金釵石斛對MPTP 誘導(dǎo)PD 小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究

王孟迪魏山山姜 寧Alberto Carlos Pires Dias劉新民*王 瓊*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中葡中醫(yī)藥國際合作中心藥學(xué)院,四川瀘州 646000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理研究中心,北京 100193；4.葡萄牙米尼奧大學(xué)分子和環(huán)境生物學(xué)中心生物系中葡食藥資源研究中心,葡萄牙布拉加, 4710-057)

帕金森病(Parkinson’s diseases, PD),又稱震顫麻痹(paralysis agitans),是一種常見的神經(jīng)退行性疾病,其典型的臨床表現(xiàn)包括靜止性震顫、運動遲緩、姿勢失衡和步態(tài)障礙等[1]。 黒質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性壞死以及α-突觸核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)為主要成分的路易小體(lewy’s body,LB)的形成是PD 的特征性病理表現(xiàn)[2]。 目前關(guān)于PD 發(fā)病的具體分子機(jī)制尚不清楚,已有的研究認(rèn)為PD與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[3-5]。至今,PD 的臨床治療仍然以藥物為主,主要包括左旋多巴、單胺氧化酶B(monoamine oxidase-B,MAOB)抑制劑、NMDA 受體阻滯劑和抗膽堿能藥物等[6]。 這類藥物可有效緩解PD 癥狀,但長期治療仍會引起諸多副作用,如姿勢不穩(wěn)、自主神經(jīng)功能紊亂等,嚴(yán)重危害身體健康[7]。 因此迫切需要研發(fā)安全、有效、副作用小的防治PD 藥物。

中醫(yī)藥在防治 PD 方面有著豐富的臨床經(jīng)驗[8],且中藥具有多環(huán)節(jié)、多靶點的藥理特點,可為PD 治療提供新思路。 PD 在中醫(yī)學(xué)理論中,癥見頭搖、手足動搖為主者可屬“顫證”范疇[9]。 金釵石斛(Dendrobium nobileLindl,DNL)又名金釵石、扁金釵、扁黃草等,味甘、微咸、無毒,主要以新鮮或干燥莖入藥,主產(chǎn)于貴州、云南等地[10]。 2010 年版《中國藥典》中已明確將金釵石斛作為藥用石斛的首要來源[11]。 現(xiàn)代藥理研究分析,金釵石斛的主要化學(xué)成分為生物堿、多糖、氨基酸、酚類、揮發(fā)油等,尤其是生物堿和多糖在抗腫瘤、降血糖以及對神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面都具有顯著的改善作用[12]。 金釵石斛提取物能有效改善小鼠抑郁模型的行為學(xué)表現(xiàn),顯著提高小鼠腦內(nèi)的DA 和5-HT[13],金釵石斛生物總堿可以改善脂多糖誘導(dǎo)大鼠海馬tau 蛋白的高度磷酸化和炎癥反應(yīng),減輕海馬周圍神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[14]；此外,段燦燦等[15]通網(wǎng)絡(luò)藥理分析途徑,篩選到金釵石斛活性成分47 個,作用靶點88 個,富集帕金森、阿爾茨海默癥及精神、記憶障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病,從系統(tǒng)層面揭示了金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制。 因此,金釵石斛在防治帕金森病中具有很大的潛力。

在本研究中,我們采用1-甲基-4 苯基-1,2,3,6-四氨吡啶(MPTP) 制備經(jīng)典的亞急性 PD 小鼠模型,探究金釵石斛提取物對 PD 小鼠的作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

66 只 8 ～ 10 周齡,體重 18 ～ 20 g,SPF 級C57BL/6J 雄性小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2021-0006]。 實驗期間喂養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所SPF 級實驗動物房[SYXK(京)2017-0020],自由供給標(biāo)準(zhǔn)飼料和純凈水,保持 12 h 光照(9:00 ～21:00)和 12 h 黑暗(21:00～次日9:00)交替循環(huán),室溫20℃～23℃,濕度(55±10)%。 動物適應(yīng)環(huán)境5 d 后開始實驗。實驗過程嚴(yán)格遵守3R 原則,并遵循本所實驗動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定(SLXD-2021052119)。

1.2 主要試劑與儀器

金釵石斛生藥購自四川瀘州合江鳳鳴,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所張本剛研究員鑒定為金釵石斛。

MPTP 購自美國 Sigma 公司(規(guī)格:100 mg)；美多芭購自上海羅氏制藥有限公司(規(guī)格:0.25 g,產(chǎn)品批號:SH5146)；小鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6 和 IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物公司；caspase-3、 caspase-9 和 β-Actin 抗 體 均 購 自 CST 公 司(caspase-3 產(chǎn)品編號:9664,caspase-9 產(chǎn)品編號:9509,β-Actin 產(chǎn)品編號:4967)；HRP 羊抗兔 IgG、HRP 羊抗鼠IgG 等二抗購自Jackson 公司。

步態(tài)計算機(jī)圖像實時檢測分析處理系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所、中國航天員科研訓(xùn)練中心、北京鑫海儀技術(shù)公司聯(lián)合研制)；小鼠自主活動實時檢測分析系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所、中國航天員中心、北京康森益友科技有限公司共同研制作)；AL104 電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；高速勻漿機(jī)(上海凈信)；臺式高速冷凍離心機(jī)(湘立離心機(jī))；全自動酶標(biāo)儀(美國,BIOTEK 有限公司)；自制小鼠爬桿等。

1.3 方法

1.3.1 金釵石斛提取物的制備

稱取金釵石斛莖干粉與80%酸性乙醇按1 ∶10的料液比混合浸泡1 夜,85℃條件下回流提取3 次后合并提取液,濃縮得到浸膏,干燥、粉碎后的褐色粉末即為金釵石斛提取物。

1.3.2 帕金森小鼠模型的建立及分組

適應(yīng)期結(jié)束后,將小鼠隨機(jī)分為6 組:對照組、模型組、美多芭組(112.5 mg/kg)、DNL 低劑量(100 mg/kg)組、DNL 中劑量(200 mg/kg)組和 DNL 高劑量(300 mg/kg)組,各組小鼠分籠群養(yǎng),每籠4 只,每組10～12 只。 除對照組以外,各組小鼠每天在固定時間進(jìn)行腹腔注射(i.p)MPTP 30 mg/kg,每天1 次,連續(xù)7 d,建立亞急性PD 模型。 對照組小鼠i.p 給予相同體積生理鹽水。 美多芭組與DNL(100、200、300 mg/kg)組造模前14 d 進(jìn)行灌胃(i.g)預(yù)給藥,造模期間持續(xù)每天灌胃給藥直到取材結(jié)束,對照組和模型組灌胃予以相同體積純水。 造模完成后次日進(jìn)行行為學(xué)檢測,實驗流程見圖1。

圖1 實驗流程Figure 1 Experimental procedure

1.3.3 步態(tài)分析實驗(gait analysis,GA)

步態(tài)分析實驗主要用于動物運動能力及運動協(xié)調(diào)性的評價[16]。 開始實驗前5 d,每天對小鼠進(jìn)行不少于3 次訓(xùn)練,以確保動物可從檢測通道的一端不間斷地跑到另一端。 正式檢測前調(diào)試軟件參數(shù),保證小鼠足印在采集圖像窗口中清晰可見。 檢測時,將小鼠的足部沾水,使小鼠連續(xù)通過跑臺,此時高頻攝像機(jī)記錄下步態(tài)錄像。 錄制完成的視頻通過計算機(jī)分析軟件進(jìn)行分析,并統(tǒng)計步態(tài)指標(biāo)。每只小鼠重復(fù)測量3 次,取平均值進(jìn)行分析。

1.3.4 爬桿實驗

爬桿實驗主要用于模型動物運動能力評價[17]。自制一根長69 cm,直徑為1 cm 的鐵桿作為小鼠實驗爬桿,將直徑25 cm 的軟木質(zhì)小球固定在爬桿頂部,爬桿上纏上醫(yī)用膠帶以防打滑。 檢測時,將每只小鼠頭朝上放置在球頂使其自動爬下,以小鼠雙前肢接觸爬桿底部平臺為爬完全長,記錄以下時間:小鼠頭向上至頭向下的時間(調(diào)頭時間),小鼠爬完桿子上半部分所需時間,小鼠爬完桿子下半部分所需時間,爬完全桿所需的總時間。 每只小鼠重復(fù)測量3 次,取平均值進(jìn)行分析。

1.3.5 懸掛實驗

懸掛實驗參照Kuribara 等[18]的操作方法,準(zhǔn)備一根離地面約36 cm 的電線,將小鼠前肢懸掛于水平電線上,評分方法如下:小鼠四爪抓住電線則記3分,用一后爪抓住電線記2 分,如果小鼠兩后爪均抓不住電線則記1 分,無法抓住而掉落記0 分。

1.3.6 空場實驗(the open-feild test, OFT)

空場實驗用于檢測小鼠的自主活動情況[19]。先將小鼠背對測試箱壁輕輕放入測試箱(30 cm×30 cm×35 cm),適應(yīng)3 min 后開始檢測,計算機(jī)自動監(jiān)測記錄小鼠10 min 內(nèi)在測試箱中的自發(fā)活動情況,如總路程、運動時間、運動速度等指標(biāo)。

1.3.7 小鼠腦組織分離

末次行為學(xué)實驗結(jié)束后,小鼠處死后迅速斷頭,于冰上取腦,分離紋狀體、皮層腦組織,-80℃條件下保存。

1.3.8 ELISA 法檢測紋狀體、皮層部位炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量

將腦組織進(jìn)行冰上勻漿裂解,12000 r/min 離心30 min,收集上清。 ELISA 操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.9 Western blot 法檢測紋狀體中 caspase-3 和caspase-9 蛋白的表達(dá)

將各組腦組織加入蛋白裂解液勻漿,4℃條件下12000 r/min 離心 15 min 后,取上清液,按 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,分裝,-80℃凍存待用。 按每孔30 μg 蛋白上樣量配制樣品,加入SDSPAGE 上樣緩沖液配置最終樣品。 凝膠蛋白電泳條件:濃縮膠恒壓90 V,約20 min；分離膠恒壓120 V。轉(zhuǎn)膜條件:300 mA 恒流；0.45 μm 孔徑 PVDF 膜,轉(zhuǎn)膜時間60 min。 室溫封閉1 h 后用抗體稀釋液稀釋caspase-3 和 caspase-9 一抗(1 ∶1000),4℃水平搖床孵育過夜。 用抗體稀釋液稀釋山羊抗兔IgG(H+L)HRP(1 ∶0 ∶10),室溫孵育 1 h。 用 ECL 化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行檢測觀察,使用IPP 6.0 圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21. 0 對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,圖形以GraphPad Prism 6.02 軟件制作。 組間差異的顯著性采用單因素方差分析(one-way ANOVA),P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金釵石斛對PD 小鼠步態(tài)功能的影響

結(jié)果如表1 所示,在步寬指標(biāo)中,各組之間的前肢步寬和后肢步寬沒有顯著性差異(P＞0.05)。 在推進(jìn)指數(shù)和支撐時相指標(biāo)中,模型組與對照組相比,左后推進(jìn)指數(shù)、右前推進(jìn)指數(shù),右后推進(jìn)指數(shù)、左后支撐時相、右前支撐時相、右后支撐時相等步態(tài)指標(biāo)均有顯著差異(P＜0.01,P＜0.001),而左前推進(jìn)指數(shù)和左前支撐時相均沒有顯著性差異(P＞0.05)。 與模型組比較,美多芭組、DNL(100、200、300 mg/kg)劑量組在左后推進(jìn)指數(shù)均有明顯恢復(fù)(P＜0.001),DNL(100、200、300 mg/kg)劑量組在右前推進(jìn)指數(shù)(P＜0.05,P＜0.01)和右后推進(jìn)指數(shù)均有明顯恢復(fù)(P＜0.01)。 與模型組相比,美多芭組、DNL(200、300 mg/kg)劑量組在左后支撐時相和右前支撐時相中有明顯減少(P＜0.05,P＜0.01)。 與模型組相比,美多芭組在右后支撐時相中有明顯改善(P＜0.05,P＜0.01),DNL(100、200、300 mg/kg)劑量組與模型組相比有一定程度的改善趨勢但無顯著性差異(P＞0.05)。

表1 DNL 對PD 小鼠步態(tài)功能的影響(,n=10～11)Table 1 Effect of DNL on gait function in PD mice

表1 DNL 對PD 小鼠步態(tài)功能的影響(,n=10～11)Table 1 Effect of DNL on gait function in PD mice

注:與對照組相比,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001；與模型組相比,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01,＃＃＃P＜0.001。Note. Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001. Compared with model group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01,＃＃＃P＜0.001.

步態(tài)指標(biāo)Gait indicators對照組Control模型組Model美多芭組Madopar金釵石斛組DNL 100 mg/kg 200 mg/kg 300 mg/kg前肢步寬(cm)Forepaw track width 1.36±0.38 1.39±0.59 1.10±0.26 1.17±0.41 1.24±0.43 1.21±0.43后肢步寬(cm)Hindpaw track width 1.65±0.68 2.47±0.66 1.50±0.42 1.76±0.31 1.92±0.52 1.62±0.45左前推進(jìn)指數(shù)Lf propulsion index 0.39±0.12 0.62±0.18 0.48±0.08 0.47±0.05 0.46±0.07 0.46±0.08左后推進(jìn)指數(shù)Lh propulsion index 0.50±0.06 0.73±0.06*** 0.55±0.03＃＃＃ 0.51±0.01＃＃＃ 0.53±0.01＃＃＃ 0.54±0.04＃＃＃右前推進(jìn)指數(shù)Rf propulsion index 0.46±0.05 0.65±0.13** 0.50±0.04 0.46±0.04＃＃ 0.47±0.06＃ 0.46±0.05＃＃右后推進(jìn)指數(shù)Rf propulsion index 0.47±0.12 0.66±0.04*** 0.56±0.03 0.52±0.07＃＃ 0.53±0.04＃＃ 0.57±0.07＃＃左前支撐時相Lf duty cycle 0.39±0.15 0.53±0.08 0.47±0.15 0.44±0.10 0.44±0.09 0.40±0.08左后支撐時相Lh duty cycle 0.45±0.08 0.55±0.05* 0.44±0.03＃＃ 0.49±0.07 0.43±0.04＃＃ 0.45±0.06＃＃右前支撐時相Rf duty cycle 0.45±0.16 0.63±0.16** 0.45±0.04＃＃ 0.46±0.07 0.40±0.07＃＃ 0.39±0.09＃＃右后支撐時相Rh duty cycle 0.49±0.13 0.66±0.13** 0.45±0.04＃＃ 0.51±0.05 0.54±0.08 0.55±0.09平均步行周期(s)Average step cycle 0.24±0.08 0.30±0.07 0.23±0.06 0.26±0.08 0.25±0.05 0.23±0.05

在平均步行周期指標(biāo)中,模型組與對照組相比有上升趨勢,各給藥組與模型組相比有下降趨勢,但無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 金釵石斛對PD 小鼠爬桿時間和懸掛評分的影響

如表2 所示,在爬桿實驗中,與對照組比較,模型組的上半段時間、總時間均增加(P＜0.01,P＜0.001),掉頭時間和下半段時間無明顯變化(P＞0.05)。 與模型組相比,DNL(300 mg/kg)組的爬桿上半段時間指標(biāo)下降(P＜0.01),下半段時間、掉頭時間和總時間無顯著性差異(P＞0.05)。 在懸掛評分實驗中,模型組與對照組比較,懸掛評分明顯下降(P＜0.05)。 與模型組相比,DNL(300 mg/kg)組的評分增加具有顯著性差異(P＜0.05),美多芭組、DNL(100、200 mg/kg)組評分有一定的增加趨勢但無顯著性差異(P＞0.05)。

表2 金釵石斛對PD 小鼠爬桿時間和懸掛評分的影響(,n=10～11)Table 2 Effects of DNL on climbing time and the score of the suspension test of PD mice

表2 金釵石斛對PD 小鼠爬桿時間和懸掛評分的影響(,n=10～11)Table 2 Effects of DNL on climbing time and the score of the suspension test of PD mice

注:與對照組相比,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001；與模型組相比,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01。Note. Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001. Compared with model group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.

組別Groups調(diào)頭時間(s)Turn round time上半段時間(s)First half of time下半段時間(s)Second half of time總時間(s)Total time懸掛評分Score對照組 Control 0.97±0.04 4.03±0.83 5.93±0.81 9.96±1.10 2.70±0.48模型組 Model 0.98±0.03 6.13±0.99*** 6.73±0.91 12.86±1.16** 1.70±0.48*美多芭組 Madopar 0.98±0.02 5.74±0.79 6.66±1.07 12.40±1.18 2.11±0.78金釵石斛組DNL 100 mg/kg 0.96±0.04 5.39±1.24 6.12±1.68 11.51±2.66 2.45±0.68 200 mg/kg 0.98±0.03 5.15±0.88 5.66±1.17 10.81±1.66 2.55±0.52 300 mg/kg 0.99±0.01 5.02±1.00＃ 6.63±0.70 11.66±1.42 2.63±0.67＃＃

2.3 金釵石斛對PD 小鼠空場實驗的影響

在空場實驗中,如表3 所示,與對照組相比,模型組在運動總路程、運動時間、平均速度、僵滯時間比率上均有顯著性差異(P＜0.05)。 與模型組相比,美多芭組,DNL(100、200、300 mg/mL)組各項指標(biāo)均無顯著性差異(P＞0.05)。

表3 金釵石斛對PD 小鼠空場實驗的影響(,n=10～11)Table 3 Effects of DNL on the open-feild test of PD mice

表3 金釵石斛對PD 小鼠空場實驗的影響(,n=10～11)Table 3 Effects of DNL on the open-feild test of PD mice

注:與對照組相比,*P＜0.05。Note. Compared with control group,*P＜0.05.

組別Groups總路程(cm)Total distance運動時間(s)Time of movement平均速度(cm/s)Speed of movement僵滯時間比率(%)Ratio of stagnation time對照組 Control 3750.05±490.98 192.66±38.09 6.25±0.81 67.90±6.35模型組 Model 3188.43±647.56* 154.05±45.85* 5.31±1.08* 74.33±7.64*美多芭組 Madopar 3342.14±479.48 158.42±34.41 5.57±0.80 73.61±5.73金釵石斛組DNL 100 mg/kg 3172.60±494.68 150.43±37.41 5.29±0.82 74.94±6.24 200 mg/kg 3126.48±356.65 141.40±25.64 5.21±0.60 76.45±4.27 300 mg/kg 3215.28±699.36 151.42±59.79 5.36±1.17 74.78±9.97

2.4 金釵石斛對PD 小鼠腦組織炎癥因子水平的影響

通過前期的行為學(xué)實驗,我們認(rèn)為DNL 各劑量中300 mg/kg 劑量效果最佳,因此僅選擇DNL(300 mg/kg)進(jìn)行后續(xù)的研究。 ELISA 檢測結(jié)果如圖2所示,與對照組相比, 模型組小鼠紋狀體區(qū)炎癥因子 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平升高 (P＜0.001) 。 與模型組相比,美多芭、DNL(300 mg/kg)各指標(biāo)顯著下降(P＜0.05,P＜0.01)。 在皮層區(qū),各組間炎癥因子水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖2 金釵石斛對PD 小鼠腦組織TNF-α、IL-6、IL-β 水平的影響(,n=7)Note. A,TNF-α levels in striatum. B,TNF-α levels in cortex. C,IL-6 levels in striatum. D,IL-6 levels in cortex. E,IL-β levels in striatum. F,IL-β levels in cortex. Compared with control group,***P＜0.001. Compared with model group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.Figure 2 Effects of DNL on TNF-α,IL-6,IL-β levels in PD mice brain

2.5 金釵石斛對小鼠紋狀體中 caspase-3 和caspase-9 蛋白的表達(dá)的影響

免疫印跡結(jié)果如圖3 所示,對照組中caspase-3和caspase-9 蛋白的表達(dá)量較少,與對照組相比,模型組中caspase-3 和caspase-9 蛋白的表達(dá)量明顯增多(P＜0.001)；與模型組相比,美多芭組和 DNL(300 mg/kg)組中 caspase-3 和 caspase-9 蛋白的表達(dá)均有顯著下降(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001)。

圖3 金釵石斛對PD 小鼠紋狀體中caspase-3 和caspase-9 蛋白的表達(dá)的影響(,n=3)Note. Compared with control group,***P＜0.001. Compared with model group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01,＃＃＃P＜0.001.Figure 3 Effects of DNL on the expression of caspase-3 and caspase-9 proteins in the striatum of PD mice

3 討論

帕金森病是一種由多種環(huán)境因素、生物因素介導(dǎo)的慢性神經(jīng)退行性疾病,在60 歲以上人群中患病率達(dá)1%[20]。 為了深入研究 PD 的病因及治療方法,研究者們根據(jù)疾病的病理特點制作了不同的動物模型,其中MPTP 模型是目前最常用的神經(jīng)毒素模型之一,具有較長的研究歷史。 MPTP 能夠引起黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的變性,氧化應(yīng)激反應(yīng)和線粒體功能障礙,能夠較好地模擬PD 的臨床表現(xiàn)和病理學(xué)特征[21]。 因此,在本研究我們采用腹腔注射給與MPTP 30 mg/kg 連續(xù)7 d 誘導(dǎo)的小鼠亞急性PD 模型來評價DNL 的藥效。 造模小鼠均在膜腔注射給予MPTP 后5～30 min 出現(xiàn)靜止性震顫、立毛、弓背、行動減緩、聚集成團(tuán)等現(xiàn)象,與參考文獻(xiàn)[22]報道一致,提示腹腔注射給與MPTP 可成功建構(gòu)PD 模型。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,金釵石斛生物堿具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用,Li 等[23]發(fā)現(xiàn)金釵石斛生物堿可以顯著改善6-OHDA 誘導(dǎo)的PD 大鼠中腦黑質(zhì)DA神經(jīng)元丟失以及降低6-OHDA 誘導(dǎo)的原代大鼠中腦神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞中促炎因子的釋放。 石斛堿是金釵石斛中含量最高的倍半萜類生物堿,具有顯著的生物活性[24],可顯著改善PD 癥狀保護(hù)DA 能神經(jīng)元。 此外,研究表明金釵石斛中的有效活性成分槲皮素可保護(hù)機(jī)體免受神經(jīng)毒性化學(xué)物質(zhì)的侵害,并可防止神經(jīng)元損傷和神經(jīng)變性的進(jìn)化和發(fā)展[25]。Singh 等[26]發(fā)現(xiàn)給予槲皮素可減輕鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的動物認(rèn)知障礙。 槲皮素還可以通過激活PINK1-Parkin 線粒體吞噬通路改善6-OHDA 誘導(dǎo)的PD 模型的線粒體質(zhì)量控制并保護(hù)DA 神經(jīng)元,改善6-OHDA 處理下PC12 細(xì)胞線粒體功能障礙,降低氧化應(yīng)激水平[27]。 結(jié)合種種研究證據(jù),我們認(rèn)為金釵石斛在防治PD 藥物研發(fā)方面具有較大的潛力,因此選擇金釵石斛醇提物作為干預(yù)藥物,探究其神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究選擇爬桿實驗、懸掛實驗、步態(tài)分析實驗和空場實驗來評價動物的行為學(xué)指標(biāo)。 爬桿實驗和懸掛實驗是PD 動物模型公認(rèn)、經(jīng)典、常用的行為學(xué)檢測方法,對動物的協(xié)調(diào)性具有較好的檢測效果[18,28]。 在爬桿實驗中,小鼠在爬桿頂部調(diào)頭至爬桿上半段時,需要調(diào)整姿勢和方向,該動作能反映肢體的抓握調(diào)遣和協(xié)調(diào)能力,總時間可評估動物總體的運動速度和四肢協(xié)調(diào)性,因此常用于評價 PD小鼠的運動功能。 本實驗中發(fā)現(xiàn),MPTP 模型組小鼠在爬桿上半段時間、總時間與對照組相比均有顯著延長,表明腹腔注射給與MPTP 使小鼠肢體運動協(xié)調(diào)能力受到一定程度的損害,而300 mg/kg 的DNL 對這種損傷起到了一定的恢復(fù)作用。 同樣,模型組懸掛評分顯著降低,提示小鼠肢體運動協(xié)調(diào)能力受損,DNL(300 mg/kg)同樣可以顯著恢復(fù)這種受損現(xiàn)象。

步態(tài)分析實驗是一種評價神經(jīng)系統(tǒng)運動行為高度敏感的檢測方法[16],本研究采用自主研制的大小鼠步態(tài)分析系統(tǒng),已在前期的課題中得到驗證[29],目前國內(nèi)已有文獻(xiàn)報道將該系統(tǒng)應(yīng)用于小鼠帕金森步態(tài)行為的研究[30]。 推進(jìn)指數(shù)是指推進(jìn)時長/支撐時長,用來描述動物肢體離地,在行走過程中足跡面積逐漸變小的過程。 該指標(biāo)在一定程度上能反映動物行走時肢體肌力的情況。 在本實驗中,模型組的推進(jìn)指數(shù)出現(xiàn)異常,提示模型動物的肢體推動能力下降,需要靠更大的肌力代償。 步行周期分為支撐相和擺動相,支撐時相指一個步行周期里,動物肢體支撐時長與步行周期的比例,步行周期的異常提示動物行走整體功能出現(xiàn)障礙,導(dǎo)致步行時間減少,肢體與地面接觸時間增加。 在本實驗中,與對照組相比,雖然模型組的步行周期沒有顯著性差異,但有增高趨勢,提示該模型已經(jīng)出現(xiàn)步行異常,步行速度下降從而使動物各肢體支撐時長上升,美多芭和DNL(300 mg/kg)均可不同程度地改善PD 小鼠步態(tài)指標(biāo)的異常。

近年來研究表明,炎癥反應(yīng)參與了PD 的發(fā)生發(fā)展[31]。 MPTP 腹腔注射可使小鼠紋狀體內(nèi)TNF-α[32]、IL-6[33]、IL-1β[34]等促炎因子表達(dá)量增加, 并伴有膠質(zhì)細(xì)胞的增生[35]。 反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞增生是PD 炎癥假說中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),有研究發(fā)現(xiàn)PD 模型小鼠黒質(zhì)致密部小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)明顯增生,并產(chǎn)生了大量 TNF-ɑ 和 IL-1β,后兩者加速了 DA 神經(jīng)元的變性和死亡,繼而引起了神經(jīng)遞質(zhì)DA 的生成的減少[36-37],因此,恢復(fù)因過度炎性反應(yīng)引起的DA 神經(jīng)元損傷是改善PD 的一個重要途徑。 本研究結(jié)果顯示,在 MPTP 模型組紋狀體中 TNF-α、IL-6、IL-1β水平及表達(dá)與對照組相比組顯著升高,DNL(300 mg/kg)給藥組小鼠紋狀體中的炎性因子指標(biāo)相對于模型組均有所下降,說明DNL 對MPTP 引起的紋狀體神經(jīng)炎癥同樣發(fā)揮抑制作用。 而在皮層區(qū)卻并未觀察到這一現(xiàn)象,這提示不同腦區(qū)對MPTP 可能存在不同的免疫反應(yīng)。

PD 的發(fā)生發(fā)展還與神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān),過度的細(xì)胞凋亡會嚴(yán)重影響神經(jīng)功能。 caspase 家族基因是控制凋亡的重要原件之一,當(dāng)細(xì)胞凋亡途徑激活,caspase-3 蛋白磷酸化,細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段[38]。 在本實驗中,與對照相比,模型組小鼠caspase-3 和caspase-9 蛋白表達(dá)量增高,表明MPTP使小鼠腦組織的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡；相比模型組,美多芭、DNL(300 mg/kg)給藥組小鼠caspase-3 和caspase-9 蛋白表達(dá)水平均顯著降低,提示DNL 可能是通過降低caspase-3 和 caspase-9 蛋白表達(dá)水平的途徑來抑制細(xì)胞凋亡對PD 動物模型的影響,更具體的作用機(jī)理有待我們下一步的研究。

綜上所述,金釵石斛提取物對MPTP 誘導(dǎo)的PD模型小鼠具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用,可緩解運動障礙,降低 TNF-α、IL-6、IL-1β、caspase-3 和 caspase-9蛋白表達(dá)水平,其作用機(jī)制可能是通過抑制炎癥反應(yīng), 減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡的途徑來實現(xiàn)的。