廣西桂南地區(qū)抗病毒治療艾滋病患者耐藥特征及影響因素分析*

盧煥, 吳念寧, 歐汝志, 李雪琴, 黎彥君, 吳鋒耀

南寧市第四人民醫(yī)院(廣西艾滋病臨床診療中心)感染科(廣西南寧 530023)

艾滋病(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是人類因為感染了人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)后導(dǎo)致機(jī)體免疫功能低下或缺陷，繼而引起一系列機(jī)會性感染及惡性腫瘤，嚴(yán)重者可引起死亡的綜合征。自1996年美籍華裔何大一教授提出高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)，艾滋病由一種致死性疾病轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N可控可治的慢性感染性疾病。然伴隨抗病毒治療的進(jìn)行，HIV耐藥開始出現(xiàn)，早期文獻(xiàn)報道，在未抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(antiretroviral therapy，ART)的HIV感染人群，耐藥率高達(dá)14.8%～20.1%[1-2]，耐藥的出現(xiàn)給臨床治療帶來極大挑戰(zhàn)。南寧市第四人民醫(yī)院作為廣西艾滋病臨床治療中心(南寧)，主要負(fù)責(zé)廣西桂南地區(qū)艾滋病毒感染或艾滋病(HIV/AIDS)人群的抗病毒治療，目前關(guān)于HIV/AIDS患者抗病毒治療后耐藥研究的數(shù)據(jù)有限。本研究橫斷面分析2019年1月至2020年8月在該院免費(fèi)抗病毒治療的HIV/AIDS患者發(fā)生耐藥的臨床特征及影響因素，以期對廣西乃至其他地區(qū)艾滋病防治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2019年1月至2020年8月在南寧市第四人民醫(yī)院免費(fèi)抗病毒治療的HIV/AIDS患者。收集研究對象的人口學(xué)特征包括性別、婚姻狀況、年齡、HIV感染途徑、初始ART藥物、基線CD4+T細(xì)胞、抗病毒治療時長。該研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批(批件號[2019]39)并獲得所有受試者知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)HIV-1抗體確認(rèn)試驗陽性或HIV抗體初篩陽性，HIV-1 RNA定量≥5 000拷貝/mL；(2)年齡≥18周歲；(3)ART治療≥6個月；(4)血漿HIV病毒載量(VL)≥1 000拷貝/mL。所有HIV/AIDS患者首次抗病毒治療均簽署抗病毒治療知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 血漿HIV-RNA檢測及CD4+T細(xì)胞計數(shù)檢測 采集HIV/AIDS患者的抗凝靜脈血8～10 mL送實驗室行血漿分離，然后用COBAS TaqMan 96病毒載量儀，CAP CTM HIV 2.0 定量試劑盒(德國，Roche) 進(jìn)行血漿HIV VL 檢測。HIV VL≥1 000拷貝/mL定義為病毒學(xué)抑制失敗。采用BD流式細(xì)胞儀(FACSVia)進(jìn)行分析檢測CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)。

1.2.2 耐藥檢測 (1)HIV 核酸提取: 對病毒載量≥1 000 拷貝/mL 的樣本，用美國雅培(Abbott)公司Viroseq HIV-1 基因型耐藥分析試劑盒提取 HIV 核酸，逆轉(zhuǎn)錄(RT)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行操作。(2)循環(huán)測序: 采用3500xL Dx基因測序儀(Themo Da8600)對HIV-1 基因型耐藥進(jìn)行分析檢測，試劑盒通過使用 7 個引物(4 個正向引物和 3 個反向引物) 測序 HIV-1 蛋白酶基因密碼子 1-99 的整個區(qū)域和密碼子 1-335 的2/3區(qū)域。(3)耐藥分析: Viroseq系統(tǒng)軟件從每個樣本的7個引物采集測序數(shù)據(jù)，并將信息合并于一個單一項目中，在引物序列的匯集過程中，產(chǎn)生了一個包含整個蛋白酶基因和到達(dá) 335 個密碼子的 RT 基因共有序列，將這一共有序列與已知的參照株HXB-2進(jìn)行比較，識別變異的位點(diǎn)。整個操作過程分：樣本制備、逆轉(zhuǎn)錄(RT)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、循環(huán)測序反應(yīng)、自動序列檢測、軟件分析等6個步驟，操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.3 耐藥、可能耐藥、不耐藥的定義 通過雅培公司自己構(gòu)建的特定41打分系統(tǒng)進(jìn)行耐藥評分，對總分值<0.5解釋為不耐藥；總分值為0.5 到 1.0解釋為可能耐藥；總的分值在1.0 或 1.0 以上解釋為耐藥(詳細(xì)參照相關(guān)說明書進(jìn)行打分)。用頻數(shù)對耐藥、可能耐藥和非耐藥進(jìn)行描述。本研究中將耐藥、可能耐藥均定義為耐藥，然后進(jìn)行單因素和logistic 回歸分析。

1.2.4 突變位點(diǎn)判讀參照比對 (1)突變已經(jīng)被美國FDA定義為具有臨床實用性的突變；(2)在美國國際艾滋病社會組織推薦中，已知突變被列為主要和次要突變，定期更新可在LAS-USA網(wǎng)站(http://www.iasusa.org/)上找到；(3)在GART和VIRADAPT研究中已經(jīng)列出的突變位點(diǎn)可以作為耐藥性預(yù)測。

1.2.5 抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療方案 主要參照國家免費(fèi)艾滋病抗病毒藥物治療手冊第4版[3]，提供使用的免費(fèi)抗病毒藥物包括：齊多夫定(AZT)、替諾福韋(TDF)、阿巴卡韋(ABC)、司他夫定(D4T)、拉米夫定(3TC)、奈韋拉平(NVP)、依非韋倫(EFV)、洛匹那韋/利托那韋(LPV/r)，標(biāo)準(zhǔn)一線方案有TDF(AZT)+3TC+EFV(或NVP)，二線方案為TDF(AZT)+3TC+LPV/r或簡化方案3TC+LPV/r。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用Excel 2010收集數(shù)據(jù)，使用R4.0.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，對分類變量使用2檢驗，對病毒抑制失敗和耐藥病例的影響因素首先進(jìn)行單因素分析，根據(jù)單因素分析檢驗結(jié)果，對P值<0.1的變量進(jìn)行二項logistic回歸分析，采取后退法進(jìn)行模型篩選，最后選取AIC值最小的模型作為最終統(tǒng)計模型。二項logistic檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 人口學(xué)基本特征 2019年1月至2020年8月共篩查出1 470例HIV/AIDS患者在南寧市第四人民醫(yī)院接受ART治療，符合本研究病毒學(xué)抑制失敗137例，病毒抑制失敗率9.32%(137/1 470)。137例病毒學(xué)抑制失敗病例中男113例(82.48%)，女24例(17.52%)，男女比例1∶0.21；年齡以18～50歲為主(67.15%)；HIV感染途徑以異性性行為為主(72.99%)；抗病毒治療時長以6～36個月為主(59.85%)；基線CD4+T細(xì)胞計數(shù)<200個/μL為主(70.80%)；HIV-RNA以103～104拷貝/mL為主(60.58%)。ART初始方案：含TDF方案 95例(71.43%)，含AZT方案 38例(28.57%)；含NVP 14例(10.22%)，含EFV方案 100例(72.99%)，選擇LPV/r方案 23例(16.79%)，其中4例使用3TC+LPV/r方案。具體見表1。

表1 137例HIV/AIDS患者病毒學(xué)抑制失敗基本特征分布 例(%)

2.2 耐藥患者特征描述 137例病毒抑制失敗患者血樣經(jīng)耐藥檢測分析，結(jié)果顯示75例顯示對1種和(或)1種以上國家免費(fèi)藥物耐藥，病毒抑制失敗耐藥率54.74%(75/137)。55例檢測到對NRTI耐藥，病毒抑制失敗耐藥率40.15%(55/137)，其中3TC耐藥率最高，占39.42%；AZT耐藥率最低，占1.46%。NRTI耐藥突變位點(diǎn)主要以M184V/I、K65R、T69S/N/A常見；檢測到單一突變位點(diǎn)T69A、T69N、T69S和K70N的樣本未顯示臨床耐藥。檢測到NNRTI耐藥71例，病毒抑制失敗耐藥率51.82%(71/137)，其中NVP耐藥率51.09%；EFV耐藥率49.64%；NNRTI耐藥突變位點(diǎn)主要以K103N/R/S、G190S/A/C/Q、V179D/E常見；檢測到單一突變基因位點(diǎn)E138A、K101Q、V179D/E、V106I和V90I未顯示臨床耐藥。檢測到1例對PI中的LPV/r耐藥，耐藥率0.72%(1/137)；PI突變位點(diǎn)主要以L10I、L10V常見,耐藥率分別為42.86%、21.43%。另外，1例樣本同時檢測到PI的L10F、M46I、I54V、V82A，NRTI的T69S、M184V和NNRTI的V106I、Y188L、G190A等突變位點(diǎn)，藥敏顯示對LPV/r、3TC、NVP、EFV均耐藥。49例藥敏顯示對NRTI和NNRTI耐藥(35.77%)。見表2和圖1。

表2 各類免費(fèi)抗病毒治療藥物耐藥評分結(jié)果 例

圖1 HIV/AIDS患者病毒學(xué)抑制失敗耐藥位點(diǎn)分布

2.3 耐藥影響因素二項logistic回歸分析 經(jīng)logistics回歸模型對比，性別、治療方案和CD4+T細(xì)胞水平納入最終模型(AIC值175.6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于基線CD4+T<200，基線CD4+T細(xì)胞≥200個/μL是發(fā)生耐藥的保護(hù)因素；相對于 LPV/r的初始ART方案，含NVP/EFV方案更容易發(fā)生耐藥。詳細(xì)結(jié)果見表3。

表3 HIV/AIDS病毒學(xué)抑制失敗患者耐藥二項logistic回歸分析

3 討論

隨著ART的啟動，HIV/AIDS人群的壽命得以延長、生活質(zhì)量得以提高，但長時間抗病毒治療的后果是不可避免地引發(fā)耐藥現(xiàn)象。在美國，更是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括第二代整合酶在內(nèi)的耐藥現(xiàn)象[4]。本次研究發(fā)現(xiàn)HIV/AIDS患者ART病毒抑制失敗率為9.32%，病毒抑制失敗耐藥率為54.74%，高于廣西龍?zhí)夺t(yī)院報道的45.50%[5]和遼寧阜新市杜波等[6]報道的23.97%，略低于貴州省黃璐等[7]報道的59.5%。Logistics多因素分析顯示，初始ART方案中含NVP或者EFV的HIV/AIDS患者發(fā)生耐藥的比值比是含LPV/r治療的3.68倍(OR=3.68，95%CI：1.33～10.16)；而CD4+T細(xì)胞≥200個/μL時，發(fā)生耐藥的可能性下降71%(OR=0.29，95%CI：0.12～0.68)，這一結(jié)果與段振華等[8]、李超鋒等[9]和Stirrup等[10]研究發(fā)現(xiàn)低水平基線CD4+T更容易引發(fā)耐藥的結(jié)論相似，提示基線CD4+T細(xì)胞≥200個/μL、含LPV/r的方案是耐藥發(fā)生的保護(hù)因素。本研究雖未發(fā)現(xiàn)NRTI骨干藥物中選擇AZT或TDF在耐藥發(fā)生上差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但本研究中AZT耐藥率1.46%，明顯低于Khan等[11]報道的80%，提示如出現(xiàn)TDF耐藥或因為繼發(fā)TDF相關(guān)骨腎毒性不宜繼續(xù)使用TDF的情況下，AZT是理想的替代藥物，但AZT相關(guān)的骨髓抑制、脂肪萎縮、乳酸酸中毒等不良反應(yīng)及2次/d給藥的不便利性使其在最新的國家艾滋病診療指南中已退出一線方案[12]。

從臨床藥物耐藥類別來看，本研究中病毒抑制失敗人群以NNRTI耐藥率51.82%最高，其次NRTI耐藥率40.15%，PI耐藥率0.72%最低，這與國內(nèi)外多地區(qū)研究發(fā)現(xiàn)[11,13-14]相一致，主要原因是目前我國及世界經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)一線ART方案仍以NRTI和NNRTI組合為主。NRTI以3TC耐藥率39.42%最高；AZT 1.46%最低；32例對TDF耐藥的病例顯示對ABC有相似耐藥結(jié)果，提示當(dāng)TDF耐藥時不能用ABC繼續(xù)替代治療。NNRTI耐藥發(fā)生率51.82%，以NVP的耐藥率51.09%為最高，EFV耐藥率49.64%次之。從耐藥位點(diǎn)突變發(fā)生情況看，NRTIs以M184V/I、K65R、T69S/N/A多發(fā)，其中M184V/I與3TC耐藥發(fā)生相關(guān)，K65R與TDF、ABC耐藥發(fā)生相關(guān)；NNRTIs以K103N/R/S、G190S/A/C/Q、V179D/E多發(fā)，K103N/R/S與NVP、EFV耐藥相關(guān)，PI以L10I/V最常見，這一結(jié)果與黃璐等[7]發(fā)現(xiàn)有所不同。本研究還發(fā)現(xiàn)，T69S/N/A、V179D/E突變位點(diǎn)檢出頻率較高，但耐藥結(jié)果顯示單獨(dú)檢測到其中任何一個突變位點(diǎn)均未導(dǎo)致耐藥，提示T69和V179系列突變位點(diǎn)不是導(dǎo)致NRTI和NNRTI耐藥的關(guān)鍵位點(diǎn)。NRTIs和NNRTIs同時耐藥發(fā)生率為35.77%，明顯低于印度Khan等[11]報道的88%。鑒于NRTI和NNRTI的耐藥情況和藥物間交叉耐藥現(xiàn)象，美國國際抗病毒協(xié)會建議新確診HIV者在啟動ART前先完善耐藥檢測以指導(dǎo)臨床用藥，而經(jīng)治患者如出現(xiàn)病毒學(xué)突破時建議先完善耐藥檢測[15]。而在NNRTI耐藥率超過10%的國家以及撒哈拉以南的非洲等資源有限的地區(qū)，WHO更是直接推薦使用具有高耐藥屏障的多替拉韋作為一線的ART方案或完善治療前耐藥檢測[16-17]。

本研究中，有45.26%病毒學(xué)抑制失敗的標(biāo)本經(jīng)過耐藥檢測未顯示出耐藥。既往有研究發(fā)現(xiàn)，服藥依從性差、低血紅蛋白、合并乙肝、HIV確證到治療時間間隔時間長等可導(dǎo)致病毒學(xué)抑制失敗[8-9,18-20]。本研究屬于橫斷面研究，缺乏對既往用藥依從性、不規(guī)范用藥情況、是否貧血、合并乙肝以及確證到啟動ART時間間隔的調(diào)查和研究，為下一步分析研究提供思路。

綜上所述，廣西桂南地區(qū)HIV/AIDS患者接受免費(fèi)抗病毒治療后發(fā)生病毒學(xué)失敗率約為10%，耐藥是病毒學(xué)抑制失敗的主要因素，耐藥以NRTIs和NNRTIs為主。而PI耐藥率低，仍是目前我區(qū)二線國家免費(fèi)藥譜中的理想藥物。

利益相關(guān)聲明：本文中所有作者無利益沖突！

作者貢獻(xiàn)說明：第一作者盧煥主要負(fù)責(zé)論文數(shù)據(jù)的臨床收集、整理、分析和以及論文構(gòu)思以及撰寫；第二作者吳念寧主要負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)實驗室檢測；第三作者歐汝志主要負(fù)責(zé)臨床數(shù)據(jù)收集；第四作者李雪琴主要負(fù)責(zé)臨床數(shù)據(jù)收集；第五作者黎彥君(通信作者1)主要負(fù)責(zé)臨床數(shù)據(jù)收集、論文構(gòu)思、論文數(shù)據(jù)校對；第六作者吳鋒耀(通信作者2)主要負(fù)責(zé)臨床論文撰寫數(shù)據(jù)審核、論文內(nèi)容審閱和校驗。