2-苯基噻唑衍生物的合成、表征及其抗腫瘤活性*

錢晶晶，武文龍，吉 敬,b，徐譽芯，鄒靖培，劉珊鳴，董常娥,史大華,c

(江蘇海洋大學 a.藥學院；b.江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室；c.江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室，江蘇 連云港 222005)

癌癥細胞具有無限增殖、向正常組織或器官浸潤擴散等特性，這使治愈癌癥變得極為困難[1]。2020年，全球約有1 929萬新癌癥病例(不包括非黑色素瘤皮膚癌)和近1 000萬癌癥死亡病例(不包括非黑色素瘤皮膚癌)，癌癥已成為世界公共問題之一，嚴重影響著人們的健康，其防治已經(jīng)成為全球衛(wèi)生戰(zhàn)略的核心內(nèi)容[2]。目前乳腺癌造成的死亡人數(shù)僅次于肺癌，是女性罹患的最常見癌癥[3]。乳腺癌最常用的療法包括化學療法、免疫療法、激素治療、外科手術和放射療法。其中，化學療法在乳腺癌治療中具有較好療效，但會出現(xiàn)嚴重的耐藥問題[4]。因此，開發(fā)新型的抗乳腺癌化學治療藥物非常重要。

噻唑衍生物是一類非常重要的雜環(huán)化合物，具有廣泛的生物學活性。很多重要的化合物中都含有噻唑環(huán)結(jié)構(gòu)。噻唑衍生物常常被用來合成高效低毒且具有較好藥物代謝特征的化合物[5]。噻唑環(huán)是一些抗腫瘤藥物如達沙替尼、達拉非尼和伊沙匹隆等的基本組成部分[6]。近年來一些新型高效低毒的抗腫瘤噻唑衍生物被合成出來[7-9]。在前期的研究中，多個具有抗腫瘤活性的2-苯基噻唑衍生物被設計合成出來，這些化合物對乳腺癌細胞具有很好的細胞毒活性[10-11]。2-苯基噻唑相關的衍生物2-噻唑甲酰胺類化合物對Akt有明顯的抑制作用，可抑制其下游MDM2和GSK3β蛋白的磷酸化[6]。Mahapatra等[12]設計通過改變噻唑取代基合成墨蘭素-希夫堿衍生物，并研究發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤活性是通過EGFR抑制機制產(chǎn)生的細胞毒性結(jié)果。Salem等[13]合成了一系列新的1，3-噻唑類化合物，這類化合物表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性，研究發(fā)現(xiàn)化合物2-[5-(4-氯苯基)-1，3-噻唑-2-基)]-1-乙酰肼抗腫瘤活性的機理是其對血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)具有明顯的抑制活性，能誘導細胞停滯在G1階段，誘導線粒體去極化。Sabry等[14]合成一系列新的咪唑并噻唑類衍生物，其中化合物N′-乙酰基-5-(4-溴苯基)咪唑并[2,1-b]噻唑-3-甲酰肼和5-(4-甲氧基苯基)-6-(嗎啉甲基)咪唑并[2,1-b]噻唑-3-甲酰肼具有雙重 EGFR/HER2 激酶抑制作用，誘導細胞在G1/S期和G1期停滯，建模研究結(jié)果表明噻唑部分具有抗腫瘤活性。

近期有文獻報道雙噻唑衍生物可以誘導腫瘤細胞的凋亡[15]。在本課題組前期研究工作的基礎上，本文在常溫條件下通過酰胺連接2個2-苯基-1，3-噻唑基團合成了4個新型的雙2-苯基噻唑衍生物，并利用MTT法檢測了目標化合物對MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖的抑制活性，為乳腺癌化學治療藥物的開發(fā)提供新的研究思路。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高分辨質(zhì)譜儀(UPLC G2-XS，Waters公司)；紅外光譜儀(Tensor 27，Bruker公司)；核磁共振波譜儀(Avance 500 MHz，Bruker公司)；熔點儀(SWG X-4B，上海申光儀器儀表有限公司)；熒光顯微鏡(XD-20,南京瑞元光學儀器有限公司)；多功能酶標儀(Synergy Neo2,BioTek公司)；離心機(SCILOGEX S1010E,上海青牧生物科技有限公司)；微型渦旋混合儀(Mixer 4K,生工生物工程股份有限公司)。

4-羥基硫代苯甲酰胺(純度98%，阿拉丁試劑)，3-溴丙酮酸乙酯(純度80%，阿拉丁試劑)，4-三氟甲基硫代苯甲酰胺(純度98%，阿拉丁試劑)，4-氯硫代苯甲酰胺(純度98%，麥克林試劑)，4-(氨甲基)哌啶(純度98%，麥克林試劑)，無水哌嗪(純度99%，阿拉丁試劑)，氯化亞砜(純度99%，麥克林試劑)。其余試劑均為分析純，購自國藥集團試劑有限公司。癌細胞株：MDA-MB-231乳腺癌細胞(實驗室保存)。DMEM 細胞培養(yǎng)液(Gibco公司)；胎牛血清(FBS-PN500，上海煊翎生物科技有限公司)；胰蛋白酶(Gibco公司)；MTT試劑(碧云天生物技術有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 目標化合物的合成路線 目標化合物的合成路線如圖1所示。

圖1 目標化合物的合成路線

1.2.2 目標化合物的合成方法

(1)5-(4-氯苯基)噻唑-2-羧酸乙酯(2a)的合成。4-氯硫代苯甲酰胺5 g(29.1 mmol)溶解在30 mL無水乙醇中，然后加入3-溴丙酮酸乙酯6.82 g(35.0 mmol)，在80 ℃下反應6 h。反應結(jié)束后加入80 mL冰水，過濾，得到6.25 g淺黃色固體2-(4-氯苯基)噻唑-4-甲酸乙酯,產(chǎn)率約為80%。

(2)5-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-羧酸乙酯(2b)的合成。4-三氟甲基硫代苯甲酰胺5 g(24.4 mmol)溶解在30 mL無水乙醇中，然后加入3-溴丙酮酸乙酯5.70 g(29.2 mmol)，80 ℃下反應6 h。反應結(jié)束后加入80 mL冰水，過濾，得到5.58 g黃色固體2-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-4-甲酸乙酯,產(chǎn)率約為76%。

(3)5-(4-氯苯基)噻唑-2-碳酰氯(3a)的合成。將1.0 g(3.74 mmol)5-(4-氯苯基)噻唑-2-羧酸乙酯溶解于40 mL乙醇中，然后加入0.25 g(4.48 mmol)KOH，混合物在50 ℃下反應2 h。反應結(jié)束后，蒸干溶劑，用乙酸乙酯和蒸餾水進行萃取，保留水相，用質(zhì)量分數(shù)10%的稀HCl調(diào)節(jié)水相pH至5～6，析出固體抽濾，得到中間產(chǎn)物2-(4-氯苯基)噻唑-4-甲酸。將得到的底物2-(4-氯苯基)噻唑-4-甲酸溶解到15 mL二氯甲烷中，加入1 mL(過量5倍)氯化亞砜，反應液于50 ℃回流反應6 h。反應結(jié)束后，反應體系蒸干得到白色固體2-(4-氯苯基)噻唑-2-碳酰氯0.8 g,產(chǎn)率約為80%。

(4)5-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-碳酰氯(3b)的合成。將1.0 g(3.32 mmol)5-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-羧酸乙酯溶解于40 mL乙醇中，然后加入0.22 g(3.98 mmol)KOH，混合物在50 ℃下反應2 h。反應結(jié)束后，蒸干溶劑，用乙酸乙酯和蒸餾水進行萃取，保留水相，用質(zhì)量分數(shù)10%的稀HCl調(diào)節(jié)水相pH至5～6，析出固體抽濾，得到中間產(chǎn)物5-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-羧酸。將得到的底物5-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-羧酸溶解到15 mL二氯甲烷中，加入1 mL(過量5倍)氯化亞砜[13]，反應液于50 ℃回流反應6 h。反應結(jié)束后，反應體系蒸干得到黃色固體5-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-碳酰氯0.76 g,產(chǎn)率約為78%。

(5)哌嗪-1,4-二基雙((5-(4-氯苯基)噻唑-2-基)甲酮)(6a)的合成。將上述得到的3a溶于二氯甲烷溶液中，惰性氣體保護，按體積比例取0.155 4 g(0.602 mmol)。將0.062 2 g(0.723 mmol)無水哌嗪溶解于10 mL二氯甲烷中，加入3a溶液，室溫反應30 min結(jié)束。將反應體系旋干，柱層析后得到白色固體0.221 3 g,產(chǎn)率為93.52%。熔點為295.1～295.2 ℃；IR(KBr)，σ(cm-1)：3 441,2 923,1 590,1 438,1 365,1 070;1H NMR(CDCl3,500 MHz)，δ：8.04(s,2H),7.97～7.82(m,4H),7.47(dd,J=3.3,1.6 Hz,4H),4.24～4.11(m,4H),3.98(s,4H);13C NMR(CDCl3,126 MHz)，δ：182.9,166.2,162.6,136.7,131.5,129.4,127.8,125.4,29.7;ESI-MS：m/z[M+H]+Calcd for C24H19Cl2N4O2S2+,理論值：529.032 1,實測值：529.032 4。

(6)哌嗪-1,4-二基雙((5-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-基)甲酮)(6b)的合成。將上述得到的3b溶于二氯甲烷溶液中，惰性氣體保護，按體積比例取0.122 5 g(0.475 mmol)。將0.049 0 g(0.570 mmol)無水哌嗪溶解于10 mL的二氯甲烷中，加入3b溶液，室溫反應30 min結(jié)束。將反應體系旋干，柱層析后得到白色固體0.239 5 g,產(chǎn)率為95.62%。熔點為233.3～233.6 ℃；IR(KBr)，σ(cm-1)：3 435,2 935,1 597,1 437,1 069;1H-NMR(CDCl3,500 MHz)，δ：8.11(s,2H),8.08(s,4H),7.74(s,4H),4.19(d,J=18.3 Hz,4H),3.99(s,4H)；13C-NMR(CDCl3,126 MHz)，δ：162.4,151.4,136.0,132.4,132.0,126.8,126.2,126.1,126.0,53.4;ESI-MS:m/z[M+H]+Calcd for C26H19F6N4O2S2+,理論值：597.084 8,實測值：597.085 2。

(7)5-(4-氯苯基)-N-((1-(5-(4-氯苯基)噻唑-2-羰基)哌啶-4-基)甲基)噻唑-2-甲酰胺(7a)的合成。將上述得到的3a溶于二氯甲烷溶液中，按體積比例取0.115 8 g(0.449 mmol)。將0.061 5 g(0.538 mmol)4-氨甲基哌啶溶解于10 mL的二氯甲烷中，加入3a溶液，室溫反應30 min結(jié)束。將反應體系旋干柱層析，得到白色固體0.228 7 g,則其產(chǎn)率為91.40%。熔點為295.1～295.2 ℃；IR(KBr)，σ(cm-1)：3 441,2 923,1 590,1 438,1 365,1 070;1H NMR(CDCl3,500 MHz)，δ：8.04(s,2H),7.97～7.82(m,4H),7.47(dd,J=3.3,1.6 Hz,4H),4.24～4.11(m,4H),3.98(s,4H);13C NMR(CDCl3,126 MHz)，δ：182.9,166.2,162.6,136.7,131.5,129.4,127.8,125.4,29.7;ESI-MS:m/z[M+H]+Calcd for C24H19Cl2N4O2S2+,理論值：529.032 1,實測值：529.032 4。

(8)5-(4-(三氟甲基)苯基)-N-((1-(5-(4-(三氟甲基)苯基)噻唑-2-羰基)哌啶-4-基)甲基)噻唑-2-甲酰胺(7b)的合成。將上述得到的3b溶于二氯甲烷溶液中，按體積比例取0.113 7 g(0.390 mmol)。將0.053 4 g(0.468 mmol)4-氨甲基哌啶溶解于10 mL的二氯甲烷中，加入3b溶液，室溫反應30 min結(jié)束。將反應體系旋干柱層析，得到白色固體0.225 1 g,則其產(chǎn)率為92.48%。熔點為127.8～128.2 ℃；IR(KBr)，σ(cm-1)：3 431,2 929,1 597,1 439,1 068;1H NMR(CDCl3,500 MHz)，δ：8.20(s,1H),8.15～8.05(m,4H),7.96(s,1H),7.74(t,J=7.4 Hz,4H),7.60(t,J=5.6 Hz,1H),4.80(d,J=11.8 Hz,1H),4.64(d,J=12.5 Hz,1H),3.49(d,J=26.0 Hz,2H),3.20(t,J=12.4 Hz,1H),2.88(t,J=11.8 Hz,1H),2.13～2.02(m,1H),1.95(dd,J=36.5,11.9 Hz,2H),1.71(s,1H),1.28(s,1H);13C NMR(CDCl3,126 MHz)，δ：166.4,165.3,162.5,161.1,152.1,151.2,136.2,135.8,132.5,132.2,131.9,126.9,126.8,126.1,126.0,124.7,124.0,44.6,36.8;ESI-MS:m/z[M+H]+Calcd for C28H23F6N4O2S2+,理論值：625.116 1，實測值：625.116 3。

1.3 抗腫瘤活性

用MTT細胞活力法測定化合物對MDA-MB-231細胞的細胞毒性。選取對數(shù)生長期的腫瘤細胞，經(jīng)胰酶消化后，用含有體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成細胞懸液(1×105個/mL)，接種至96孔培養(yǎng)板(每孔100 μL)后放入細胞培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。將原培養(yǎng)基更換為含有特定濃度化合物的培養(yǎng)基(化合物終濃度梯度為200 μmol/L,100 μmol/L，50 μmol/L，25 μmol/L，12.5 μmol/L，6.25 μmol/L)，空白對照孔加入含等體積溶媒的培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h(每個藥物濃度設置3個復孔)，之后用移液器吸棄培養(yǎng)基，每孔加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄MTT溶液后，每孔加入100 μL DMSO進行顯色。將96孔板放在搖床上低速振蕩10 min，使用酶標儀在490 nm下檢測各孔的光吸收值，記錄數(shù)據(jù)并計算化合物半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

化合物抗癌活性以及對乳腺癌細胞的IC50值設置3個平行實驗，數(shù)據(jù)值為3個平行樣品的平均值，用誤差線表示標準偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 終產(chǎn)物合成條件的選擇

在化合物3a和3b與哌嗪和4-氨甲基哌啶反應生成終產(chǎn)物6a，6b和7a，7b的過程中，化合物3a和3b與哌嗪和4-氨甲基哌啶的比例影響雙取代化合物的產(chǎn)率。隨著哌嗪和4-氨甲基哌啶的比例的提高，雙2-苯基噻唑衍生物的收率會降低。以化合物6a的合成為例(見表1)，當化合物4與化合物3a的投料比(物質(zhì)的量之比)為1.2∶1時，終產(chǎn)物的產(chǎn)率達到98%。隨著哌嗪比例的提高，化合物6a的產(chǎn)率會逐漸降低。當化合物4與3a的投料比達到30.0∶1時，化合物6a的產(chǎn)率僅有45%。這時會產(chǎn)生大量的一取代的2-苯基噻唑衍生物。

表1 投料比對終產(chǎn)物產(chǎn)率的影響

2.2 抗腫瘤活性

測試所得數(shù)據(jù)使用Excel軟件進行分析處理，以時間為橫軸，吸光值OD為縱軸繪制生長曲線，計算細胞存活率及抑制率。

細胞存活率=(As-Ab)/(Ac-Ab)×100%；

抑制率=(Ac-As)/(Ac-Ab)×100%。

式中：As為實驗組OD值，Ab為空白組OD值，Ac為陰性對照組OD值。

化合物抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞的效果如圖2所示。合成的4個化合物在100 μmol/L濃度下對MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖均具有抑制作用。其中化合物6b和化合物7b的抑制活性較好，對MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖的抑制率分別為57%和68%。這兩個化合物對MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖具有劑量依賴關系，隨著化合物濃度的增加，兩個化合物對MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖的抑制作用增加(見圖3)?；衔?b和7b抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖的IC50分別為(81.71±2.43)μmol/L和(24.63±3.57)μmol/L?；衔?b的活性略高于陽性對照阿西貝利(IC50=(45.5±0.09)μmol/L)，說明該化合物具有較好的乳腺癌細胞抑制活性。Radwan等[15]報道的雙噻唑衍生物中對乳腺癌細胞MCF7具有最好抑制活性的化合物1,3-雙(2-(2-(4-(苯并[d]噻唑-2-基)噻唑-2-基)肼)甲基)苯氧基)丙烷的IC50值為7.31 μmol/L，低于其陽性對照阿霉素(IC50=5.23 μmol/L)。化合物7b的活性與文獻報道的雙噻唑衍生物1,3-雙(2-(2-(4-(苯并[d]噻唑-2-基)噻唑-2-基)肼)甲基)苯氧基)丙烷相當。從構(gòu)效關系分析，目標化合物中R取代基對化合物的抗腫瘤活性具有一定的影響，當取代基為三氟甲基時，化合物6b和7b具有較好的抗腫瘤活性。

圖2 化合物在100 μmol/L 濃度下的抗癌活性初篩結(jié)果

a 化合物6b

噻唑類化合物具有廣泛的抗腫瘤活性。文獻報道，該類化合物可以與多種抗腫瘤靶點相互作用[16]。一些噻唑衍生物通過抑制EGFR激酶、芳香化酶、單酰甘油脂肪酶、RSK2等靶標相互作用，起到抗乳腺癌的作用[6]。Radwan等[15]報道的雙噻唑衍生物具有磷脂酰肌醇-3-激酶抑制活性?？紤]到本文合成的化合物與文獻報道的雙噻唑衍生物具有一定的結(jié)構(gòu)相似性，因此，預測本文合成的化合物可能也具有一定的磷脂酰肌醇-3-激酶抑制活性。下一步研究將以化合物7b為先導化合物，對化合物的結(jié)構(gòu)進一步優(yōu)化，對化合物的藥理學活性進行深入評價。

3 結(jié)論

以對位取代的硫代苯甲酰胺為原料，依次通過環(huán)合、水解、?；?、取代反應合成了4個新型的雙2-苯基噻唑衍生物。所有化合物都經(jīng)過1H NMR,13C NMR,IR,ESI-MS表征，并研究了這些化合物對MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖的抑制活性。所有雙2-苯基噻唑衍生物在100 μmol/L濃度下對MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖都具有抑制作用。雙2-苯基噻唑的生物學活性與其R取代基的結(jié)構(gòu)有關，當R取代基位為三氟甲基時，化合物抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖的活性較好?；衔?b抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖的活性優(yōu)于陽性對照阿貝西利，可以作為乳腺癌治療藥物開發(fā)的先導化合物。未來將對化合物7b的結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，以期得到高效低毒的抗乳腺癌化合物。