自交不親和性相關(guān)基因在蕓薹屬中的研究

謝立人，陳翠萍 ，李開(kāi)祥，杜德志

(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青藏高原種質(zhì)資源研究與利用實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家油菜改良青海分中心，青海省春油菜遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016)

自交不親和性是指雌雄蕊發(fā)育正常的有花植物，在識(shí)別本身的花粉或特定基因型的花粉后不能正常授粉或結(jié)實(shí)的一種現(xiàn)象。這是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的一種避免自交與近親繁殖，有利于異交保持生物遺傳多樣性、環(huán)境適應(yīng)性的保護(hù)機(jī)制。依據(jù)花器官的結(jié)構(gòu)，可以將自交不親和性分成同型性自交不親和與異型性自交不親和，異型性自交不親和的植物可以通過(guò)花器官區(qū)分其親和性，而同型性自交不親和的植物卻不可以[1]?；谧越徊挥H和性的遺傳機(jī)理，該特性又可分為兩種，分別為配子體自交不親和(GSI)和孢子體自交不親和(SSI)，而蕓薹屬植物屬于孢子體不親和，它的自交不親和性是由S位點(diǎn)的復(fù)等位基因控制，S位點(diǎn)具有很高的多態(tài)性[2]。前人研究表明，大多數(shù)植物自交不親和性是由一個(gè)S位點(diǎn)復(fù)等位基因位點(diǎn)控制，少數(shù)植物的自交不親和性是由兩個(gè)或多個(gè)S位點(diǎn)控制(如屬于配子體自交不親和的禾本科植物S-Z位點(diǎn))[3]。目前關(guān)于旋花科、菊科、十字花科孢子體自交不親和的研究有很多報(bào)道[4-5]，本文總結(jié)了十字花科蕓薹屬自交不親和性相關(guān)基因的研究進(jìn)展，以期為自交不親和性狀的研究和應(yīng)用提供參考。

1 蕓薹屬SI相關(guān)基因的研究

自交不親和反應(yīng)的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜且精密的過(guò)程，在開(kāi)花植物中，花粉與柱頭乳突接觸后，在其中間形成“花粉足”，并經(jīng)歷吸附、水合、萌發(fā)、花粉管伸長(zhǎng)等過(guò)程，任何一個(gè)過(guò)程不能正常進(jìn)行都會(huì)導(dǎo)致自交不親和。而柱頭又可以被分為干性柱頭與濕性柱頭，十字花科植物的柱頭屬于干性柱頭，干柱頭在接受花粉方面有更嚴(yán)格的調(diào)節(jié)，因?yàn)榛ǚ郾仨毧朔柚共≡w感染的表面屏障，以便允許親和花粉管穿透，在孢子體自交不親和發(fā)生時(shí)，大量的胼胝質(zhì)在花粉管頂端積累，阻止花粉管的伸長(zhǎng)導(dǎo)致授粉失敗[6]。當(dāng)成熟的不親和花粉與柱頭接觸時(shí)，SRK與SCR識(shí)別產(chǎn)生互作，之后與MLPK、ARC1、Exo70A1、GLO1等基因發(fā)生一系列的識(shí)別，對(duì)花粉的水合萌發(fā)進(jìn)行影響，導(dǎo)致自交不親和的發(fā)生。

1.1 雌蕊決定因子SRK的研究

S位點(diǎn)受體激酶SRK(S-locus receptor kinase)作為雌蕊自交不親和的決定因子，它的發(fā)現(xiàn)晚于S位點(diǎn)糖蛋白SLG(S-locus glycoprotein)，而在此之前，SLG被認(rèn)為是雌蕊決定因子。S位點(diǎn)糖蛋白SLG最初被Nishio等[7]在1978年從白菜中分離出來(lái)。前人研究發(fā)現(xiàn)SLG蛋白被一個(gè)疏水性的信號(hào)殘基分泌到成熟的柱頭乳突細(xì)胞的細(xì)胞壁和胞間區(qū)，與自交不親和反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間和部位相吻合，所以其最初被認(rèn)為是蕓薹屬雌蕊的決定因子[8-10]。然而在一些表現(xiàn)自交不親和的甘藍(lán)和白菜中，發(fā)現(xiàn)其SLG基因發(fā)生了功能突變或丟失[11-12]，在Kusaba等[13]和Goubet等[14]對(duì)SI的琴葉擬南芥(A.lyrate)研究中，甚至沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SLG的存在，1990年Walker等[15]在玉米中發(fā)現(xiàn)一個(gè)受體激酶基因ZMPK1與蕓薹屬中的SLG有很高的相似性，1991年Stein等[16]在甘藍(lán)中通過(guò)對(duì)基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選，克隆得到一個(gè)在S位點(diǎn)上與SLG連鎖的S位點(diǎn)受體激酶SRK，該基因與S位點(diǎn)連鎖，并且在柱頭中特異表達(dá)，Watanabe等[17]研究認(rèn)為，SLG編碼的蛋白與SRK編碼的S受體結(jié)構(gòu)域具有高度同源性，隨后的研究者在白菜、甘藍(lán)與甘藍(lán)型油菜中克隆了多個(gè)位于S位點(diǎn)的SRK等位基因。SRK編碼的蛋白由S受體區(qū)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)具有磷酸化蛋白功能的激酶結(jié)構(gòu)域三部分組成[16-19]。Takasaki等[20]的研究通過(guò)一系列轉(zhuǎn)基因等實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了SRK是蕓薹屬雌蕊的決定基因，該實(shí)驗(yàn)用SRK28和SLG28基因轉(zhuǎn)入白菜，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入SRK28基因就可以使自交親和SC的白菜成為自交不親和SI，SLG在自交不親和反應(yīng)可能只起輔助作用，SRK編碼一個(gè)跨越乳突細(xì)胞質(zhì)膜的絲氨酸/蘇氨酸受體激酶，是柱頭自交不親和表現(xiàn)的唯一決定因子。這些研究說(shuō)明自交不親和反應(yīng)或許不一定需要SLG的參與，而SRK是雌蕊的決定因子，對(duì)花粉識(shí)別有重要的作用。

1.2 花粉決定因子SCR的研究

蕓薹屬自交不親和性反應(yīng)花粉識(shí)別因子為SP11(S-locus protein 11)/SCR(S-locus cysteine-rich protein)，SCR編碼產(chǎn)物為富含半胱氨酸蛋白的分泌型小肽，該蛋白在花藥絨氈層細(xì)胞中特異表達(dá)，SCR基因是自交不親和反應(yīng)中的特異基因，SP11/SCR是一對(duì)等位基因[21]。對(duì)花粉被蛋白PCPs的研究促使了花粉決定因子的發(fā)現(xiàn)，Stanchev等[22]和Doughty等[23]的研究認(rèn)為，花粉被蛋白的產(chǎn)物是一個(gè)類(lèi)似蛋白大家庭的成員，可以特異性地結(jié)合到SLG上。Stephenson等[24]的研究認(rèn)為，自交不親和性的雄性決定因子是一種蛋白，可能是PCP-A蛋白家族的成員。1999年Schopfer和Suzuk的實(shí)驗(yàn)都證實(shí)了SP11/SCR是花粉決定基因[25-26]。Franklin-Tong等[27]對(duì)自交親和的甘藍(lán)突變體的實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)有檢測(cè)到SCR的存在。SCR與SRK作為配體與受體在花粉與柱頭間形成的復(fù)合物，在自花花粉識(shí)別中起重要的作用[28]，相同S單倍型的SRK與SCR互相作用產(chǎn)生復(fù)合物是自交不親和反應(yīng)通路上的第一步。也有研究者認(rèn)為表觀遺傳效應(yīng)參與了不同S單倍型的顯隱性關(guān)系，DNA甲基化導(dǎo)致SP11等位基因的隱性沉默，使之出現(xiàn)了單等位基因表達(dá)的現(xiàn)象[29]。之后的研究人員在擬南芥中的研究認(rèn)為SRK胞外域有幾個(gè)糖基化位點(diǎn)，而SRK的激活并不依賴于這些聚糖，表明SP11/SCR結(jié)合是在氨基酸水平上指定的[30]。而蕓薹屬SI反應(yīng)信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，其自交不親和性的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

1.3 SI信號(hào)通路中相關(guān)基因的研究

除了S位點(diǎn)之外還有許多其他基因參與自交不親和反應(yīng)，包括MLPK(M位點(diǎn)蛋白激酶)、ARC1(臂展重復(fù)蛋白)、THL1/2(類(lèi)硫氧還蛋白h)、Exo70A1(胞吐復(fù)合物)、GLO1(乙二醛酶)等基因。這些基因在SCR與SRK識(shí)別后起作用，形成一個(gè)信號(hào)通路，最終導(dǎo)致自交不親和性。對(duì)白菜型油菜Yellow Sarson突變體的研究發(fā)現(xiàn)了M位點(diǎn)蛋白激酶(MLPK)，M位點(diǎn)和S位點(diǎn)是互相獨(dú)立的，質(zhì)膜定位表明它可能在SRK附近發(fā)揮作用，磷酸化的SRK和MLPK(M位點(diǎn)蛋白激酶)之后再與ARC 1相互作用，MLPK對(duì)自交不親和起正調(diào)控作用[31-32]。MLPK有兩種不同的轉(zhuǎn)錄本，MLPKf1和MLPKf2，它們是通過(guò)不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)產(chǎn)生的，編碼兩種僅在N端不同的亞型，兩者翻譯的蛋白都在乳突細(xì)胞膜上，并且MLPK能與SRK直接互作[33]。Chen F等[34]利用RNA沉默與CRISPR/Cas 9技術(shù)對(duì)甘藍(lán)型油菜MLPK基因進(jìn)行研究，自交不親和反應(yīng)在RNA沉默后部分被抑制，在自交不親和系“S-70”中敲除MLPK后的SI油菜完全變?yōu)樽越挥H和植株。這些研究表明，MLPK是SI信號(hào)通路上與SRK相互作用的重要因子。前人通過(guò)篩選與S-位點(diǎn)受體激酶(SRK)結(jié)構(gòu)域相互作用的酵母雙雜交蛋白庫(kù)，分離出一種名為ARC 1的蛋白，RNA印跡分析顯示，ARC1的表達(dá)局限于自交不親和反應(yīng)的柱頭部位，是油菜柱頭特異表達(dá)的基因[35]。研究者認(rèn)為ARC1是SRK的下游效應(yīng)物，實(shí)驗(yàn)證實(shí)上調(diào)ARC1基因表達(dá)可以使自交不親和植株的結(jié)籽減少，下調(diào)ARC1基因表達(dá)的植株發(fā)生自交部分結(jié)籽，因此與MLPK相似的是ARC1也屬于自交不親和反應(yīng)的正調(diào)控基因[36]。之后的研究表明ARC1擁有一個(gè)U-box結(jié)構(gòu)，具有E3泛素連接酶活性，泛素化蛋白水平在不親和授粉時(shí)提高，而ARC1促進(jìn)雌蕊親和性因子的泛素化，降解親和反應(yīng)的蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致自交不親和的發(fā)生[37]。另外，前人對(duì)自交不親和琴葉擬南芥(Arabidopsis lyrata)的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證明ARC1可能是自交不親和反應(yīng)所必須的基因[38-39]。類(lèi)硫氧還蛋白(THL 1/2)是Bower等通過(guò)酵母雙雜的方法篩選到的，當(dāng)柱頭未授粉時(shí)，SRK被類(lèi)硫氧還蛋白抑制，SRK的磷酸化受到阻礙,所以類(lèi)硫氧還蛋白可能是SRK磷酸化的抑制劑,是自交不親和的負(fù)調(diào)控因子[40-41]。前人在篩選與ARC1相互作用的蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)了甘藍(lán)型油菜Exo70A1基因，當(dāng)在自交不親和油菜“W 1”的柱頭中Exo70A1過(guò)表達(dá)可以部分克服自交不親和，抑制Exo70A1表達(dá)時(shí)表現(xiàn)出柱頭上花粉無(wú)法萌發(fā)[42]，在植物中，ARC1抑制Exo70A1，來(lái)阻斷基底花粉識(shí)別途徑，從而阻止乳頭質(zhì)膜上的囊泡/MVB分泌，發(fā)生SI反應(yīng)[43]。因此Exo70A1也可能是自交親和反應(yīng)的重要因子。Sankaranarayanan等[44]的研究表明，GLO 1是授粉所需的柱頭親和因子，自交不親和的甘藍(lán)型油菜柱頭過(guò)表達(dá)GLO1會(huì)導(dǎo)致自交不親和反應(yīng)的部分破壞，導(dǎo)致不親和授粉部分結(jié)籽。自花授粉后，ARC 1介導(dǎo)GLO 1泛素化降解含量降低，導(dǎo)致丙酮醛(MG)水平的增加，MG具有細(xì)胞毒素，破壞柱頭乳突細(xì)胞導(dǎo)致自交不親和的發(fā)生。因此GLO1基因是自交親和的重要因子。根據(jù)前人的研究狀況，我們可以發(fā)現(xiàn)自交不親和反應(yīng)信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。當(dāng)柱頭未授粉時(shí)，SRK被類(lèi)硫氧還蛋白抑制，而自花授粉時(shí)(圖1)，S單倍型相同或?qū)儆诜N間同源對(duì)的花粉配體(SCR)與柱頭中的受體(SRK)相互作用并通過(guò)自體磷酸化作用激活SRK，磷酸化的SRK與質(zhì)膜定位的MLPK相互作用，共同磷酸化激活E 3泛素連接酶ARC 1，因此MLPK和ARC 1起著正調(diào)控的作用，而GLO 1與Exo 70 A 1起負(fù)調(diào)控的作用，激活的ARC 1泛素化降解親和反應(yīng)關(guān)鍵蛋白GLO 1和Exo 70 A 1，導(dǎo)致MG的增加，細(xì)胞內(nèi)引起自噬的激活，從而影響花粉的正常水合萌發(fā)，最終引起自交不親和反應(yīng)。

圖1 孢子體自交不親和反應(yīng)通路

柱頭未授粉時(shí)，SRK被THL1/2抑制，而識(shí)別到自花花粉時(shí)，SCR與SRK相互作用并通過(guò)自體磷酸化作用激活SRK，之后磷酸化的SRK與MLPK相互作用，共同磷酸化激活E 3泛素連接酶ARC 1，激活的ARC 1泛素化降解親和反應(yīng)關(guān)鍵蛋白GLO 1和Exo 70 A 1，導(dǎo)致MG的增加，引起自噬的激活，從而影響花粉的正常水合萌發(fā)。

2 蕓薹屬S單倍型的研究

隨著SLG、SRK、SP11/SCR基因被克隆與序列的比對(duì)，研究者發(fā)現(xiàn)不同的SP11/SCR和SRK等位基因共同進(jìn)化成一系列S單倍型，編碼相應(yīng)的配體-受體對(duì)，這些組合以一個(gè)整體向子代傳遞，幾乎不發(fā)生重組，這些組合被分為不同的S單倍型[45]。當(dāng)兩種相同S單倍型花粉與柱頭結(jié)合時(shí)發(fā)生不親和反應(yīng)，不同S單倍型自交不親和花粉與柱頭組合時(shí)，則能發(fā)生異交[46]。也有例外，在甘藍(lán)與白菜的研究中也發(fā)現(xiàn)，一些相同的S單倍型之間可以互相識(shí)別(如BrS-60與BoS-15)，這些S單倍型被稱作種間同源對(duì)[47]。根據(jù)SLG與SRK序列的相似性，S單倍型被分為Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)，遺傳分析表明，Ⅰ類(lèi)S單倍型相對(duì)于Ⅱ類(lèi)S單倍型屬于顯性，并且Ⅰ類(lèi)S單倍型的自交不親和性更強(qiáng)[48]。對(duì)白菜不同單倍型研究表明，這種S單倍型的顯隱性關(guān)系在柱頭與花粉之間是互相獨(dú)立的，花粉端(SCR)之間一般表現(xiàn)出顯隱性，而柱頭中(SRK)之間通常是共顯性的[49]。Kakizaki等[50]選取4個(gè)白菜型油菜Ⅱ類(lèi)S單倍型的(6種組合)雜合型與其親本純合型進(jìn)行授粉實(shí)驗(yàn)，在其花粉側(cè)發(fā)現(xiàn)線性顯隱性關(guān)系，確定Ⅱ類(lèi)S單倍型的顯隱性關(guān)系為BrS44>BrS60>BrS40>BrS29。Shiba等[51]通過(guò)對(duì)白菜Ⅰ類(lèi)S單倍型(S52)與Ⅱ類(lèi)S單倍型(S60)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在S52與S60的雜合材料中，來(lái)自S60的SCR基因表達(dá)量明顯降低，F(xiàn)ujimoto[52]的研究表明，在Ⅰ類(lèi)/Ⅱ類(lèi)雜合株中，Ⅰ類(lèi)與SCR基因無(wú)功能時(shí)，Ⅱ類(lèi)SCR也不表達(dá)，所以SCR的顯隱性關(guān)系是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的。sRNA和miRNA廣泛參與細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控，在白菜Ⅰ類(lèi)單倍型SLG上游5 kb左右發(fā)現(xiàn)存在一段與SCR啟動(dòng)子區(qū)被甲基化的序列高度同源的序列，命名為SP 11-methylation-inducer region(SMI)，這段序列可以產(chǎn)生一個(gè)24-nt的小RNA，Tarutani等[53]原位雜交實(shí)驗(yàn)表明，隱性SP11等位基因的啟動(dòng)子區(qū)域在花藥絨氈層中特異性甲基化，SMI誘導(dǎo)Ⅱ類(lèi)SCR啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生高度的DNA甲基化，這種甲基化使Ⅱ類(lèi)SCR基因沉默，SMI的發(fā)現(xiàn)很好地解釋了Ⅰ類(lèi)、Ⅱ類(lèi)S單倍型間顯隱性的分子機(jī)理。最近Yasuda等[54]的研究發(fā)現(xiàn)，在Ⅱ類(lèi)S單倍型SRK基因下游(5～10 kb)存在另一個(gè)產(chǎn)生小RNA的位點(diǎn)SMI2，對(duì)4個(gè)線性顯隱性關(guān)系做出解釋，在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中研究者將白菜BrS60單倍型的SMI 2分別轉(zhuǎn)入BrS40、BrS29和BrS44純合單倍型植株中，BrS40和BrS29轉(zhuǎn)基因材料表現(xiàn)自交親和表型，SCR基因均沒(méi)有表達(dá)，而在BrS44轉(zhuǎn)基因植株仍表現(xiàn)自交不親和的表型，說(shuō)明BrS60單倍型的SMI 2可以抑制隱性單倍型BrS40和BrS29的SCR基因的表達(dá)。這個(gè)模型的提出為自交不親和反映顯隱性研究提供了重要的基礎(chǔ)。

3 展 望

自交不親和性作為保持生物遺傳多樣性、環(huán)境適應(yīng)性的重要機(jī)制引起了許多學(xué)者的關(guān)注與研究，對(duì)蕓薹屬孢子體自交不親和的廣泛研究已經(jīng)在較大程度上揭示了導(dǎo)致自交不親和發(fā)生的信號(hào)通路(如圖1)。在SI反應(yīng)信號(hào)通路中，除了S位點(diǎn)的基因，還有一些非S位點(diǎn)的因子與S位點(diǎn)基因互作，具有極其復(fù)雜的機(jī)制，挖掘其他參與SC與SI重要因子與它們的功能分析是值得深入探究的問(wèn)題。研究者在擬南芥中發(fā)現(xiàn)表觀遺傳效應(yīng)在自交不親和反應(yīng)中具有重要作用，目前DNA甲基化相關(guān)的基因是否參與蕓薹屬植物自交不親和反應(yīng)還未見(jiàn)報(bào)道，進(jìn)一步對(duì)DNA甲基化在蕓薹屬SI中的作用研究具有重要的意義。在生產(chǎn)應(yīng)用方面，可以利用雜種優(yōu)勢(shì)中的自交不親和途徑選育優(yōu)良的農(nóng)作物品種，而自交不親和性的分子機(jī)制研究為分子育種工作提供極其重要的理論支撐。