望謨崖摩枝葉的化學(xué)成分及其抗炎活性探討

摘要：本次研究的主要實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍ふ也⒎治鰝鹘y(tǒng)藥用植物——望謨崖摩枝葉中的有效成分，采用現(xiàn)代化的色譜分離方法對(duì)采集到的樣本進(jìn)行化合物的分離和提純，并采用波譜分析的方法收集相關(guān)數(shù)據(jù)并對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)和種類進(jìn)行分析。在采集到的樣本中所提取到的9種活性物質(zhì)如下：①卡巴拉內(nèi)酯（cabralealactone）②卡巴拉羥內(nèi)酯（cabraleahydroxylactone）、③二十碳三內(nèi)酯（eichlerialactone）、④金色酰胺醇酯（aurantiamideacetate）、⑤金色酰胺醇（benzenepropanamide）、⑥木葡萄素（xylogranatinin ）、⑦丁香醛、⑧cycloartane-3β，24，25-triol、⑨24（R） -19-cyclolanost-3-one-24，25-dio。同時(shí)，在脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校衔铫凇?、⑨表現(xiàn)出了出色的活性。

關(guān)鍵詞：楝科植物;望謨崖摩;化學(xué)成分;抗炎活性

望謨崖摩是楝科植物的一種，主要分布于我國南方地區(qū)如廣州、貴州等地。楝科植物自古以來有著廣泛的應(yīng)用，川楝、香椿的根皮和果實(shí)是傳統(tǒng)中醫(yī)中常見的藥物;香椿的幼嫩芽葉可以食用;山楝的種子含有大量的脂肪，可以用于工業(yè)榨油，等等。

現(xiàn)階段，我國對(duì)望謨崖摩枝葉的研究較少，很少可以查閱到有幫助的相關(guān)文件，中科院昆明植物研究所楊淑敏等人在望謨崖摩的化學(xué)成分中發(fā)現(xiàn)了系列具有一定抗癌活性的半日花烷型二萜，對(duì)本次研究產(chǎn)生了極大的啟發(fā)。為了進(jìn)一步對(duì)楝科植物中的望謨崖摩進(jìn)行研究，獲取其化學(xué)成分和抗炎活性等相關(guān)信息，本次研究收集了大量的傳統(tǒng)藥用植物望謨崖摩枝葉，大部分資料來自于中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，對(duì)其進(jìn)行了現(xiàn)代儀器的化學(xué)分析，分離到了九種不同的化合物，經(jīng)測定，分別為：①卡巴拉內(nèi)酯（cabralealactone）、②卡巴拉羥內(nèi)酯（cabraleahydroxylactone）、③二十碳三內(nèi)酯（eichlerialactone）、④金色酰胺醇酯（aurantiamideacetate）、⑤、金色酰胺醇（benzenepropanamide）、⑥木葡萄素（xylogranatinin ）、⑦丁香醛、⑧cycloartane-3β，24，25-triol、⑨24（R） -19-cyclolanost-3-one-24，25-dio。其中，①～③、⑧、⑨均為三萜類化合物;④、⑤為二酰胺類化合物;⑥為生物堿類化合物;化合物②、③、④、⑨有較為明顯的抗炎活性，而其他化合物的抗炎活性不明顯。

1. 儀器與材料

本次研究所采用的儀器主要有：waters公司生產(chǎn)的Waters Xevo? Triple-quadrupole型質(zhì)譜儀，對(duì)材料的ESI-MS進(jìn)行測定;采用Bruker AM 500兆赫茲磁共振波譜儀對(duì)材料做核磁譜圖;研究所用到的柱層析硅膠、薄層層析硅膠板等材料均由青島海洋化工廠生產(chǎn);Mitsubishi Chemical 公司生產(chǎn)的MCI樹脂;采用日本進(jìn)口的Sephadex HL-20凝膠;高效液相色譜儀為Water600型，等等。實(shí)驗(yàn)所用到的所有試劑均為分析純。

2. 提取與分離

稱量7kg完全干燥后的望謨崖摩枝葉樣品，并對(duì)其進(jìn)行粉碎，用80%的酒精對(duì)其進(jìn)行浸泡提純，重復(fù)三次，每次持續(xù)一周的時(shí)長，過濾，濃縮提取總浸膏共400g，將收集到的總浸膏置于純凈水中懸浮浸泡，并使用乙酸乙酯溶劑對(duì)其進(jìn)行萃取，萃取重復(fù)三次。得到乙酸乙酯相約65g。MCI柱除去色素后進(jìn)行減壓濃縮，總共得到浸膏28g。

用正相硅膠柱對(duì)乙酸乙酯相劃段，并使用1：1的氯仿甲醇溶液對(duì)其進(jìn)行洗脫，用TLC指引合并，從而得到5個(gè)組分（Fr. A-E）。取5g Fr. B繼續(xù)進(jìn)行硅膠柱分離，并用1：1的氯仿甲醇溶液進(jìn)行洗脫。用HPLC植被相液，用1：1的氯仿甲醇溶液作為流動(dòng)相，分離得出化合物①（7.7mg，10min）、②（8.9mg，18min）、③（8.4mg，22min）。

對(duì)Fr. C（11g）餾分反復(fù)經(jīng)過硅膠柱，并使用1：1氯仿甲醇溶液進(jìn)行洗脫，最后反復(fù)使用凝膠Sephadex HL -20析出化合物④（13.8mg）、⑤（8.4mg）、⑥（8.9mg）和⑦（7.8mg）。

通過對(duì)Fr. D（7g）組分反復(fù)使用RP-18柱進(jìn)行層析提取，使用一定濃度的甲醇水溶液對(duì)提取物進(jìn)行洗脫，得到了最后兩種化合物⑧（12.mg）和⑨（8.9mg）。

3. 結(jié)構(gòu)分析和鑒定

（1）卡巴拉內(nèi)酯（cabralealactone）為白色不定型粉末狀固體，經(jīng)測定得到該物質(zhì)的分子式為C27H42O3。

（2）卡巴拉羥內(nèi)酯（cabraleahydroxylactone）為白色不定型粉末狀固體，經(jīng)測定得到該物質(zhì)的分子式為C27H44O3。

（3）二十碳三內(nèi)酯（eichlerialactone）為白色不定型粉末狀固體，經(jīng)測定得到該物質(zhì)的分子式為C27H42O4。

（4）金色酰胺醇酯（aurantiamideacetate）為白色不定型粉末狀固體，經(jīng)測定得到該物質(zhì)的分子式為C27H28N2O4。

（5）金色酰胺醇（benzenepropanamide）為白色不定型粉末狀固體，經(jīng)測定得到該物質(zhì)的分子式為C27H28N2O4。

（6）木葡萄素（xylogranatinin）為白色不定型粉末狀固體，經(jīng)測定得到該物質(zhì)的分子式為C9H8N2O3。

（7）丁香醛為白色不定型粉末狀固體，經(jīng)測定得到該物質(zhì)的分子式為C9H10O4。

（8）cycloartane-3β，24，25-triol為白色不定型粉末狀固體，經(jīng)測定得到該物質(zhì)的分子式為C30H45O3。

（9）24（R） -19-cyclolanost-3-one-24，25-dio為白色不定型粉末狀固體，經(jīng)測定得到該物質(zhì)的分子式為C30H50O3。

4. 抗炎活性的研究和討論

該部分實(shí)驗(yàn)在DMEM高糖培養(yǎng)基（含有10.00%胎牛血清，含有青霉素磷鏈霉素雙抗、谷丙酰胺各1.00%）環(huán)境下培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，并將該細(xì)胞至于36.5℃人體溫度環(huán)境下，用5.00%濃度的二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行傳代培養(yǎng)，采用該細(xì)胞進(jìn)行下列抗炎活性研究實(shí)驗(yàn)。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)我們了解到使用不同濃度的DMSO溶解化合物處理上述細(xì)胞持續(xù)1d滯后，80μM及以上濃度的化合物溶液濃度對(duì)細(xì)胞具有一定的濃度，故實(shí)驗(yàn)中所選用的化合物溶液濃度均在該濃度及以下，以此確保實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和可行性。

將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以5*10^5個(gè)/mL的數(shù)量在96孔板接種，每個(gè)空位嚴(yán)格保證100μL，同期設(shè)置空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以此減小實(shí)驗(yàn)誤差。分別設(shè)計(jì)空白對(duì)照組、Dex陽性對(duì)照組、LPS組、LPS+樣品處理組，每組設(shè)計(jì)三個(gè)平時(shí)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)8個(gè)小時(shí)。吸出上層清液后，在每個(gè)孔位中加入100μL樣品培養(yǎng)0.5h，加入LPS刺激24h，監(jiān)測上層清液中的NO含量。

采用Graph Prism 5.0軟件和One-way ANOVA對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為研究結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

通過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，化合物②～④、⑨在不同濃度下均對(duì)1μg/mL LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞一氧化氮產(chǎn)生含量具有一定抑制作用，且該抑制作用受濃度影響明顯，即在任何濃度下均有一定的抗炎活性，但該抗炎活性與濃度之間存在明顯的關(guān)系;化合物②在濃度為20μM和40μM時(shí)對(duì)NO生成作用并不明顯，但當(dāng)濃度達(dá)到80μM時(shí)則產(chǎn)生了非常明顯的抑制作用，且相對(duì)Dex陽性對(duì)照組而言抑制效果更明顯，即在特定濃度下有較強(qiáng)的抗炎活性;化合物③則在濃度為40μM和80μM時(shí)NO的產(chǎn)生均有明顯的抑制作用，且濃度為80μM時(shí)效果更佳，即在較強(qiáng)濃度下有較強(qiáng)的抗炎活性;化合物④在各種濃度下均可以有效一直NO的生成，且作用效果均顯著高于Dex陽性對(duì)照組，即在任何濃度下均有著較強(qiáng)的抗炎活性。

其余幾種化合物對(duì)NO產(chǎn)生的并無明顯抑制作用。

5. 結(jié)論

通過對(duì)傳統(tǒng)藥物植物望謨崖摩的枝葉進(jìn)行化學(xué)成分的分析，根據(jù)波普數(shù)據(jù)和大量的文獻(xiàn)資源對(duì)照解析了提取到的9種不同的化學(xué)物質(zhì)，①卡巴拉內(nèi)酯（cabralealactone）、②卡巴拉羥內(nèi)酯（cabraleahydroxylactone）、③二十碳三內(nèi)酯（eichlerialactone）、④金色酰胺醇酯（aurantiamideacetate）、⑤、金色酰胺醇（benzenepropanamide）、⑥木葡萄素（xylogranatinin ）、⑦丁香醛、⑧cycloartane-3β，24，25-triol、⑨24（R） -19-cyclolanost-3-one-24，25-dio。其中，②、③、④、⑨具有較為明顯的抗炎活性，但作用機(jī)制尚未明確。植物崖摩的化學(xué)成分和作用機(jī)制等方面仍有待進(jìn)一步的探索和分析。

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作者簡介：施國軍，出生年月：1972年12月;性別：男;民族：白族;籍貫：云南大理人;學(xué)歷：碩士研究生;職稱：講師與實(shí)驗(yàn)師;研究方向：藥物化學(xué)。