虎杖苷通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路對(duì)阿霉素腎病模型大鼠腎臟及心臟的保護(hù)作用

薛 蕾 任文平 吳曉華

(包頭市第四醫(yī)院腎內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭市 014030)

腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)是臨床上常見的腎小球疾病，在各個(gè)年齡段均有發(fā)生，其典型癥狀表現(xiàn)為“三多一少”，即大量蛋白尿、高脂血癥、高度水腫、低蛋白血癥，以發(fā)病率高、病情易反復(fù)、預(yù)后較差為主要特征，且易發(fā)生血栓、急性腎衰竭、心血管疾病等并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者的生命安全[1]。目前，臨床上通常采用糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒性藥物或免疫抑制劑治療NS，以達(dá)到抑制炎癥滲出、減少蛋白尿的目的，但效果并不理想，且易增加對(duì)激素的耐藥性、出現(xiàn)較嚴(yán)重副作用[2]，不適合長(zhǎng)期使用?；⒄溶帐侵兴幓⒄鹊闹饕行С煞种?，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗血小板聚集、改善微循環(huán)等生物學(xué)作用[3]。有研究表明，虎杖苷對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷大鼠具有較好的治療作用[4]。然而，目前有關(guān)虎杖苷用于治療NS的報(bào)告較少，且缺乏相應(yīng)的機(jī)制研究。本研究通過建立阿霉素腎病大鼠模型，觀察虎杖苷對(duì)阿霉素腎病模型大鼠腎臟及心臟的保護(hù)作用，并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只無特定病原體級(jí)SD雄性大鼠，6周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心[生產(chǎn)許可為SCXK(京)2018-0010]。在恒溫恒濕環(huán)境內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)，環(huán)境溫度為20 ℃～25 ℃、濕度為50%～70%，普通飼料喂養(yǎng)，大鼠自由進(jìn)食、飲水。

1.2 藥物、主要試劑、儀器 虎杖苷(純度為98%，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：27208-80-6)，注射用鹽酸多柔比星(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H33021981，規(guī)格：50 mg)，蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)/真核細(xì)胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)/CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)通路激活劑CCT020312(上海陶術(shù)生物科技有限公司，批號(hào)：324759-76-4)，雙縮脲蛋白定量試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：PC0040)，RIPA裂解液(上海亞培生物科技有限公司，批號(hào)：P0013C)，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，批號(hào)：C503021-0500]，兔抗大鼠PERK一抗、兔抗大鼠磷酸化PERK(phosphorylated PERK，p-PERK)一抗、兔抗大鼠eIF2α一抗、兔抗大鼠磷酸化eIF2α(phosphorylated eIF2α，p-eIF2α)一抗、兔抗大鼠CHOP一抗、GAPDH抗體(Abcam公司，批號(hào)：ab229912、ab192591、ab169528、ab32157、ab11419、ab9485)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(北京博爾西科技有限公司，批號(hào)：BHR101)，ECL發(fā)光液(上海博耀生物科技有限公司，批號(hào)：RS0003)。VEVO3100小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)(VisualSonics公司)，BS-240全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，SZX10顯微鏡(OLYMPUS公司)，GelSMART凝膠分析儀[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司]。

1.3 構(gòu)建阿霉素腎病大鼠模型 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法選取30只大鼠，經(jīng)其尾靜脈注射0.2%注射用鹽酸多柔比星溶液6 mg/kg，給予其余10只大鼠尾靜脈注射同體積生理鹽水。然后在溫度20 ℃～25 ℃、濕度50%～70%的環(huán)境中飼養(yǎng)，大鼠自由進(jìn)食、飲水。7 d后收集大鼠24 h尿液，若24 h尿蛋白水平>20 mg，則視為建模成功[5]。本研究的30只大鼠全部建模成功。

1.4 分組及干預(yù) 參照文獻(xiàn)[6-7]的方法進(jìn)行分組與干預(yù)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將建模成功的30只大鼠分為模型組、虎杖苷組、聯(lián)合組，各10只；將同期注射生理鹽水的10只大鼠作為對(duì)照組。確認(rèn)造模成功后次日，給予聯(lián)合組大鼠灌胃虎杖苷溶液(將25 mg虎杖苷溶解于0.25 mL生理鹽水中，配制成濃度為100 mg/mL的溶液)100 mg/kg，2 h后腹腔注射CCT020312溶液[將50 mg的CCT020312溶解于0.25 mL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，配制成濃度為200 mg/mL的溶液]40 mg/kg；給予虎杖苷組大鼠灌胃虎杖苷溶液100 mg/kg，2 h后腹腔注射DMSO 0.2 mL/kg；給予對(duì)照組、模型組大鼠灌胃生理鹽水1 mL/kg，2 h后腹腔注射DMSO 0.2 mL/kg。均1次/d，共干預(yù)7周。干預(yù)期間的飼養(yǎng)環(huán)境為溫度20 ℃～25 ℃、濕度50%～70%，大鼠自由進(jìn)食、飲水。

1.5 心臟功能檢測(cè) 末次干預(yù)結(jié)束后4 h，采用心臟超聲檢測(cè)各組大鼠的心臟功能經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠后，將大鼠仰臥固定于工作臺(tái)上，剔除胸毛，將心臟超聲探頭置于左胸向右上方指向，設(shè)置采集深度為16 mm，獲取左室長(zhǎng)軸切面及乳頭肌短軸切面，探頭下移并順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)，獲取心尖四腔、五腔、二腔切面，測(cè)量左室等容舒張時(shí)間(isovolumetric relaxation time， IVRT)，同時(shí)記錄運(yùn)動(dòng)頻譜，測(cè)量二尖瓣舒張?jiān)缙诜逯邓俣?early peak diastolic velocity， E)與舒張晚期峰值速度(late peak diastolic velocity， A)，記錄3個(gè)位點(diǎn)取均值。測(cè)量5個(gè)心動(dòng)周期，取均值。

1.6 腎功能指標(biāo)檢測(cè) 超聲檢測(cè)結(jié)束后次日，收集大鼠24 h尿液置于離心管內(nèi)，2 000 r/min離心8 min(離心半徑10 cm)，取上清液，采用雙縮脲比色法檢測(cè)24 h尿蛋白水平。取尿標(biāo)本后，經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠，采集腹主動(dòng)脈血 3 mL，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血尿素氮、肌酐水平。

1.7 組織取材 抽取血液標(biāo)本后采用頸椎脫臼法處死大鼠，開腹后迅速摘取心臟、腎臟，切取部分心肌組織及腎臟組織，置于4%多聚甲醛固定，24 h后脫水、透明、浸蠟、包埋，制作4 μm厚度的連續(xù)病理切片，進(jìn)行HE染色。另取部分腎臟組織置于液氮中保存，用于Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.8 HE染色 取腎臟組織、心肌組織切片，常規(guī)脫蠟，乙醇梯度水化，蒸餾水漂洗，加入蘇木素浸泡5 min，蒸餾水漂洗，鹽酸酒精分化，蒸餾水漂洗，移入Scott藍(lán)化液返藍(lán)，伊紅液浸泡2 min，蒸餾水漂洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明兩次，封片劑封固，置于光鏡下觀察腎臟組織、心肌組織病理變化，并拍照記錄。

1.9 Western blot實(shí)驗(yàn) 取保存于液氮中的腎臟組織，研磨器充分研磨后采用PBS勻漿，移入離心管內(nèi)，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，冰上10 000 r/min離心12 min(離心半徑10 cm)，經(jīng)二喹啉甲酸法測(cè)定總蛋白并定量。取50 μg待測(cè)蛋白，混合4倍體積Loading Buffer緩沖液，加熱沸騰5 min使蛋白變性，冰上10 000 r/min離心12 min(離心半徑10 cm)，取上清液，80 V電壓下進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，TBST液漂洗3次，5 min/次，加入兔抗大鼠PERK一抗、兔抗大鼠p-PERK一抗、兔抗大鼠eIF2α一抗、兔抗大鼠p-eIF2α一抗、兔抗大鼠CHOP一抗(稀釋比均為1 ∶500)及GAPDH抗體(1 ∶2 000)，4 ℃搖床孵育過夜，TBST液漂洗3次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(稀釋比為1 ∶2 000)，常溫孵育2 h，ECL發(fā)光液浸泡30 s，移至暗盒顯影，以GAPDH為內(nèi)參，經(jīng)凝膠成像分析儀分析PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP蛋白的相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算p-PERK/PERK比值和p-eIF2α/eIF2α比值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腎臟組織的病理變化 對(duì)照組大鼠的腎小球細(xì)胞形態(tài)正常，組織結(jié)構(gòu)完整，未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠的腎小球肥大變形、增生現(xiàn)象嚴(yán)重、組織結(jié)構(gòu)被破壞，膜外基質(zhì)增多，血管塌陷，間質(zhì)存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管萎縮；虎杖苷組、聯(lián)合組大鼠的腎小球部分腫脹、增生現(xiàn)象緩解，膜外基質(zhì)積累較少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少，腎小管形態(tài)較正常，虎杖苷組大鼠的腎臟組織改善更加明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織的HE染色情況(×200)

2.2 各組大鼠心肌組織的病理變化 對(duì)照組大鼠的心肌細(xì)胞形態(tài)正常、排列緊致有序、組織結(jié)構(gòu)完整，心肌纖維緊密，未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠的心肌細(xì)胞腫脹變形、排列松散混亂、組織結(jié)構(gòu)被破壞，部分心肌纖維斷裂消失，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；虎杖苷組、聯(lián)合組大鼠的心肌細(xì)胞腫脹減輕、輪廓基本正常，少見有心肌纖維斷裂，局部可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，虎杖苷組大鼠的心肌組織改善更加明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織的HE染色情況(×200)

2.3 各組大鼠腎功能指標(biāo)的比較 與對(duì)照組比較，模型組的24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平均升高(均P<0.05)；模型組、聯(lián)合組、虎杖苷組的尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平依次降低(均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腎功能指標(biāo)的比較(x±s)

2.4 各組大鼠心臟功能指標(biāo)的比較 與對(duì)照組比較，模型組的IVRT延長(zhǎng)，二尖瓣E值降低，二尖瓣A值升高(P<0.05)；模型組、聯(lián)合組、虎杖苷組的IVRT、二尖瓣E值依次降低(均P<0.05)，二尖瓣A值依次升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心臟功能指標(biāo)的比較(x±s)

2.5 各組大鼠腎臟組織CHOP蛋白表達(dá)量、p-PERK/PERK比值、p-eIF2α/eIF2α比值的比較 與對(duì)照組比較，模型組的腎臟組織CHOP蛋白表達(dá)量、p-PERK/PERK比值、p-eIF2α/eIF2α比值均升高(均P<0.05)；模型組、聯(lián)合組、虎杖苷組的CHOP蛋白表達(dá)量、p-PERK/PERK比值、p-eIF2α/eIF2α比值依次降低(均P<0.05)。見表3、圖3。

表3 各組大鼠腎臟組織CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量、p-PERK/PERK比值、p-eIF2α/eIF2α比值的比較(x±s)

圖3 各組大鼠腎臟組織各蛋白的表達(dá)情況

3 討 論

NS是指由多種病因引起，以腎小球基膜通透性增加伴腎小球?yàn)V過率降低等腎小球病變?yōu)橹鞯囊唤M綜合征，腎小球上皮細(xì)胞足突消失融合、腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化是NS的主要病理變化[8]。NS的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，目前認(rèn)為NS是腎小球屏障損傷、致蛋白尿因子異常、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、遺傳因素等因素共同參與、相互影響的結(jié)果，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被認(rèn)為是NS重要的發(fā)病機(jī)制之一[9]。腎小球足細(xì)胞損傷使其屏障作用消失，大量蛋白分子從隔膜裂孔中流出而形成蛋白尿，并引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，加速腎臟組織病理變化，且長(zhǎng)期蛋白尿可引發(fā)過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘發(fā)心臟功能損傷[10]。Rojas-Franco等[11]認(rèn)為，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可加速腎小管和腎小球細(xì)胞死亡，對(duì)急性腎損傷小鼠造成不利影響。因此，尋找高效、低風(fēng)險(xiǎn)的新藥物以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，對(duì)于減少蛋白尿、抑制炎癥反應(yīng)從而改善NS患者預(yù)后意義重大。

中醫(yī)認(rèn)為NS屬于“水腫” “尿濁” “虛勞”范疇，為肺、脾、腎相干之病，其本在腎，主要病機(jī)為風(fēng)邪侵肺、肺失宣降、脾腎不固、脾失轉(zhuǎn)輸、水液內(nèi)停、腎失開闔，以致膀胱氣化失司、氣滯血瘀，終而發(fā)病，故治療應(yīng)以活血化瘀、祛風(fēng)補(bǔ)腎為主[12]。中藥虎杖取自蓼科植物虎杖的干燥根莖及根，性微寒，味微苦，歸肝經(jīng)、膽經(jīng)、肺經(jīng)，祛風(fēng)、破瘀、通經(jīng)，清代醫(yī)學(xué)典籍《醫(yī)林纂要》記載，虎杖可堅(jiān)腎、強(qiáng)陽益精、壯筋骨、增氣力?；⒄溶帐翘崛∽曰⒄鹊囊环N天然芪類單體，其通過增強(qiáng)鈉離子/鈣離子蛋白交換、提升心肌細(xì)胞內(nèi)外游離鈣離子濃度，直接增強(qiáng)心肌收縮力，從而發(fā)揮增強(qiáng)心肌功能、抑制血栓形成的作用，可用于治療心血管疾病[13]。El-Hameed[14]研究認(rèn)為，虎杖苷可通過減輕腎臟炎癥反應(yīng)，對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠產(chǎn)生積極影響，提示虎杖苷可作為治療腎臟疾病的潛在藥物。曾晨等[15]采用虎杖苷干預(yù)經(jīng)過缺氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可通過抗氧化作用來減輕心臟損傷，具有心肌保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，虎杖苷組大鼠的24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平及二尖瓣A值降低，IVRT縮短，二尖瓣E值升高，這提示虎杖苷可改善阿霉素腎病大鼠的腎臟及心肌功能。

PERK/eIF2α/CHOP通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的主要信號(hào)傳導(dǎo)通路，其中PERK是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種Ⅰ型跨膜蛋白，可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)新生蛋白的合成[16]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后，PERK與其伴侶分子GRP78解離，在胞漿內(nèi)磷酸化從而被激活，進(jìn)而使下游效應(yīng)因子eIF2α磷酸化，抑制蛋白質(zhì)合成，同時(shí)p-eIF2α上調(diào)活化轉(zhuǎn)錄因子4的表達(dá)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過度發(fā)生后，活化的轉(zhuǎn)錄因子4促使CHOP轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞凋亡，造成組織損傷[17]。盡管NS的發(fā)病機(jī)制仍不明確，但越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在其發(fā)病和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，特別是在腎小管間質(zhì)損傷中，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可有效改善該病引起的臟器損傷[18-19]。Song等[20]發(fā)現(xiàn)，抑制PERK/CHOP通路可通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷，降低7-羥基甲氨蝶呤誘導(dǎo)的腎毒性，從而緩解急性腎損傷，提示PERK/CHOP通路在腎臟疾病中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠的腎臟組織CHOP蛋白表達(dá)量、p-PERK/PERK比值、p-eIF2α/eIF2α比值均升高，經(jīng)虎杖苷干預(yù)后上述指標(biāo)均降低，且在虎杖苷基礎(chǔ)上加用PERK/eIF2α/CHOP通路激活劑CCT020312可減弱虎杖苷對(duì)阿霉素腎病模型大鼠腎臟及心肌的保護(hù)作用，這提示在阿霉素腎病模型大鼠中PERK/eIF2α/CHOP通路被異常激活，虎杖苷可能通過抑制該通路對(duì)阿霉素腎病模型大鼠的腎臟及心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。

綜上所述，虎杖苷可保護(hù)阿霉素腎病模型大鼠的腎臟及心臟功能，推測(cè)其作用機(jī)制與抑制PERK/eIF2α/CHOP信號(hào)通路有關(guān)。但本研究仍存在一定局限性，虎杖苷可能通過多靶點(diǎn)、多通路治療阿霉素腎病大鼠，其具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討。