柳州市柑橘黃龍病發(fā)生情況調(diào)查

歐陽雪 沈峰杰 蒙菲菲 陳柳裕 黃祖元 莫榮清 韋俊平

（1廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院柳州分院/柳州市農(nóng)業(yè)科學研究中心，廣西柳州 545003；2柳州市柳南區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)農(nóng)服中心，廣西柳州 545007；3融水苗族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，廣西融水 545300；4柳州市柳江區(qū)三都鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術推廣站，廣西柳州 545100）

中國是最大的柑橘生產(chǎn)國，廣西是我國柑橘主產(chǎn)省份之一，擁有悠久的栽培歷史[1-2]。近年來，廣西柑橘產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展壯大，2015—2019年廣西柑橘產(chǎn)量連續(xù)5年居全國之首，成為我國柑橘產(chǎn)量最大的主產(chǎn)區(qū)[3]。柳州市作為廣西柑橘產(chǎn)業(yè)主產(chǎn)區(qū)之一，全市栽培有砂糖橘、柳城蜜橘、沃柑等幾十個品種。隨著農(nóng)業(yè)種植結構的深入調(diào)整，柑橘產(chǎn)量在柳州市水果產(chǎn)量中比重逐年增加。據(jù)統(tǒng)計，2020年柳州市柑橘種植面積達到6.4萬hm2，產(chǎn)量達到91萬t，占全市水果產(chǎn)量的78%。柑橘已經(jīng)成為柳州市農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展的主導農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)，是農(nóng)民增收、脫貧致富的重要手段。

柳州市柑橘產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷發(fā)展的同時，也面臨諸多不利因素的制約，其中柑橘黃龍病是威脅柑橘產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的首要因素[1]。據(jù)了解，廣西是柑橘黃龍病的老發(fā)生區(qū)，每年因柑橘黃龍病造成減產(chǎn)約為50萬t，損失約10億元[4-5]。柑橘黃龍病是一種由僅能寄生于韌皮部篩管組織內(nèi)的革蘭氏陰性細菌——韌皮部桿菌屬類細菌引起的檢疫性病害，對柑橘生產(chǎn)具有毀滅性危害，是制約柑橘生產(chǎn)的“癌癥”[6-8]。同時，果農(nóng)對柑橘黃龍病防控意識相對薄弱，且受柑橘市場價格因素影響，導致防控黃龍病投入少，部分果園失管等現(xiàn)象頻發(fā)，加速了柑橘黃龍病在柳州市的蔓延，造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重制約著柳州市柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

當前還沒有抗病品種和防治黃龍病的有效藥劑，對染病植株只能砍伐清除。因此，黃龍病檢測對柳州市柑橘產(chǎn)區(qū)黃龍病日常監(jiān)測和柑橘產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展尤為重要。黃龍病檢測通常采用常規(guī)PCR檢測技術，其特點是成本低、簡便、靈敏、準確，適合柑橘黃龍病大規(guī)模監(jiān)測[9]。為及時掌握柳州市柑橘黃龍病發(fā)生情況，遏制柑橘黃龍病的發(fā)生與傳播，筆者從全市柑橘產(chǎn)區(qū)正常管理的果園中采用五點取樣法采集柑橘樣品，通過常規(guī)PCR檢測技術，分析柳州市柑橘黃龍病發(fā)生情況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

柳州市五縣（柳城縣、鹿寨縣、融安縣、融水苗族自治縣和三江侗族自治縣）各選取3個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，每個鄉(xiāng)鎮(zhèn)抽取3個柑橘園，市郊五區(qū)（柳北區(qū)、柳南區(qū)、魚峰區(qū)、柳東新區(qū)和柳江區(qū)）各抽取3個柑橘園，每個果園均采用五點取樣法隨機選取10份柑橘樣品，每份樣品取自同一株柑橘樹。全市累計抽樣60個柑橘園，共采集600份柑橘樣品（表1）。將采集的柑橘樣品按來源分類整理并做好標記，放入4～5℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 柑橘采集樣本來源分布

1.2 樣品DNA提取

使用MiniBEST植物基因組DNA提取試劑盒（寶日醫(yī)生技術（北京）有限公司）進行DNA提取，提取方法如下：取6～8張柑橘葉片中脈剪碎，稱取0.1 g中脈碎末置于2 mL離心管中，放入5 mm研磨珠；加入 500 μL 的 Buffer HS I和 10 μL 的 50×DTT Buffer溶液，隨后離心管插入-20℃冷凍研磨盒中，使用全自動樣品快速研磨儀研磨，頻率65 Hz，研磨時間為200 s，中斷 10 s，重復運行 3 次；吸取 10 μL RNase A（10 mg/mL）放入2 mL離心管中振蕩混勻，隨后離心管放入水浴鍋中（56 ℃）10 min；加 62.5 μL 的 Buffer KAC，振蕩混勻后放入冰盒中5 min，12 000 r/min離心5 min；取350 mL上清液和350 mL Buffer GB于1.5 mL離心管中振蕩混勻，混合溶液放入1.5 mL離心管；把旋轉柱插入收集管中，將1.5 mL離心管混合液倒入旋轉柱中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液；吸取500 μL的Buffer WA放入旋轉柱，12 000 r/min離心 1 min，棄濾液；取700 μL的Buffer WB放入旋轉柱中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液；重復上一個步驟；將收集管離心（12 000 r/min）2 min，棄收集管；將旋轉柱放于新的1.5 mL離心管上，于轉柱中加 40 μL Elution Buffer，靜置 5 min；最后 12 000 r/min離心2 min，洗脫DNA，棄旋轉柱，將裝有DNA溶液的1.5 mL離心管放于-20℃冰箱中保存。

1.3 常規(guī)PCR反應體系

采用常規(guī)PCR技術進行檢測，設計特異性引物OI1/OI2c，根據(jù)柑橘黃龍病菌亞洲株系16 S rDNA基因序列，引物序列OI1為5′-GCGCGTATGCAATACG AGCGGCA-3′，OI2c 為 5′-GCCTCGCGACTTCGCAAC CCAT-3′，由生工生物工程（上海）有限公司合成，擴增目的核酸片段長度1 167 bp[10]。以黃龍病陽性樣品的DNA為陽性對照、柑橘無病毒苗木樣品為陰性對照（通過常規(guī)PCR和熒光定量PCR鑒定確認），以ddH2O為空白對照，通過常規(guī)PCR技術進行檢測。

PCR 擴增體系 25 μL，即 10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上游引物、下游引物各 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 補至 25 μL。 反應程序為94℃持續(xù)5 min，94℃持續(xù)45 s，68℃持續(xù)45 s，72℃持續(xù) 1 min，35個循環(huán)，72℃持續(xù) 10 min，PCR產(chǎn)物保存于4℃。

1.4 PCR產(chǎn)物電泳

稱取1.2 g瓊脂糖加入100 mL 1×TBE試劑中振蕩混勻，放入微波爐中加熱煮沸至溶液透明，加入轉子，吸取 10 μL Super GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10 000×in water，然后用磁力攪拌儀攪拌 6 min，倒入脫膠靜止30min。向PCR產(chǎn)物中加入5μL6×Loading Buffer渦旋離心，隨后取8 μL PCR產(chǎn)物點入1%瓊脂糖凝膠孔中，凝膠放入1×TBE緩沖液中電泳，電壓150 V，電泳45 min。電泳結束后，使用凝膠成像儀觀察結果。

2 結果與分析

由圖1可以看出：陰性對照和ddH2O空白對照在1 167 bp位置處沒有擴增出條帶；部分樣品在1 167 bp位置擴增出特異性條帶，與陽性對照條帶一致，說明樣品感染了黃龍??；其余樣品與陰性對照和ddH2O空白對照一樣沒有顯現(xiàn)條帶，說明樣品未檢測出感染黃龍病。

由表2可知，從60個果園采集的600份樣品中檢測到24個樣品擴增出與陽性對照一致的條帶，陽性檢出率為4.00%。柳州市市郊五區(qū)及五縣柑橘樣品中均有樣品檢測結果呈陽性，其中：市郊五區(qū)樣品陽性率為1.33%，感染黃龍病情況相對較輕；五縣當中，鹿寨縣樣品陽性率為1.11%，感染黃龍病情況相對較輕；柳城縣、三江侗族自治縣樣品陽性率分別為8.89%、6.67%，感染黃龍病情況相對較重。

表2 各柑橘園黃龍病樣品PCR檢測情況

3 結論與討論

柑橘黃龍病在柳州市市郊、五縣都有不同程度的發(fā)生，其中柳城縣是柳州市柑橘主產(chǎn)區(qū)，也是黃龍病老病區(qū)，柑橘黃龍病感染率較高，其他各縣區(qū)黃龍病感染情況也不可忽視。黃龍病的發(fā)生情況受多種因素影響，總體來說，柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展水平與管理水平、病蟲害治理強度成明顯的正相關關系。筆者通過調(diào)查檢測發(fā)現(xiàn)，管理水平相對較高的柑橘園陽性檢出率較低，甚至沒有檢測出陽性。這些果園在管理上都有相同的特點：首先，果農(nóng)對黃龍病都有較強的防控意識，選址建園時選擇周圍少或無黃龍病感染源的地方，以種植柑橘無病毒苗木為主；其次，果農(nóng)注重防治木虱等病蟲害，及時清理病樹，補種健康大苗；再次，果農(nóng)積極學習柑橘黃龍病防控知識，優(yōu)化防控能力。

柳州市近年來重視柑橘黃龍病防控工作，認真學習貫徹落實《廣西壯族自治區(qū)柑橘黃龍病防控規(guī)定》，建立柑橘無病毒苗木繁育體系，培育健康苗木，從源頭上杜絕黃龍病的發(fā)生；開展黃龍病普查工作，重點防治木虱；實施柑橘黃龍病綜合防控體系，建立柑橘黃龍病防控示范區(qū)，注重黃龍病聯(lián)防聯(lián)控和統(tǒng)防統(tǒng)治等措施，在遏制黃龍病傳播方面取得了一定成效。

鑒于目前柳州市柑橘黃龍病的發(fā)生情況，全市仍要加大柑橘黃龍病防控力度，尤其要對柳州市柑橘主產(chǎn)區(qū)黃龍病發(fā)生情況進行實時監(jiān)測，完善柑橘黃龍病綜合防控體系，緊抓聯(lián)防聯(lián)控、統(tǒng)防統(tǒng)治工作，依靠行政和社會管理共同推進柑橘黃龍病防控治理，構建可持續(xù)發(fā)展的柑橘產(chǎn)業(yè)。