不同物種ANGPTL4基因及其蛋白理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析

呂文濤，楊 華，楊彩梅，李 娜,，鄭自彬，王遠(yuǎn)霞，王興鑫,，肖英平*

（1.省部共建國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，浙江杭州 310000；2.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江杭州 311300）

血管生成素樣蛋白4（Angiopoietin-Like Protein 4，），也稱(chēng)為禁食誘導(dǎo)脂肪因子（Fasting Induced Adipose Factor，），是一類(lèi)與血管生成素（Angiopoietin，）結(jié)構(gòu)類(lèi)似的分泌性蛋白家族成員。ANGPTL4具有N端的卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)域和C端的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域，主要參與脂肪代謝、糖代謝、血管生成、炎癥反應(yīng)及胰島素敏感性等生理狀況的調(diào)節(jié)，尤其對(duì)脂肪代謝有著重要的調(diào)控作用，同時(shí)已有研究證實(shí)還在調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展和診療中起重要作用。Nielsen等研究發(fā)現(xiàn)ANGPTL4蛋白參與脂質(zhì)代謝，通過(guò)抑制活性起作用，會(huì)導(dǎo)致血漿甘油三酯（Triglyceride，TG）衍生的脂肪酸釋放減少。Altun等已確定肝脂肪變性患者血清表達(dá)水平較低，通過(guò)游離脂肪酸代謝和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-（）的誘導(dǎo)，在脂肪肝疾病發(fā)病機(jī)制中起重要作用。Aronsson等研究表明，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)受腸道菌群調(diào)控，腸桿菌增加會(huì)抑制的表達(dá)，使得表達(dá)不受抑制而導(dǎo)致脂質(zhì)沉積。的功能研究主要集中在人類(lèi)和小鼠2個(gè)物種上，豬和牛的分別于2006年和2014年發(fā)現(xiàn)并開(kāi)始研究其功能。在不同物種中的功能類(lèi)似，通過(guò)抑制活性和提高脂肪細(xì)胞中甘油三酯的分解，從而降低機(jī)體脂肪組織的重量。然而，幾種主要?jiǎng)游锏腁NGPTL4蛋白生物信息學(xué)分析對(duì)比尚未有人研究。本文通過(guò)分析ANGPTL4的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，從生物信息學(xué)角度揭示ANGPTL4的功能和作用，為探究不同物種ANGPTL4蛋白的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 不同物種基因序列的獲取 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得人、鼠、馬、貓、牛、羊、豬、雞、鴨、粉腳雁和黃顙魚(yú)的基因和蛋白質(zhì)編碼登錄號(hào)，如表1所示。

表1 11個(gè)物種的ANGPTL4基因和蛋白登錄號(hào)

1.2 構(gòu)建ANGPTL4蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 利用Ensembl（http://www.ensembl.org/index.html）數(shù)據(jù)庫(kù)信息，選取11種物種相應(yīng)的源基因，然后使用BioEdit（Verision8）軟件對(duì)上述不同物種基因蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，采用Poisson model模型及MEGA7.0 Neighbor-Joining方法構(gòu)建物種間系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3 不同物種ANGPTL4基本理化性質(zhì)分析 采用各種在線分析網(wǎng)站對(duì)豬、雞、鴨、粉腳雁和黃顙魚(yú)ANGPTL4的信號(hào)肽區(qū)域、易于被特定蛋白酶磷酸化的位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、跨膜區(qū)及可能的螺旋卷曲結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，并將豬、雞、鴨、粉腳雁和黃顙魚(yú)的ANGPTL4蛋白進(jìn)行比較。各理化性質(zhì)分析及在線分析網(wǎng)站如表2所示。

表2 不同物種的ANGPTL4基本理化性質(zhì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1基因的序列相似性與系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.1.1 不同物種編碼區(qū)序列相似性比對(duì) 如表3所示，反芻動(dòng)物牛和羊之間編碼區(qū)序列的相似性最高，達(dá)到97.60%；其次是鴨和粉腳雁，序列相似性達(dá)到97.50%；人與黃顙魚(yú)的序列相似性最低，為49.50%。由表3可以看出，反芻動(dòng)物及禽類(lèi)在物種之間序列相似性很高，而其余物種之間的序列相似性不高（51.00%～62.60%）。

表3 不同物種編碼區(qū)（CDS）序列比例 %

2.1.2 不同物種ANGPTL4蛋白進(jìn)化樹(shù) 如圖1所示，鴨與粉腳雁、雞的親緣關(guān)系最近，與黃顙魚(yú)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；哺乳類(lèi)動(dòng)物中，鴨與鼠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。鴨和粉腳雁的關(guān)系最近，表明在禽類(lèi)中遺傳和表達(dá)差異最小，其次與雞的關(guān)系最近，表明在家禽中的表達(dá)差異較小。

圖1 不同物種ANGPTL 4蛋白的進(jìn)化樹(shù)

2.2的基本理化性質(zhì)分析 如表4所示，豬、雞、鴨、粉腳雁和黃顙魚(yú)的親水性均為負(fù)值，預(yù)測(cè)結(jié)果表明ANGPTL4蛋白為親水性蛋白。鴨的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，分析結(jié)果表明鴨ANGPTL4蛋白為穩(wěn)定性蛋白；而豬、雞、粉腳雁和黃顙魚(yú)的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，表明該4個(gè)物種的ANGPTL4蛋白為不穩(wěn)定性蛋白。如圖2所示，這幾種物種的氨基酸組成中都含有20種常見(jiàn)的氨基酸，亮氨酸（Leu）含量最高，半胱氨酸（Cys）含量最低；此外，3種禽類(lèi)：雞（）、鴨（）和粉腳雁（）的ANGPTL4的氨基酸含量差別不大，而豬（）和黃顙魚(yú)（）與3種禽類(lèi)的ANGPTL4中多數(shù)氨基酸含量差異比較大。

圖2 不同物種ANGPTL4氨基酸含量比

表4 不同物種ANGPTL4的基本理化性質(zhì)分析結(jié)果

2.3 ANGPTL4的親水/疏水性分析 如圖3所示，在1～20位之間5個(gè)物種氨基酸序列都極具疏水性。豬ANGPTL4疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)在第13位的亮氨酸、第14位的半胱氨酸，分值為2.311；親水性最強(qiáng)位點(diǎn)是第378位的谷氨酸，分值為-3.711。雞ANGPTL4疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)在第10位的亮氨酸、第11位的半胱氨酸，分值為2.544；親水性最強(qiáng)位點(diǎn)是第444位的組氨酸，分值為-3.633。鴨ANGPTL4疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)在第10位的亮氨酸、第11位的半胱氨酸、第12位的丙氨酸，分值為2.589；親水性最強(qiáng)位點(diǎn)是第448位的組氨酸，分值為-3.633。粉腳雁ANGPTL4疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)在第10位的亮氨酸、第11位的半胱氨酸、第12位的丙氨酸，分值為2.589；親水性最強(qiáng)位點(diǎn)是第450位的組氨酸，分值為-3.633。黃顙魚(yú)ANGPTL4疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)在第12位的蘇氨酸，分值為2.733；親水性最強(qiáng)位點(diǎn)是第368位的天冬氨酸，分值為-3.844。整體來(lái)看，ANGPTL4蛋白親水性氨基酸的數(shù)量遠(yuǎn)多于疏水性氨基酸的數(shù)量，表明ANGPTL4為親水性蛋白，與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。

圖3 不同物種ANGPTL4親水/疏水曲線

2.4 ANGPTL4的信號(hào)肽分析 如圖4可知，不同物種在第18～26位氨基酸之間存在裂解位點(diǎn)；豬、雞、鴨、粉腳雁和黃顙魚(yú)氨基酸序列的裂解位點(diǎn)分別在25～26、18～19、19～20、20～21、20～21位；因此ANGPTL4蛋白存在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。且利用TMHMM 2.0分析發(fā)現(xiàn)，豬、雞、鴨、粉腳雁和黃顙魚(yú)的基因編碼殘基的所有氨基酸都不存在跨膜區(qū)域。

圖4 不同物種ANGPTL4信號(hào)肽分析

2.5 ANGPTL4的磷酸化位點(diǎn) 如圖5所示，豬ANGPTL4編碼蛋白有23個(gè)潛在磷酸位點(diǎn)，其中包括有15個(gè)Ser、7個(gè)Thr和1個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)；雞ANGPTL4編碼蛋白有37個(gè)潛在磷酸位點(diǎn)，其中包括有25個(gè)Ser、10個(gè)Thr和2個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)；鴨ANGPTL4編碼蛋白有40個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，其中包括有27個(gè)Ser、10個(gè)Thr和3個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)；粉腳雁ANGPTL4編碼蛋白有34個(gè)潛在磷酸位點(diǎn)，其中包括有23個(gè)Ser、9個(gè)Thr和2個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)；黃顙魚(yú)ANGPTL4編碼蛋白有43個(gè)潛在磷酸位點(diǎn)，其中包括有28個(gè)Ser、13個(gè)Thr和2個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)。同時(shí)從圖6可以看出，ANGPTL4蛋白質(zhì)序列中有易被特定蛋白酶磷酸化的位點(diǎn)，結(jié)果顯示：豬在S74位含有1種嗜堿性絲氨酸-蘇氨酸激酶（Baso-ST-kin）、在V281位有1種激酶結(jié)合位點(diǎn)群（Kin-bind）、在W389位有1種脂酶結(jié)合位點(diǎn)群（lip-bind）；雞在S85位和S238位各有1種嗜堿性絲氨酸-蘇氨酸激酶群（Baso-ST-kin）、在W455位有1種脂酶結(jié)合位點(diǎn)群（lip-bind）；鴨在S91位含有1種嗜堿性絲氨酸-蘇氨酸激酶（Baso-ST-kin）、在W459位有1種脂酶結(jié)合位點(diǎn)群（lip-bind）；粉腳雁在S91位含有1種嗜堿性絲氨酸-蘇氨酸激酶（Baso-ST-kin）、在W461位有1種脂酶結(jié)合位點(diǎn)群（lip-bind）；黃顙魚(yú)在W418位有1種脂酶結(jié)合位點(diǎn)群（lip-bind）。

圖5 不同物種ANGPTL4序列中磷酸化位點(diǎn)

圖6 不同物種ANGPTL4序列中易于被特定蛋白酶磷酸化位點(diǎn)

2.6 ANGPTL4的糖基化分析 分析發(fā)現(xiàn)，豬只有1個(gè)典型N糖基化位點(diǎn)，位于183位；雞有5個(gè)典型的N糖基化位點(diǎn)，分別位于88、124、165、224、247位；鴨ANGPTL4有5個(gè)典型的N糖基化位點(diǎn)，分別位于第94、130、171、230、249位；粉腳雁ANGPTL4有6個(gè)典型的N糖基化位點(diǎn)，分別位于第94、130、171、230、249、253位；黃顙魚(yú)有5個(gè)典型的N糖基化位點(diǎn)79、115、151、205、335。

2.7基因編碼蛋白的卷曲螺旋分析 分析發(fā)現(xiàn)，不同物種的卷曲螺旋數(shù)量存在差異，但在50～250位氨基酸序列，大部分物種存在至少一個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

2.8 不同物種ANGPTL4二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模 如圖7所示，豬ANGPTL4蛋白由412個(gè)氨基酸組成，包含12個(gè)螺旋和8個(gè)折疊；雞ANGPTL4蛋白由478個(gè)氨基酸組成，包含17個(gè)螺旋和6個(gè)折疊；鴨ANGPTL4蛋白由482個(gè)氨基酸組成，17個(gè)螺旋和6個(gè)折疊；粉腳雁ANGPTL4蛋白由480個(gè)氨基酸組成，19個(gè)螺旋和6個(gè)折疊；黃顙魚(yú)ANGPTL4蛋白由436個(gè)氨基酸組成，包含14個(gè)螺旋和11個(gè)折疊。

圖7 不同物種ANGPTL4二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

ANGPTL4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖8所示。豬蛋白結(jié)構(gòu)C值為-0.5，目標(biāo)蛋白和模板蛋白結(jié)構(gòu)相似性的TM值為0.65±0.13；雞蛋白結(jié)構(gòu)C值為-1.48，目標(biāo)蛋白和模板蛋白結(jié)構(gòu)相似性的TM值為0.53±0.15；鴨ANGPTL4預(yù)測(cè)結(jié)果的蛋白結(jié)構(gòu)C值為-1.91，目標(biāo)蛋白和模板蛋白結(jié)構(gòu)相似性的TM值為0.49±0.15；黃顙魚(yú)蛋白結(jié)構(gòu)C值為-1.79，目標(biāo)蛋白和模板蛋白的結(jié)構(gòu)相似性的TM值為0.50±0.15。

圖8 不同物種ANGPTL4蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討 論

ANGPTL4蛋白在機(jī)體的多個(gè)組織中都有表達(dá)，結(jié)構(gòu)類(lèi)似于血管生成素，但功能有所不同；mRNA在白色脂肪和肝臟中表達(dá)較多。Kim等利用ANG同源基因的PCR擴(kuò)增尋找ANG的同源蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)了ANGPTL4蛋白家族；Kersten等在肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了新的靶基因——，又稱(chēng)為。2002年，國(guó)際人類(lèi)基因組織將該基因命名。

本文通過(guò)生物信息軟件對(duì)不同物種ANGPTL4蛋白的理化性質(zhì)、生物學(xué)功能、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、蛋白二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了分析及預(yù)測(cè)。分析表明，家禽之間親緣關(guān)系最近，鴨與粉腳雁序列相關(guān)性高達(dá)94.4%、鴨與雞的高達(dá)88.20%。結(jié)構(gòu)決定功能，因此可以推測(cè)，鴨的功能與粉腳雁和雞的功能類(lèi)似，促進(jìn)脂代謝并抑制LPL活性，進(jìn)而引起高血脂。蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中的半胱氨酸多形成二硫鍵以增強(qiáng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而亮氨酸含有疏水側(cè)鏈，疏水作用是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力，因此亮氨酸等疏水氨基酸常作為水溶性蛋白質(zhì)的內(nèi)部支撐結(jié)構(gòu)。氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，亮氨酸含量最高，半胱氨酸含量最低，可以推測(cè)ANGPTL4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性低且水溶性較好，與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。分析結(jié)果表明ANGPTL4為細(xì)胞外的可溶性蛋白。整體來(lái)看，ANGPTL4蛋白親水性氨基酸的數(shù)量遠(yuǎn)多于疏水性氨基酸的數(shù)量，表明ANGPTL4為親水性蛋白，與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。

信號(hào)肽作為蛋白質(zhì)的一個(gè)片段，是蛋白質(zhì)合成并釋放到胞外不可或缺的一部分。信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4在N端前有一段信號(hào)肽，結(jié)合各物種ANGPTL4親水/疏水性分析比較顯示1～20位氨基酸極具疏水性，表明ANGPTL4前端信號(hào)肽序列極具疏水性。此外，分析表明ANGPTL4不存在跨膜結(jié)構(gòu)，推測(cè)ANGPTL4可能不通過(guò)跨膜發(fā)揮生物學(xué)作用，而在胞外或者固定在細(xì)胞膜表面發(fā)揮其生物學(xué)功能，這與已知的豬和雞的功能一致。

蛋白質(zhì)的磷酸化是由蛋白質(zhì)激酶（Kinase）催化的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，是最常見(jiàn)、最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用，磷酸化主要發(fā)生在蛋白質(zhì)的絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）等殘基上。磷酸化反應(yīng)后，由于蛋白質(zhì)加入了磷酸基團(tuán)，蛋白質(zhì)的構(gòu)型、活性及其與其他分子相互作用的性能發(fā)生了改變。本研究的分析結(jié)果表明，ANGPTL4有多個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，初步揭示ANGPTL4蛋白的這些位點(diǎn)可能是調(diào)控活性的靶點(diǎn)。Costa等研究中指出在脊椎動(dòng)物發(fā)育中對(duì)脂質(zhì)和TG代謝起重要作用。是乳糜微粒、極低密度脂蛋白（Very low density lipoprotein，VLDL）等代謝關(guān)鍵因子，將血液中乳糜微粒和VLDL中的TG催化水解為甘油和脂肪酸，在血脂代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要作用。從分析結(jié)果來(lái)看，不同物種ANGPTL4磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)中發(fā)現(xiàn)激酶和脂蛋白脂酶結(jié)合位點(diǎn)群，揭示ANGPTL4蛋白參與機(jī)體脂質(zhì)代謝過(guò)程。

蛋白糖基化也是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，是由糖基轉(zhuǎn)移酶催化的單糖與蛋白質(zhì)上的某些殘基形成共價(jià)連接。糖基化通常使蛋白質(zhì)在水中的溶解度增大，并使不同的蛋白質(zhì)打上不同的標(biāo)記，改變多肽的構(gòu)象并增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。本研究中預(yù)測(cè)到了不同物種ANGPTL4蛋白的多個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)，且氨基酸功能位點(diǎn)集中在45～250位范圍內(nèi)，預(yù)測(cè)該區(qū)段內(nèi)的氨基酸對(duì)不同物種ANGPTL4蛋白發(fā)揮其生物學(xué)功能有重要意義。糖基化有能夠使蛋白質(zhì)抵抗消化酶、賦予蛋白質(zhì)傳導(dǎo)信號(hào)以及輔助蛋白在糖基化以后正確折疊等多種作用，具有重要的生物學(xué)意義。此外，在45～250位氨基酸殘基范圍內(nèi)，多數(shù)物種都存在至少1個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)和至少1個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可以推測(cè)的這個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)是其與其他分子相互作用的靶點(diǎn)。

4 結(jié) 論

本研究利用多種生物信息學(xué)軟件分析了豬、雞、鴨、粉腳雁和黃顙魚(yú)等幾種不同物種ANGPTL4蛋白的氨基酸組成特點(diǎn)、理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)：ANGPTL4蛋白的氨基酸組成在禽類(lèi)與哺乳動(dòng)物和水產(chǎn)之間有一定的差別；對(duì)各物種ANGPTL4蛋白的疏水性、磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)以及卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在45～250位氨基酸區(qū)域具有特定的理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)，推測(cè)該序列可作為調(diào)控功能的靶位點(diǎn)。該研究將為進(jìn)一步研究的特殊功能性及其與其他分子相互作用的機(jī)制提供了生物信息學(xué)參考。