基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及全轉(zhuǎn)錄組測序?qū)Ξ?dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制多發(fā)性骨髓瘤血管新生的機(jī)制研究

付佳琪 蔡治國 于漫亞 郭志江 張云曉 崔興

〔摘要〕 目的 基于骨髓瘤細(xì)胞株外泌體測序及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究當(dāng)歸四逆湯抑制多發(fā)性骨髓瘤血管新生的機(jī)制，為后續(xù)研究提供有針對性的指導(dǎo)。方法 利用TCMSP在線平臺及SwissTargetPrediction網(wǎng)站獲取當(dāng)歸四逆湯主要化學(xué)成分及對應(yīng)靶點，借助GeneCards獲取多發(fā)性骨髓瘤血管新生相關(guān)靶點基因，經(jīng)與當(dāng)歸四逆湯作用靶點匹配后，獲得當(dāng)歸四逆湯抑制多發(fā)性骨髓瘤血管新生的作用靶點，并篩選出相應(yīng)作用成分。取正常人（n=5）和骨髓瘤患者（n=6）外周血清提取外泌體進(jìn)行測序，獲得差異表達(dá)基因。對骨髓瘤細(xì)胞外泌體進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序，取交集后獲得骨髓瘤來源外泌體差異表達(dá)基因。進(jìn)而與當(dāng)歸四逆湯抑制多發(fā)性骨髓瘤血管新生的作用靶點匹配，獲得當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制多發(fā)性骨髓瘤的作用靶點。借助STRING平臺與Cytoscape 3.8.2軟件對靶點間相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，并利用Metascape網(wǎng)站進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。運(yùn)用R語言對結(jié)果進(jìn)行可視化處理。最后對主要有效成分和作用靶點進(jìn)行分子對接驗證。結(jié)果 當(dāng)歸四逆湯作用于多發(fā)性骨髓瘤血管新生的有效成分有117種，干預(yù)外泌體發(fā)揮作用的相關(guān)靶點39個，包括CCND1、EGF等。GO分析結(jié)果顯示，當(dāng)歸四逆湯作用于多發(fā)性骨髓瘤血管新生潛在靶點的生物功能涉及血管新生、血管系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等。KEGG通路富集顯示，當(dāng)歸四逆湯作用于多發(fā)性骨髓瘤血管新生潛在靶點的通路主要涉及PI3K-AKT、HIF-1等與VEGF相關(guān)的信號通路等。分子對接結(jié)果表明主要有效成分槲皮素、樺木酸與關(guān)鍵作用靶點AKT1之間具有良好的對接活性。結(jié)論 本研究初步揭示了當(dāng)歸四逆湯能夠通過PI3K-AKT、HIF-1通路干預(yù)外泌體抑制多發(fā)性骨髓瘤血管新生，為進(jìn)一步的實驗研究提供基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕 外泌體;全轉(zhuǎn)錄組測序;當(dāng)歸四逆湯;多發(fā)性骨髓瘤;血管新生;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.01.024

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of Danggui Sini Decoction in inhibition of angiogenesis in multiple myeloma based on exosome sequencing of myeloma cells and network pharmacology， in order to provide targeted guidance for further studies. Methods The main chemical components and corresponding targets of Danggui Sini Decoction were obtained by TCMSP online platform and SwissTargetPrediction website. GeneCards was used to obtain the target genes related to angiogenesis of multiple myeloma. After matching with the targets of Danggui Sini Decoction， the targets of Danggui Sini Decoction inhibiting angiogenesis of multiple myeloma was obtained， and the corresponding action components were screened. Exosomes were extracted from peripheral blood serum of normal persons （n=5） and myeloma patients （n=6） and sequenced to obtain differentially expressed genes. Whole transcriptome sequencing of myeloma exosomes was performed， and the differentially expressed genes of myeloma-derived exosomes were obtained after intersection. Then， the targets of Danggui Sini Decoction in inhibiting angiogenesis of multiple myeloma were matched， and the targets of Danggui Sini Decoction intervening exosomes in inhibiting multiple myeloma were obtained. The interaction network between targets was analyzed by STRING platform and Cytoscape 3.8.2 software， and GO function and KEGG pathway enrichment analysis were performed by Metascape website. R language was used to visualize the results. Finally， molecular docking verification was performed on the main effective components and targets. Results There were 117 effective components of Danggui Sini Decoction on angiogenesis in multiple myeloma， and 39 related targets for intervention of exosomes， including CCND1， EGF， etc. GO analysis showed that the biological functions of potential targets of Danggui Sini Decoction on angiogenesis in multiple myeloma were related to angiogenesis， vascular system development and cell cycle regulation. KEGG pathway enrichment showed that the pathways of Danggui Sini Decoction acting on potential targets of multiple myeloma angiogenesis mainly involved PI3K-AKT， HIF-1 and other VEGF-related signaling pathways. Molecular docking results showed that quercetin and betulinic acid had good docking activity with key target AKT1. Conclusion This study preliminarily revealed Danggui Sini Decoction can intervene exosomes to inhibit multiple myeloma angiogenesis through PI3K-Akt and HIF-1 pathways， providing a basis for further research.

〔Keywords〕 exosome; whole transcriptome sequencing; Danggui Sini Decoction; multiple myeloma; angiogenesis; network pharmacology

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）屬于中醫(yī)學(xué)“骨蝕”“骨痹”的范疇。中醫(yī)理論認(rèn)為，腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要病因病機(jī)是寒凝瘀血內(nèi)阻。寒凝血瘀證表明腫瘤組織處于缺血缺氧的微環(huán)境中[1]，這種微環(huán)境能促進(jìn)腫瘤分泌攜帶有血管生成因子的外泌體[2]，促使腫瘤血管的新生?！端貑枴ふ{(diào)經(jīng)論》中載有“血氣者，喜溫而惡寒，寒則泣不能流，溫則消而去之”的治則，因而可以采用溫陽化瘀的中藥治療本病。溫陽化瘀中藥能夠改善機(jī)體高凝狀態(tài)和腫瘤周圍組織微循環(huán)，不僅可以直接抑制腫瘤血管新生，還能夠通過改善腫瘤周圍組織微環(huán)境，從腫瘤的生物學(xué)特征與血管生成相關(guān)因子等方面，阻斷腫瘤的血管新生[3]。當(dāng)歸四逆湯源于《傷寒雜病論》，為醫(yī)圣張仲景所作的經(jīng)典名方。本方溫陽活血通脈并舉，恰符合抑制外泌體所介導(dǎo)腫瘤血管新生的機(jī)制。

腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生是大多數(shù)惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的前提[4]，越來越多的研究表明，血管新生是MM瘤生長、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中的重要環(huán)節(jié)[5]。沙利度胺、來那度胺可以通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生成因子（basic fibroblast growth factor， BFGF）等的表達(dá)進(jìn)而抑制血管新生[6]，目前在MM的治療中已取得較好臨床效果[4]。外泌體對細(xì)胞通訊有著重要作用，能夠參與多種生物過程，如細(xì)胞凋亡、血管形成、炎癥等[7]。在對MM瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，外泌體中富含雙調(diào)蛋白（amphiregulin， AREG），而AREG可以通過激活表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）[8]促進(jìn)血管新生;外泌體亦可通過靶向抑制缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor 1， HIF-1）增強(qiáng)血管生成[9]，從而參與骨髓微環(huán)境的血管新生，這些特點為抑制MM血管新生的治療提供了新的靶點。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠系統(tǒng)地研究藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和影響[10]，其整體觀和系統(tǒng)理論與中醫(yī)學(xué)的整體觀念及中藥方劑多靶點、多成分的原理相一致，是研究中藥復(fù)方配伍與藥理作用的有效技術(shù)方法。分子對接技術(shù)通過理論模擬受體與配體之間的相互作用，預(yù)測其結(jié)合模式和親和力，從而能夠完善藥理學(xué)實驗的設(shè)計。

本研究通過提取外泌體并進(jìn)行分析，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，旨在闡釋當(dāng)歸四逆湯抑制MM血管新生的有效活性成分及可能的分子機(jī)制，為后續(xù)的實驗研究提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 ?外泌體提取與分析

1.1.1 ?試劑與儀器 ?RPMI-1640培養(yǎng)液（產(chǎn)品編號：CF0001-500ML）、RIPA裂解緩沖液均購自濟(jì)南Spark jade生物技術(shù)有限公司;胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）（上海Beyotime生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號：C0256）;anti-Calnexin（產(chǎn)品編號：sc-46669）、anti-TSG101（產(chǎn)品編號：sc-101254）、anti-CD63（產(chǎn)品編號：sc-5257）均購自美國Santa Cruz公司;外泌體快速沉淀試劑盒（美國System Bioscience公司）;透射電鏡（日本Hitachi公司，型號：TEM-HT7700）;BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒（上海Beyotime生物技術(shù)有限公司）。

1.1.2 ?臨床血清標(biāo)本 ?本研究納入2019年8月在山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（中國濟(jì)南）血液科住院的6例MM患者。招募5名健康志愿者作為對照組。該研究獲得山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有參與者在試驗前簽署了知情同意書。將外周血樣品收集在真空促凝管中，并在離心（離心半徑16 cm，2500 r/min）5 min后獲得血清樣品。

1.1.3 ?U266細(xì)胞株培養(yǎng)收集上清液 ?MM細(xì)胞系U266來自美國模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection， ATCC），置于含有10% FBS、1%雙抗的培養(yǎng)液中，并放在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞到密度80%左右，棄上清，應(yīng)用PBS洗滌細(xì)胞沉淀2次。將培養(yǎng)基更換為含有10%去除外泌體的FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后收集細(xì)胞上清液。

1.1.4 ?外泌體提取 ?通過Exo Quick外泌體快速沉淀試劑盒分離正常人外周血血清及U266細(xì)胞上清液的外泌體。將250 μL血清樣品與63 μL Exo Quick外泌體沉淀溶液混合，在冰上孵育30 min并離心，然后吸取上清液，離心5 min，最后分離沉淀中的外泌體。

1.1.5 ?透射電鏡分析 ?用4%多聚甲醛固定外泌體，用PBS洗滌。將樣品在室溫下放置在碳涂覆的200目銅網(wǎng)格上20 min，并在1%戊二醛中固定5 min，然后用去離子水洗滌3次。用草酸鈾酰對樣品進(jìn)行染色5 min，并以1∶9的比例加入一滴4%乙酸鈾酰和2%甲基纖維素在冰上包埋，再用透射電子顯微鏡對干燥的網(wǎng)格成像。

1.1.6 ?蛋白印跡分析 ?對MM患者和健康志愿者血清中提取的外泌體分別進(jìn)行蛋白印跡分析。用RIPA裂解緩沖液（Spark jade）裂解細(xì)胞，用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定（Beyotime）蛋白質(zhì)濃度。等量的樣品蛋白用10% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在5%脫脂奶溶液中浸泡2 h后，將膜在40 ℃下與一級抗體anti-Calnexin， anti-TSG101， anti-CD63（Santa Cruz Biotechnology， Santa Cruz， CA， USA）一起孵育過夜。然后，將膜與第二抗體（Beyotime）一起孵育1 h。最后，使用Alpha Innotech

Fluor Chem Q成像分析系統(tǒng)進(jìn)行可視化。

1.1.7 ?高通量測序 ?利用Illumina Hiseq儀器上述兩種來源的外泌體進(jìn)行150 bp雙端測序，相關(guān)基因表達(dá)分析由上海云序生物科技有限公司進(jìn)行。

1.2 ?網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.2.1 ?當(dāng)歸四逆湯有效成分及靶點的篩選 ?通過TCMSP在線平臺[11]尋找當(dāng)歸四逆湯中當(dāng)歸、桂枝、白芍、細(xì)辛、通草、甘草、大棗的化學(xué)組成成分，根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%和類藥性（drug likeness， DL）≥0.18的2個ADME屬性值篩選出符合條件的化學(xué)成分及其對應(yīng)靶點，借助UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)定為“human”，將靶點轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的基因，并利用SwissTargetPrediction網(wǎng)站[12]（http：//www.swisstargetprediction.ch/）補(bǔ)充藥物有效成分的作用靶點信息。

1.2.2 ?MM靶點的收集與篩選 ?以“multiple myeloma and angiogenesis”為檢索詞，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索相應(yīng)的靶點。合并2個疾病數(shù)據(jù)庫靶點后，刪除重復(fù)值得到MM靶點。

1.2.3 ?當(dāng)歸四逆湯成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 ?將當(dāng)歸四逆湯成分靶點與MM血管新生靶點取交集，獲得當(dāng)歸四逆湯抑制MM血管新生的作用靶點。根據(jù)交集靶點反向篩選當(dāng)歸四逆湯有效成分，構(gòu)建當(dāng)歸四逆湯成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件[13]，使用Network Analyzer功能進(jìn)一步分析當(dāng)歸四逆湯成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)成分與靶點連接情況篩選出當(dāng)歸四逆湯作用于MM的關(guān)鍵成分。

1.3 ?當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制MM血管新生的機(jī)制研究

1.3.1 ?當(dāng)歸四逆湯-外泌體靶點基因網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 ?將當(dāng)歸四逆湯抑制MM血管新生靶點基因與外泌體差異表達(dá)基因取交集，即獲得當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制MM血管新生的作用靶點。利用STRING平臺[14]與Cytoscape軟件，對交集靶點進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，并?gòu)建當(dāng)歸四逆湯-外泌體靶點基因網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.2 ?KEGG與GO分析 ?應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)平臺對當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制MM血管新生的相關(guān)靶點進(jìn)行富集分析，以P<0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，并借助R語言對富集結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.3.3 ?分子對接 ?篩選出當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制MM血管新生的主要有效成分與靶點，利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）獲得核心靶點蛋白晶體結(jié)構(gòu)的PDB格式文件，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得有效成分的Mol2格式文件，利用AutoDock Tools對核心靶點和有效成分進(jìn)行處理，獲得相應(yīng)的pdbqt格式文件，利用Vina進(jìn)行分子對接，并統(tǒng)計各模型的結(jié)合能，最后用PyMol對活性較高的對接模型進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 ?外泌體的鑒定

透射電鏡顯示直徑<100 nm的圓形外泌體（圖1A）。Western blot分析證實MM患者血清中非外體標(biāo)記Calnexin的低表達(dá)和特異性外體膜標(biāo)記CD63和TSG101（圖1B）的高水平。

2.2 ?外泌體測序結(jié)果

與健康志愿者相比，骨髓瘤患者外周血外泌體高通量測序共發(fā)現(xiàn)了20 309個差異表達(dá)的mRNA。為篩選表達(dá)差異顯著的外泌體mRNA，以FC值和P值（FC≥2.0和P<0.05）作為統(tǒng)計學(xué)顯著性標(biāo)準(zhǔn)，總共有6782個mRNA在MM患者和健康對照組中有顯著不同的表達(dá)，其中，5982個為上調(diào)mRNA，800個為下調(diào)mRNA。U266全轉(zhuǎn)錄組測序共獲得13 629個mRNA。

2.3 ?當(dāng)歸四逆湯有效成分及靶點

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，初步檢索到7味中藥化學(xué)成分共1069種，經(jīng)ADME篩選后，得到有效成分155種，刪除25種無作用靶點的成分，即130種有效成分（見表1）。將130個有效成分與中藥構(gòu)建復(fù)方-成分網(wǎng)絡(luò)（見圖2），并對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)“中介中心性”降序排列，前4位的有效成分分別是樺木酸、山柰酚、槲皮素、谷甾醇。

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選有效成分靶點信息，結(jié)合SwissTargetPrediction在線靶標(biāo)垂釣，并統(tǒng)一在UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點進(jìn)行規(guī)范。共收集到相關(guān)作用靶點共346個（已刪除重復(fù)值）。

2.4 ?MM血管新生靶點的獲取

從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得MM瘤血管新生靶點1770個。設(shè)定Score大于中位數(shù)的靶點為MM血管新生的潛在靶點，連續(xù)進(jìn)行2次篩選后，結(jié)合OMIM數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充相關(guān)靶點，合并后刪除重復(fù)值，得到MM相關(guān)靶點885個。

2.5 ?當(dāng)歸四逆湯成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選的當(dāng)歸四逆湯活性成分靶點與MM血管新生靶點通過R語言取交集，并將交集靶點通過STRING平臺與Cytoscape軟件構(gòu)建靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，最終獲得143個交集靶點（見表3）。根據(jù)交集靶點反向篩選當(dāng)歸四逆湯有效成分，得到作用于MM血管新生的相關(guān)活性成分117個，通過Cytoscape軟件的Network Analyzer功能構(gòu)建當(dāng)歸四逆湯成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)“度中心性”排序發(fā)現(xiàn)，前5位化合物為槲皮素、山柰酚、β-胡蘿卜素、甘草查爾酮A、柚皮素（見表2），推測可能為當(dāng)歸四逆湯抑制MM血管新生的關(guān)鍵成分。

2.6 ?當(dāng)歸四逆湯-外泌體靶點基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將人外周血外泌體差異上調(diào)基因與U266測序基因取交集，獲得3862個骨髓瘤細(xì)胞來源的差異基因（見圖3A），將其與當(dāng)歸四逆湯作用靶點匹配，獲得當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制MM血管新生的可能作用靶點39個（見表3，圖3B）。借助STRING平臺與Cytoscape軟件制作當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖3C）。

2.7 ?KEGG與GO分析

應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)平臺對當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制MM血管新生相關(guān)的39個靶點進(jìn)行富集分析，以P<0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得GO生物學(xué)過程條目587條、KEGG通路27條，運(yùn)用R語言對富集顯著的相關(guān)通路進(jìn)行可視化處理（圖4）。

GO生物學(xué)過程分析結(jié)果顯示，相關(guān)靶點基因富集在血管發(fā)育（blood vessel development）、血管形態(tài)發(fā)育（blood vessel morphogenesis）、激酶活性的調(diào)控（regulation of kinase activity）、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)（regulation of cell cycle）等生物學(xué)過程。

KEGG通路包括PI3K-AKT信號通路、p53信號通路、VEGF信號通路、NF-kappa B信號、MAPK信號通路、AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路等。選取P值在前10位的通路建立靶點-通路網(wǎng)絡(luò)（見圖3D）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多個靶點顯著富集在PI3K-AKT信號通路，同時多條信號通路與血管新生有關(guān)，如VEGF信號通路、HIF-1信號通路等。這提示當(dāng)歸四逆湯可以通過多條通路干預(yù)外泌體從而抑制MM血管新生。

2.8 ?分子對接

通過KEGG分析并進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸四逆湯抑制MM血管新生中的多條通路均有PI3K-AKT信號通路的參與，而AKT1是該通路上的關(guān)鍵靶點，而AKT1同時為當(dāng)歸四逆湯發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點，因此，選取2種主要有效成分（槲皮素、山柰酚）與AKT1結(jié)合模式進(jìn)行展示（見圖5）。由圖5可見槲皮素和山柰酚與JUN、MAPK1、AKT1靶點蛋白均形成氫鍵，表明具有良好的結(jié)合性。

3 討論

腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體對血管新生具有重要影響，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體能夠通過Hh-GLI信號通路促進(jìn)VEGF的表達(dá)[15]，也可通過分泌EGFR誘導(dǎo)血管新生[16]。本研究團(tuán)隊通過對U266細(xì)胞外泌體進(jìn)行測序，并將高表達(dá)基因與當(dāng)歸四逆湯抑制MM血管新生的靶點進(jìn)行匹配，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，U266細(xì)胞外泌體差異表達(dá)的mRNA中存在VEGF等血管新生相關(guān)的mRNA高表達(dá)。KEGG通路富集分析顯示，主要富集于PI3K-AKT、AGE-RAGE、VEGF、HIF-1等信號通路，揭示了當(dāng)歸四逆湯干預(yù)U266外泌體抑制血管新生的主要機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，樺木酸、山柰酚、槲皮素、谷甾醇可能是本方發(fā)揮作用的重要成分。樺木酸可抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制HIF-1α和STAT3與VEGF基因啟動子的結(jié)合來減少新生血管形成[17];山柰酚能夠通過調(diào)節(jié)VEGF/VEGF-2及其下游信號級聯(lián)，從而起到抑制血管新生的作用[18];槲皮素為黃酮類化合物，有研究表明槲皮素能夠下調(diào)VEGF-A的表達(dá)，能夠很好的抑制血管新生[19-20]。以上3種成分在當(dāng)歸四逆湯成分中“中介中心性”排序為前3位，提示樺木酸、山柰酚、槲皮素可能是當(dāng)歸四逆湯發(fā)揮抗血管新生的重要成分，而通過分子對接技術(shù)，驗證了槲皮素、山柰酚與相關(guān)靶點具有良好的結(jié)合性。從而推測當(dāng)歸四逆湯主要通過以下機(jī)制干預(yù)外泌體抑制骨髓瘤血管新生：（1）槲皮素通過抑制VEGF的表達(dá)水平抑制腫瘤血管新生[21];（2）槲皮素可以抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性從而抑制腫瘤血管新生[22];（3）槲皮素與山柰酚一同抑制AKT的表達(dá)[22]，從而抑制MM血管新生。

通路富集結(jié)果顯示，當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制血管新生相關(guān)的通路主要集中在以下幾條：（1）PI3K/AKT信號通路：PI3K為兩個亞基構(gòu)成的異二聚體，包括催化亞基和調(diào)節(jié)亞基[23]，其活化后能夠?qū)?，4-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）轉(zhuǎn)化為3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）[24]。AKT是PI3K的下游信號分子，能夠與PIP3相結(jié)合，從而激活Ser473位點，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡。VEGF啟動子包含多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如SP1/SP3的結(jié)合位點[25]，在受到刺激時，PI3K的調(diào)節(jié)亞基會磷酸化，AKT上Ser473也磷酸化，從而使PI3K/AKT激活，SP1上的Thr453與Thr739被磷酸化，啟動VEGF的轉(zhuǎn)錄[26]。AKT活化可啟動下游信號分子mTOR，mTOR能夠促進(jìn)VEGF的上調(diào)，促進(jìn)血管新生[27]。此外，mTOR還可調(diào)節(jié)STAT3的活化，而STAT3在腫瘤缺氧環(huán)境下，能夠和HIF-1α與VEGF啟動子結(jié)合，從而促進(jìn)血管新生[28];同時能夠促進(jìn)其下游目標(biāo)如BFGF、HGF的表達(dá)，從而導(dǎo)致新生血管形成。（2）VEGF相關(guān)通路：VEGF是血管新生過程中最重要的調(diào)節(jié)因子之一[29]，其介導(dǎo)的各信號級聯(lián)幾乎參與血管新生的各個過程[30]。VEGF的表達(dá)水平與骨髓瘤血管新生關(guān)系密切，已經(jīng)有學(xué)者將其作為其評價療效及危險度指標(biāo)之一[31]。（3）HIF-1α相關(guān)通路：HIF-1α為缺氧情況下誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異結(jié)合蛋白，其與HIF-1β構(gòu)成活性HIF-1異二聚體，參與缺氧反應(yīng)基因調(diào)節(jié)，從而使細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境，促進(jìn)血管新生，有研究顯示[32-33]，HIF-1α可能通過上調(diào)Ang-2表達(dá)，進(jìn)一步上調(diào)多種促血管生成因子的表達(dá)從而導(dǎo)致腫瘤血管新生。而且在HIF-1α調(diào)節(jié)其下游基因VEGF的過程中，PI3K/AKT通路也會起重要調(diào)節(jié)作用[34]。因此，HIF-1α在腫瘤血管新生中具有重要的意義。

綜上所述，本研究通過對U266及外周血清外泌體進(jìn)行高通量測序并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，系統(tǒng)分析了當(dāng)歸四逆湯干預(yù)外泌體抑制MM血管新生的作用機(jī)制，并通過分子對接技術(shù)驗證了有效成分與核心靶點之間具有良好的結(jié)合活性，從而證實了本研究團(tuán)隊的假說：溫陽化瘀中藥可以通過干預(yù)腫瘤細(xì)胞分泌外泌體介導(dǎo)血管新生抑制腫瘤發(fā)展，腫瘤所處寒凝血瘀狀態(tài)與血管新生存在一定的聯(lián)系。當(dāng)歸四逆湯抑制MM血管新生具有多靶點、多通路的特點，為當(dāng)歸四逆湯的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 周華妙，郭 ?勇.寒凝血瘀對結(jié)腸癌肺轉(zhuǎn)移模型小鼠肺組織VEGF、MMP-2表達(dá)的影響[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，22（6）：429-432.

[2] 周 ?輝，沈偉鋒，邵平揚(yáng).缺氧外泌體傳遞miR-199a-5p對胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移和侵襲的影響[J].醫(yī)學(xué)信息，2021，34（1）：78-82，86.

[3] 熊文杰，劉煥勛，史敦云，等.骨髓瘤細(xì)胞來源外泌體對NK細(xì)胞表面活化受體的影響[J].中國實驗血液學(xué)雜志，2017，25（6）：1713-1717.

[4] 師 ?亮，陳 ?浩，崔慧林，等.青蒿琥酯對人骨髓瘤細(xì)胞抗血管生成的作用[J].解剖學(xué)雜志，2018，41（2）：152-155.

[5] 伏 ?杰，王松坡，李 ?琦，等.活血化瘀中藥抗腫瘤血管新生的實驗研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2020，38（4）：153-157.

[6] 楊學(xué)文，馬利敏，趙小強(qiáng)，等.雷利度胺聯(lián)合化療治療急性白血病的臨床效果及對血管生成因子的影響[J].中國實驗血液學(xué)雜志，2016，24（3）：702-706.

[7] 王含必，鄧成艷.外泌體的生物功能及臨床治療應(yīng)用潛能[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2021，30（7）：966-970.

[8] RAIMONDO S， SAIEVA L， VICARIO E， et al. Multiple myeloma-

derived exosomes are enriched of amphiregulin （AREG） and activate the epidermal growth factor pathway in the bone microenvironment leading to osteoclastogenesis[J]. Journal of Hematology & Oncology， 2019， 12（1）： 2.

[9] UMEZU T， TADOKORO H， AZUMA K， et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1[J]. Blood， 2014， 124（25）： 3748-3757.

[10] 張彥瓊，李 ?梢.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)藥現(xiàn)代研究的若干進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2015，29（6）：883-892.

[11] RU J L， LI P， WANG J N， et al. TCMSP： a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J]. Journal of Cheminformatics， 2014， 6： 13.

[12] GFELLER D， MICHIELIN O， ZOETE V. Shaping the interaction landscape of bioactive molecules[J]. Bioinformatics， 2013， 29（23）： 3073-3079.

[13] SHANNON P， MARKIEL A， OZIER O， et al. Cytoscape： a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks[J]. Genome Research， 2003， 13（11）： 2498-2504.

[14] SZKLARCZYK D， MORRIS J H， COOK H， et al. The STRING database in 2017： Quality-controlled protein–protein association networks， made broadly accessible[J]. Nucleic Acids Research， 2017， 45（D1）： D362-D368.

[15] BHAT A， YADAV J， THAKUR K， et al. Exosomes from cervical cancer cells facilitate pro-angiogenic endothelial reconditioning through transfer of Hedgehog-GLI signaling components[J]. Cancer Cell International， 2021， 21（1）： 319.

[16] 劉軒宇，陳 ?磊.外泌體在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中機(jī)制的研究進(jìn)展[J].外科理論與實踐，2021，26（1）：76-78.

[17] 高 ?倩，吳 ?佩，何 ?疆，等.青蒿素和樺木酸阻斷脂多糖誘導(dǎo)小鼠血管新生及組織增殖[J].中國藥學(xué)雜志，2015，50（4）： 330-338.

[18] CHIN H K， HORNG C T， LIU Y S， et al. Kaempferol inhibits angiogenic ability by targeting VEGF receptor-2 and downregulating the PI3K/AKT， MEK and ERK pathways in VEGF-stimulated human umbilical vein endothelial cells[J]. Oncology Reports， 2018， 39（5）： 2351-2357.

[19] 李彩麗，廖應(yīng)英，成 ?丹，等.槲皮素對食管癌Eca109細(xì)胞遷移侵襲及血管生成的影響[J].國際消化病雜志，2017，37（2）：104-108.

[20] TANG S M， DENG X T， ZHOU J， et al. Pharmacological basis and new insights of quercetin action in respect to its anti-cancer effects[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2020， 121： 109604.

[21] HAO Y L， ZHANG C P， SUN Y Y， et al. Licochalcone A inhibits cell proliferation， migration， and invasion through regulating the PI3K/AKT signaling pathway in oral squamous cell carcinoma[J]. OncoTargets and Therapy， 2019， 12： 4427-4435.

[22] 史新萌，劉玉萍，瞿 ?鼎，等.抑制HIF-1α表達(dá)的中藥抗腫瘤活性成分研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報，2021，56（10）：2689-2719.

[23] 耿軍輝，張麗軍，王亞麗，等.PI3K/Akt信號通路與腫瘤血管新生的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2018，26（9）：1462-1466.

[24] 劉澤宇，萬宇翔，黃金昶.當(dāng)歸四逆湯治療肝細(xì)胞癌作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2020，26（6）：185-192.

[25] S？覫LVSTEN C A E， PAOLI F， CHRISTENSEN J H， et al. Voluntary physical exercise induces expression and epigenetic remodeling of VEGF A in the rat Hippocampus[J]. Molecular Neurobiology， 2018， 55（1）： 567-582.

[26] SHARMA S， GURU S K， MANDA S， et al. A marine sponge alkaloid derivative 4-chloro fascaplysin inhibits tumor growth and VEGF mediated angiogenesis by disrupting PI3K/Akt/mTOR signaling cascade[J]. Chemico-Biological Interactions， 2017， 275： 47-60.

[27] XU T W， LV Z， CHEN Q H， et al. Vascular endothelial growth factor over-expressed mesenchymal stem cells-conditioned media ameliorate palmitate-induced diabetic endothelial dysfunction through PI-3K/AKT/m-TOR/eNOS and p38/MAPK signaling pathway[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2018， 106： 491-498.

[28] LEE H， JEONG A J， YE S K. Highlighted STAT3 as a potential drug target for cancer therapy[J]. BMB Reports， 2019， 52（7）： 415-423.

[29] 鄭 ?碩，黃奕紅.肝癌組織中血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子-Ⅱ的表達(dá)情況及影響因素分析[J].吉林醫(yī)學(xué)，2021，42（5）：1064-1067.

[30] 向本旭，劉婷婷，孫芳玲，等.VEGF相關(guān)信號通路在血管新生中的研究進(jìn)展[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2015，25（12）：81-86.

[31] PALTA A， KAUR M， TAHLAN A， et al. Evaluation of angiogenesis in multiple myeloma by VEGF immunoexpression and microvessel density[J]. Journal of Laboratory Physicians， 2020， 12（1）： 38-43.

[32] 王寶財，金壽德，張 ?新.缺氧誘導(dǎo)因子-1α對非小細(xì)胞肺癌血管生成及其對預(yù)后的影響[J].臨床肺科雜志，2021，26（5）：747-751.

[33] BAHRAMI A， ATKIN S L， MAJEED M， et al. Effects of curcumin on hypoxia-inducible factor as a new therapeutic target[J]. Pharmacological Research， 2018， 137： 159-169.

[34] WANG D F， ZHAO W， LIU J R， et al. Effects of HIF-1α on spermatogenesis of varicocele rats by regulating VEGF/PI3K/Akt signaling pathway[J]. Reproductive Sciences， 2021， 28（4）： 1161-1174.