褪黑素在牛體外胚胎生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

閻來(lái)慶，劉雪凝，劉巧香，劉國(guó)世*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.北京首農(nóng)食品集團(tuán)有限公司，北京 100028）

20世紀(jì)80年代末，世界首例完全通過(guò)體外受精和體外胚胎發(fā)育的牛獲得成功。隨著科學(xué)家們對(duì)牛配子和胚胎在體外生產(chǎn)的進(jìn)一步研究和理解，牛體外胚胎生產(chǎn)（IVP）技術(shù)取得重大進(jìn)展。根據(jù)國(guó)際胚胎移植協(xié)會(huì)（http://www.iets.orgCommittees/Data-Retrieval-Committee）最新發(fā)布的數(shù)據(jù)，2001年以來(lái)全世界移植IVP數(shù)量逐年增加，且在2016年移植體外生產(chǎn)胚胎的數(shù)量超過(guò)了移植體內(nèi)生產(chǎn)胚胎（IVD），表明牛場(chǎng)胚胎生產(chǎn)正在從傳統(tǒng)的IVD向IVP轉(zhuǎn)變。

在體外胚胎生產(chǎn)過(guò)程中，卵母細(xì)胞體外成熟、受精（與精子共孵育）、胚胎發(fā)育和冷凍保存等都是在高氧環(huán)境下進(jìn)行，配子和胚胎的微環(huán)境發(fā)生巨大變化，這直接影響到它們的功能和生存能力。褪黑素可以改善體外培養(yǎng)微環(huán)境并且中和引起細(xì)胞損傷的活性氧（ROS）和活性氮（RNS），降低脂質(zhì)過(guò)氧化物濃度和DNA損傷，從而提高生殖細(xì)胞和胚胎細(xì)胞的活力，可在牛胚胎體外生產(chǎn)中發(fā)揮積極作用。本文對(duì)褪黑素在牛胚胎體外生產(chǎn)和保存中的作用進(jìn)行綜述，以期為后續(xù)體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的優(yōu)化研究和推廣應(yīng)用提供參考。

1 褪黑素在牛卵母細(xì)胞體外成熟中的作用

卵母細(xì)胞成熟包括發(fā)育中卵子的核和胞質(zhì)成熟。卵母細(xì)胞核成熟是指在排卵時(shí)從第一次減數(shù)分裂前期到第2次減數(shù)分裂中期（MII）的減數(shù)分裂過(guò)程。隨著核成熟，卵母細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄本發(fā)生一系列變化，進(jìn)而達(dá)到卵母細(xì)胞質(zhì)成熟。在體外條件下，牛卵母細(xì)胞通常會(huì)在20～24 h完成核成熟到MII。

哺乳動(dòng)物卵巢中存在褪黑素的膜受體和核受體，褪黑素在卵巢中的某些作用可能與膜受體有關(guān)。這些受體也存在于顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中，表明褪黑素可直接作用于卵巢細(xì)胞，并調(diào)節(jié)卵巢相關(guān)生理活動(dòng)。褪黑素膜受體mRNAs也存在于牛卵母細(xì)胞和牛卵丘細(xì)胞中，并對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)和核的成熟有積極影響。

在體外成熟過(guò)程中，氧化應(yīng)激是造成卵母細(xì)胞損傷的主要原因之一。體外處理過(guò)程中，卵母細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間暴露在光線下，環(huán)境氧氣濃度升高可導(dǎo)致ROS增加。研究發(fā)現(xiàn)在體外成熟培養(yǎng)液中添加褪黑素可以顯著降低牛卵母細(xì)胞的ROS水平，并促進(jìn)牛卵母細(xì)胞的體外成熟。El-Raey等研究發(fā)現(xiàn)，在成熟液中添加10、50 ng/mL褪黑素可促進(jìn)體外成熟卵母細(xì)胞從MI期向MII期的核轉(zhuǎn)變，并且能夠提高卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體彌散分布和卵丘細(xì)胞擴(kuò)張的比率，獲得較高的成熟率。Tian等研究發(fā)現(xiàn)褪黑素受體基因和在卵母細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中都有表達(dá)，推測(cè)褪黑素對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響是通過(guò)受體實(shí)現(xiàn)。

褪黑素不但能促進(jìn)體外牛卵母細(xì)胞的成熟，還能夠緩解一些惡劣條件下的卵母細(xì)胞體外成熟。褪黑素可以挽救農(nóng)藥百草枯PQ對(duì)牛卵母細(xì)胞的損傷，通過(guò)抑制卵母細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，提高谷胱甘肽GSH和抗氧化相關(guān)基因基因和mRNA水平，使絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路失活，從而使凋亡相關(guān)的mRNA比值發(fā)生有利的變化，從而阻止PQ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Yaacobi-Artzi等研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素通過(guò)降低ROS水平從而在一定程度上減輕熱休克對(duì)牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的影響，雖然熱休克牛卵母細(xì)胞發(fā)育的囊胚比例不受褪黑素影響，但線粒體功能相關(guān)基因的表達(dá)相對(duì)較高。

以上研究表明，無(wú)論是在體內(nèi)正常生理?xiàng)l件下，還是在體外應(yīng)激及惡劣條件下，褪黑素對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟都起著積極作用，然而不同條件下褪黑素作用的具體通路和機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2 褪黑素在牛體外受精過(guò)程中的作用

體外成熟完成后，通常對(duì)精子進(jìn)行洗滌和選擇，以去除冷凍液、精漿、碎片和死亡精子，精子與卵母細(xì)胞共孵育18～24 h，進(jìn)行體外受精。牛精液的質(zhì)量和卵母細(xì)胞成熟效果對(duì)牛胚胎體外受精至關(guān)重要。

褪黑素對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟和卵母細(xì)胞體外受精起積極作用。在體外受精過(guò)程中，皮質(zhì)顆粒（CGs）的胞吐（皮質(zhì)反應(yīng)）是卵母細(xì)胞用來(lái)防止多精受精的最常見(jiàn)機(jī)制之一，CGs的正常分布是確保單精子受精所必需的。Juno蛋白在阻止多精受精方面也起著重要作用。Zhao等研究表明，褪黑素處理組的卵母細(xì)胞中CGs的正常分布率更高，表達(dá)水平更高，結(jié)果證明褪黑素通過(guò)改善細(xì)胞器的正常分布，提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）和三磷酸腺苷（ATP）水平，增強(qiáng)抗氧化基因表達(dá)水平，調(diào)節(jié)受精相關(guān)事件，進(jìn)而提高受精能力和發(fā)育能力。

精子在體外培養(yǎng)過(guò)程中易受氧化應(yīng)激影響，這是因?yàn)榫拥募?xì)胞膜富含多不飽和脂肪酸，對(duì)體外培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的ROS很敏感，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化（LPO），接下來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞毒性醛（如丙二醛）等連鎖反應(yīng)。丙二醛可以與蛋白質(zhì)結(jié)合并誘導(dǎo)關(guān)鍵細(xì)胞蛋白質(zhì)的氧化修飾，對(duì)線粒體功能產(chǎn)生負(fù)面影響，并對(duì)精子的中段和軸絲結(jié)構(gòu)造成損害。此外，LPO增加和膜功能改變可以通過(guò)降低新陳代謝、活力、頂體反應(yīng)、反應(yīng)性和融合能力，以及對(duì)精子DNA的氧化損傷從而導(dǎo)致精子功能障礙，這些變化共同導(dǎo)致體外受精能力低下。

孫業(yè)清研究發(fā)現(xiàn)褪黑素處理精子會(huì)顯著降低精子細(xì)胞內(nèi)的 ROS 水平，質(zhì)膜、線粒體膜和頂體完整的精子比例提高，精液品質(zhì)得到明顯改善。Cheuquemán等報(bào)道褪黑素濃度對(duì)公牛精子有模式效應(yīng)，在生理濃度下具有獲能調(diào)節(jié)作用和保護(hù)作用。隨著牛產(chǎn)業(yè)的逐步發(fā)展，性控精液在牛場(chǎng)繁育過(guò)程中扮演者重要角色。褪黑素不但對(duì)常規(guī)選擇下的精子起作用，其對(duì)性別控制選擇的精液也有著重要作用。Li等研究發(fā)現(xiàn)褪黑素會(huì)顯著降低公牛性別分離精子的ROS水平，提高超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性，抑制磷脂酰絲氨酸外化和丙二醛水平，提高線粒體膜電位?、頂體完整率和受精能力，從而提高體外受精效率。

3 褪黑素在牛早期胚胎發(fā)育中的作用

在體外受精（IVF）后，受精的卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng) 7 d，20%～40%的受精卵到達(dá)囊胚階段。家畜胚胎含有較高含量的脂質(zhì)，在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中起著重要的能量代謝作用。體外胚胎生產(chǎn)效率較低的原因可能與胚胎暴露在相對(duì)較高的氧氣濃度下有關(guān)，這會(huì)導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生增加。ROS的產(chǎn)生被認(rèn)為是體外胚胎產(chǎn)量低的主要原因，這是由于過(guò)量的ROS會(huì)與脂質(zhì)相互作用，從而破壞關(guān)鍵的細(xì)胞分子，導(dǎo)致膜完整性喪失、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能改變以及核酸損傷。ROS還參與線粒體改變、胚胎阻滯、ATP耗竭和細(xì)胞凋亡等進(jìn)程進(jìn)而影響胚胎的發(fā)育和著床。

Wang等研究發(fā)現(xiàn)褪黑素上調(diào)促類(lèi)固醇基因和表達(dá)，促進(jìn)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）孕酮和雌二醇的分泌；褪黑素通過(guò)降低胚胎內(nèi)的ROS水平提高牛的孤雌生殖、雄核胚胎發(fā)育、胚胎卵裂率和桑椹胚、囊胚發(fā)育率。在胚胎體外培養(yǎng)液中添加褪黑素可以促進(jìn)牛胚胎的體外發(fā)育，上調(diào)牛胚胎發(fā)育過(guò)程中抗氧化抗凋亡基因和和發(fā)育相關(guān)重要基因和的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)促凋亡基因和的表達(dá)，提高卵裂率和囊胚率。Marques等實(shí)驗(yàn)表明褪黑素處理能提高囊胚發(fā)育效率，減少凋亡細(xì)胞數(shù)，增強(qiáng)抗氧化基因和熱休克蛋白HSPB1的表達(dá)水平。

褪黑素和AKT（一種絲氨酸/蘇氨酸特異的蛋白激酶）被確定為生殖所必需的幾個(gè)細(xì)胞過(guò)程的調(diào)節(jié)器。El等研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以消除AKT抑制劑SH6在牛卵母細(xì)胞和胚胎中的抗發(fā)育作用，具體體現(xiàn)在卵裂率和囊胚率的提高以及線粒體形態(tài)的改善；和等成熟、線粒體和卵丘擴(kuò)張相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，相關(guān)的凋亡調(diào)節(jié)因子和表達(dá)下調(diào)。

在明確褪黑素對(duì)牛早期胚胎的有益作用后，一些學(xué)者選擇一些更有效的供給褪黑素方式來(lái)代替在體外添加。Komninou等研究褪黑素納米膠囊對(duì)牛胚胎體外培養(yǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)褪黑素脂核納米囊通過(guò)下調(diào)和基因的表達(dá)，上調(diào)和基因的表達(dá)，從而增加胚胎細(xì)胞數(shù)，降低細(xì)胞凋亡率和活性氧水平，提高胚胎孵化率。

以上研究均證實(shí)了褪黑素對(duì)牛體外早期胚胎發(fā)育有著重要作用，接下來(lái)研究人員轉(zhuǎn)向研究在特殊情況下褪黑素在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的作用。Su等將褪黑素添加在體細(xì)胞核移植（SCNT）早期胚胎的發(fā)育液中，發(fā)現(xiàn)褪黑素影響凋亡、抗氧化和發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，改變組蛋白H3的K9乙?；?，增加SCNT囊胚的細(xì)胞總數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)，減少SCNT胚胎的凋亡和ROS水平，進(jìn)而提高體細(xì)胞核移植牛早期胚胎的妊娠和出生率。Gutiérrez-A?ez等研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可以改善初情期前的COCs在體外發(fā)育到囊胚的效率，在褪黑素添加后初情期前奶牛COCs的胚胎中胚胎細(xì)胞數(shù)達(dá)到成年奶牛水平。

4 褪黑素在牛配子和胚胎冷凍中的作用

配子和胚胎冷凍保存是胚胎工程中的重要環(huán)節(jié)，也是動(dòng)物保種、基因庫(kù)建立的必要手段。利用冷凍保存技術(shù)能夠保存珍稀動(dòng)物品種和優(yōu)良生產(chǎn)性能家畜的遺傳資源，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究方面的發(fā)展，推廣胚胎移植技術(shù)在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。冷凍保存和胚胎移植可以經(jīng)濟(jì)、省力地儲(chǔ)存和運(yùn)輸有價(jià)值的遺傳物質(zhì)，在降低疾病風(fēng)險(xiǎn)方面也有很大的優(yōu)勢(shì)。然而配子和胚胎的特殊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其對(duì)低溫十分敏感，配子和胚胎在冷凍解凍過(guò)程中也很容易產(chǎn)生ROS和RNS，進(jìn)而導(dǎo)致配子和胚胎受到氧化應(yīng)激的影響和細(xì)胞器的損傷。

精子的存活率、活力和膜完整性會(huì)在冷凍過(guò)程中下降，冷凍-解凍過(guò)程中的冷休克還可能破壞線粒體以及精子的質(zhì)膜和頂體膜。Ashrafi等研究發(fā)現(xiàn)在精液稀釋液中添加褪黑素可以抵消冷凍解凍過(guò)程對(duì)公牛精子活力、存活率、形態(tài)正常和質(zhì)膜完整性的不利影響。Pang等研究發(fā)現(xiàn)褪黑素處理牛精子后，精子與體外培養(yǎng)胚胎受精后胚胎發(fā)育到囊胚的比率顯著提高，囊胚的凋亡率顯著降低；褪黑素處理的精子產(chǎn)生的胚胎中和豐度顯著降低，而和轉(zhuǎn)錄豐度顯著升高。Perumal等在牛體內(nèi)埋植褪黑素后采集精液體外冷凍解凍，發(fā)現(xiàn)精液的運(yùn)動(dòng)參數(shù)、線粒體膜電位、抗氧化特性、核畸形比率、細(xì)胞內(nèi)酶流失以及精子體外透明帶結(jié)合能力指數(shù)均有顯著改善。

玻璃化冷凍會(huì)降低哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力和胚胎的著床能力，這主要是由于玻璃化冷凍導(dǎo)致卵母細(xì)胞中ROS活性和凋亡水平異常升高所致。褪黑素可以有效改善此類(lèi)情況，提高體外卵母細(xì)胞和胚胎的冷凍效率。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)在體外成熟液和玻璃化冷凍液中加入褪黑素可降低玻璃化卵母細(xì)胞的ROS、線粒體鈣離子、mRNA表達(dá)和Caspase3蛋白水平，降低磷脂酰絲氨酸外部化和DNA碎片率，提高線粒體膜電位和mRNA的表達(dá)水平，從而提高玻璃化冷凍卵母細(xì)胞孤雌激活后的發(fā)育能力。

在褪黑素對(duì)牛胚胎冷凍保存方面，Wang等研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可顯著提高解凍后24～72 h的囊胚孵化率，顯著降低解凍后48～72 h的死亡率；胚胎培養(yǎng)過(guò)程中加入褪黑素，解凍后基因表達(dá)顯著增加，基因表達(dá)顯著降低，提高牛胚胎的冷凍耐受性，從而提高牛胚胎質(zhì)量。Marques等研究培養(yǎng)液中添加褪黑素和玻璃化冷凍前去除囊胚液體對(duì)牛體外胚胎質(zhì)量和存活率的影響，發(fā)現(xiàn)在冷凍保存前添加褪黑素可提高胚胎的孵化率，提高編碼熱休克蛋白基因的表達(dá)；此外，在培養(yǎng)液中添加褪黑素對(duì)玻璃化冷凍囊胚的形態(tài)質(zhì)量、存活率、升溫后胚胎耐受性以及胚胎存活率都有著積極的作用。綜上研究都表明褪黑素不但對(duì)牛配子和胚胎體外正常條件下有著保護(hù)和促進(jìn)作用，而且對(duì)牛配子和胚胎冷凍保也存有積極影響。

5 展 望

隨著各種新的輔助生殖技術(shù)在牛場(chǎng)中的應(yīng)用，牛體外胚胎生產(chǎn)對(duì)牛場(chǎng)的生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)和發(fā)展變得愈發(fā)重要。在體外胚胎生產(chǎn)過(guò)程中的氧化應(yīng)激是限制其發(fā)展的主要因素之一，近些年褪黑素被認(rèn)為是一種重要的自由基清除劑，它的抗氧化性得到充分關(guān)注。目前已有多項(xiàng)研究表明，褪黑素在牛體外胚胎生產(chǎn)過(guò)程中有著積極的作用，然而褪黑素在體外培養(yǎng)不同條件下的添加方式和濃度還需要進(jìn)一步研究，以及褪黑素在這些過(guò)程中的具體作用機(jī)制還需要深入探索。