于給藥后1 h 尾靜脈注射新鮮配制的鹽酸色胺溶液(6 組大鼠交叉進行注射)10 mg/kg,濃度為2 mg/mL。 然后逐只觀察前肢特有的陽性反應-陣攣性“蹬踩”運動。 色胺作為單胺氧化酶的底物在大鼠注射后可出現(xiàn)陣攣性驚厥反應,具有單胺氧化酶抑制作用的抗抑郁藥物可增強色胺引起的驚厥作用[14]。

1.4 統(tǒng)計學方法

待實驗結束后,各組數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計,實驗結果均以平均數(shù)±標準差()表示。 組間比較用單因素方差分析,P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義；死亡率統(tǒng)計用χ2檢驗,為降低Ⅰ型錯誤的概率,P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 加強單胺作用實驗——5-HTP 誘發(fā)小鼠甩頭模型

表1 中結果顯示:正常組不出現(xiàn)甩頭現(xiàn)象,與正常組相比,模型組出現(xiàn)明顯的甩頭現(xiàn)象,與模型組相比,各給藥組的甩頭次數(shù)明顯增多,其中低劑量組稍高于高、中劑量組,各給藥組與模型組比較均具有顯著性差異(P＜0.05)。

表1 參味寧郁片對5-HTP 誘發(fā)小鼠甩頭次數(shù)的影響(n=10)Table 1 Effect of Shenwei Ningyu tablets on 5-HTP-induced head-shaking in mice

2.2 抑制NE 重吸收實驗——增強NE 對小鼠的毒性實驗

表2 結果顯示:與正常組相比,皮下注射NE(12 mg/kg)后模型組小鼠的死亡率為10%,與模型組相比,參味寧郁片各給藥組小鼠的死亡率均明顯增加,其中低劑量組為60%,與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。

表2 參味寧郁片增強NE 對小鼠的毒性實驗(n=10)Table 2 Effect of Shenwei Ningyu tablets on enhancing the toxicity of NE in mice

2.3 MAO 抑制實驗——對增強色胺引起大鼠驚厥模型的影響

表3 結果顯示:正常組動物不出現(xiàn)“蹬踩”運動,與正常組相比,模型組的動物可出現(xiàn)明顯的“蹬踩”運動。 與模型組相比,各給藥組動物造模后的“蹬踩”運動次數(shù)較模型組雖有明顯增多,但并無顯著性差異(P＞0.05)。

表3 參味寧郁片對增強色胺引大鼠驚厥試驗的影響(n=10)Table 3 Effects of Shenwei Ningyu tablets on enhancing tryptamine-induced convulsion test in rats

3 討論

抑郁癥是一種病因復雜的精神類疾病,目前關于其發(fā)病機制的研究主要集中在中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如5-HT、NE 和多巴胺(DA)等方面[15],大多數(shù)抗抑郁藥可通過抑制單胺類遞質(zhì)重吸收、抑制MAO活性等方式體現(xiàn)藥效[16]。 5-HT 作為一種常見的單胺類神經(jīng)遞質(zhì),在神經(jīng)元中常參與包括情緒、睡眠及認知功能等方面的調(diào)控[17],早在19 世紀50 年代就有臨床實驗發(fā)現(xiàn)與正常人相比抑郁癥患者腦內(nèi)缺乏5-HT[18],因此如何抑制5-HT 在患者腦內(nèi)的代謝過程成為治療抑郁癥的關鍵環(huán)節(jié)。

鑒于參味寧郁片抗抑郁的具體機制尚不明確,本研究通過建立3 種不同的動物模型對參味寧郁片的抗抑郁作用進行初步探索。 在5-HT 誘發(fā)小鼠甩頭模型中,與模型組相比,參味寧郁片3 個劑量組的甩頭次數(shù)均有所增多,其中小劑量組甩頭次數(shù)最多,其次,在增強NE 對小鼠的毒性實驗中,與模型組比較各給藥組小鼠的死亡率均明顯增加,其中低劑量組具有顯著性差異,此外,在增強色胺引大鼠驚厥模型的實驗中,各給藥組動物造模后的“蹬踩”運動次數(shù)較模型組均有一定程度的增加,但與模型組比較并無顯著性差異。

在小鼠甩頭模型及小鼠毒性實驗的研究中發(fā)現(xiàn)參味寧郁片低劑量組具有更明顯的抗抑郁作用,這可能由以下兩方面原因?qū)е?其一是有些中藥材隨著用量的加大會影響甚至改變其臨床療效[19],因此可能是導致本實驗中量效關系不明顯的因素之一。 其次是高濃度的藥液可能會影響機體對藥物有效成分的吸收從而影響藥效,與高劑量組相比,如果低劑量組在確保療效的基礎上更容易增加機體對其有效成分的利用度,那么低劑量組可能具有更顯著的療效。

以上實驗結果顯示參味寧郁片可能是通過作用于NE 能系統(tǒng)、阻斷中樞5-HT 等單胺類遞質(zhì)的重攝取使5-HT 增多等兩個方面發(fā)揮抗抑郁作用,對于該藥是否具有MAO 抑制作用的抗抑郁藥效還有待進一步研究。