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    基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術研究裸花紫珠化學成分抗感染的作用機制

    2022-02-18 08:59:40劉曉軒李亞梅楊建瓊金洪光李林福
    贛南醫(yī)學院學報 2022年11期
    關鍵詞:裸花紫珠木犀

    劉曉軒,李亞梅,肖 邦,楊建瓊,金洪光,黃 浩,李林福,劉 海

    (1. 贛南醫(yī)學院2021級碩士研究生;2. 贛南醫(yī)學院2019級碩士研究生;3. 贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心,江西 贛州 341000;4. 九江學院,江西 九江 332000;5. 贛南醫(yī)學院藥學院 國家中藥現(xiàn)代化工程技術研究中心-客家中醫(yī)藥資源研究分中心,江西 贛州 341000)

    感染通常是指細菌、病毒、真菌等病原體侵入人體所引起的局部組織或全身性反應。主要表現(xiàn)為白細胞增多、貧血、彌漫性血管內(nèi)凝血(Disseminated intravascular coagulation, DIC)、發(fā)熱等癥狀。老人、兒童及免疫功能低下者治療不及時可能發(fā)展為敗血癥或休克,危及生命。自20 世紀20 年代青霉素[1]被發(fā)現(xiàn)以來,抗生素成為對抗感染的主要治療方法,拯救了數(shù)以萬計的生命,被認為是20 世紀最偉大發(fā)現(xiàn)之一[2]??股赝ㄟ^干擾病原微生物細胞壁、蛋白質(zhì)及遺傳物質(zhì)的合成發(fā)揮抗感染作用,作用單一且易產(chǎn)生耐藥性。而中藥具有多靶點、多通路、多機制的特點,近年來在抗感染治療的研究中受到廣泛關注[3]。

    裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.)為馬鞭草科紫珠屬植物,主要分布于我國長江流域以南,在江西、福建、廣東、廣西、海南等地均有生長[4-5]。屬于海南大宗性地道藥材,是黎族醫(yī)師常用的藥材之一[6]。裸花紫珠是一種多年生常綠灌木,全年均可采收,以其干燥或帶嫩枝的葉入藥,具有止血凝血、消炎鎮(zhèn)痛、解毒抗菌等作用[7-10]。裸花紫珠化學成分主要包括黃酮類、苯乙醇苷類、萜類、揮發(fā)油和酚類等,本課題組前期研究獲得15個裸花紫珠抗菌活性成分[11]分別為:梓醇(Catalpol)、原兒茶酸(Protocatechuic acid)、原兒茶醛(3,4-Dihydroxybenzaldehyde)、咖啡酸(Caffeic acid)、阿魏酸(Ferulic acid)、毛蕊花糖苷(Acteoside)、木犀草苷(Cynaroside)、異毛蕊花糖苷(Isoacteoside)、2'-乙酰基金石蠶苷(Brandioside)、2'-乙?;锘ㄌ擒眨?'-Acetylacteoside)、木犀草素(Luteolin)、槲皮素(Quercetin)、芹菜素(Apigenin)、異鼠李素(Isorhamnetin)、5,4'-二羥基-3,7,3'-三甲氧基黃酮(5,4-Dihydroxy-3',7',3'-trimethoxyflavone)。但裸花紫珠抗菌成分發(fā)揮抗感染作用的具體靶點及通路尚不明確,作用機制有待闡明。

    網(wǎng)絡藥理學具有與中藥作用類似特點,可以系統(tǒng)展示多靶點、多通路的網(wǎng)絡架構,通過數(shù)據(jù)分析實現(xiàn)藥物與疾病相互作用的可視化[12],近年來已經(jīng)成為研究中藥藥效基礎及藥效分子作用機制的一種有效方法[13]。網(wǎng)絡藥理學可使大量成分靶點更加系統(tǒng)精確定位,避免了以往研究方法的局限性[14]。網(wǎng)絡藥理學將藥物-基因-疾病等模塊關聯(lián),以高通量方式從眾多靶點、通路中篩選出相關信息,證實藥物的作用機制及闡明化合物之間的協(xié)同作用[15],但網(wǎng)絡藥理學預測結果需要驗證。分子對接技術可以在分子水平上預測活性成分與靶點結合模式,增加結果可信性,從而對藥物活性成分進行輔助篩選[16]。筆者以本課題組前期研究獲得的15 個裸花紫珠抗菌活性成分為研究對象,采用網(wǎng)絡藥理學方法對其抗感染作用的相關靶點和通路進行分析和篩選,獲取核心作用靶點,而后采用分子對接技術對其進一步驗證,以探究裸花紫珠發(fā)揮抗感染作用的可能或潛在機制。

    1 資料與方法

    1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件本研究使用的數(shù)據(jù)庫及軟件的功能介紹如表1所示。

    表1 數(shù)據(jù)庫及軟件總匯

    1.2 15個裸花紫珠抗菌活性成分獲得根據(jù)本課題組前期對裸花紫珠抗菌作用的譜效學研究[11],從裸花紫珠藥材中獲得15個抗菌活性成分,分別是梓醇、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、木犀草苷、異毛蕊花糖苷、2'-乙?;鹗Q苷、2'-乙?;锘ㄌ擒?、木犀草素、槲皮素、芹菜素、異鼠李素、5,4'-二羥基-3,7,3'-三甲氧基黃酮。在PubChem數(shù)據(jù)庫中搜索各成分的smile號及CAS號。

    1.3 裸花紫珠抗菌活性成分靶點收集將1.2 項中獲得的smile 號及CAS 號在TCMSP 及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中檢索,收集15個裸花紫珠抗菌活性成分的作用靶點,之后使用Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白名稱統(tǒng)一為基因名稱。

    1.4 感染相關靶點的篩選及交集靶點的獲得以"inflection"為關鍵詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中進行檢索與篩選,選擇相關性>1 的靶點作為感染類疾病的相關靶點,后將其與裸花紫珠抗菌活性成分作用靶點進行交集,通過Bioinformatics & Evolutionary Genomics 網(wǎng)站在線制作Venn 圖,獲得交集靶點信息,得到裸花紫珠抗菌活性成分抗感染的潛在靶點。

    1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(PPI)的構建及核心靶點的篩選將1.4 項中獲得的交集靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫,選擇Multiple proteins 后輸入已獲得的交集靶點基因,選擇置信區(qū)間>0.70,其余參數(shù)保持默認設置,得到裸花紫珠抗菌成分抗感染作用的蛋白相互作用網(wǎng)絡(Protein-protein interaction, PPI)。通過Cytoscape 3.9.0 對獲得的PPI 網(wǎng)絡進行分析和可視化處理,使用cyto Hubba 插件進行網(wǎng)絡拓撲分析,篩選出PPI網(wǎng)絡中藥物與疾病的核心靶點。

    1.6 基因本體分析(GO)與通路富集分析(KEGG)分析運用omicshare 基因數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站,對上述1.4 獲得的交集靶點進行GO 富集分析及KEGG通路富集分析。

    1.7 構建成分-靶點-通路圖將上述得到的裸花紫珠中15個抗菌活性成分、交集靶點、1.6項中富集得到的感染主要相關信號通路導入Cytscope 3.9.0中,構建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡,并通過網(wǎng)絡度值(degree值)的大小對網(wǎng)絡進行分析。

    1.8 分子對接驗證先從ZINC 中下載1.7 項中degree 排名前2 的活性成分的Mol2 格式文件,再從RCSB網(wǎng)站下載1.7項中degree值排名前5核心靶點的PDB文件。運用Discovery studio 軟件進行分子對接驗證。采用libdockscore 值評估兩者之間的結合能力,若 libdockscore>100,則提示對接分子能夠自發(fā)進行結合,且結合穩(wěn)定。

    2 結 果

    2.1 裸花紫珠抗菌活性成分靶點收集和交集靶點的獲得15 個裸花紫珠抗菌活性成分在TCMSP 數(shù)據(jù)庫及Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫中收集到作用靶點共356 個。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中進行檢索與篩選,獲得與感染相關性>1的靶點2 916個。

    將疾病靶點與裸花紫珠抗菌活性成分作用靶點成分取交集,制作Venn 圖,得到交集靶點231 個(圖1)。交集靶點可能是裸花紫珠發(fā)揮抗感染作用的基礎。

    圖1 藥物-疾病交集靶點Venn圖

    2.2 蛋白互作網(wǎng)絡圖的構建及核心靶點篩選將藥物-疾病交集靶點導入String 網(wǎng)絡平臺分析,設置置信區(qū)間為high confidence 0.70,借助Cytscope 3.9.0,對保存的TSV 格式文件進行可視化處理(圖2)。節(jié)點代表靶點蛋白,邊代表蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的作用關系,網(wǎng)絡連接程度越高說明蛋白質(zhì)之間關系越密切,以同心圓排列degree 值越高的蛋白節(jié)點越大,顏色越深,越趨于中心位置。通過計算得到degree 值排名前20 的靶點(表2),其中排名前5的核心靶點為:STAT3、TNF、AKT1、IL6、VEGFA。

    表2 PPI網(wǎng)絡中degree值排名前20靶點特征參數(shù)

    圖2 裸花紫珠中15個抗菌活性成分抗感染的PPI網(wǎng)絡圖

    2.3 GO 分析及KEGG 分析通過omicshare 基因數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站對藥物-疾病交集靶點進行GO 富集分析和KEGG 通路分析。GO 功能富集分析共得到8 365 個GO 條目,其中包含6 750 個生物學過程(Biological Process,BP)條 目、601 個 細 胞 組 成(Cellular Component,CC)條目和1 014 個分子功能(Molecular Function,MF)條目,根據(jù)P值選擇最具統(tǒng)計學意義數(shù)據(jù)作GO分析條狀圖(圖3)。

    圖3 GO富集分析條狀圖

    主要涉及的生物過程包括細胞代謝過程(Cellular process)、刺激反應(Response to stimulus)、代謝過程(Metabolic process)、生物調(diào)節(jié)功能(Biological regulation)、調(diào)節(jié)生物進程(Regulation of biological process)等;涉及到細胞組成包括細胞(Cell)、細胞組分(Cell part)、細胞器(Organelle)等;主要分子功能為結合(Binding)、催化活性(Catalytic activity)、分子功能調(diào)節(jié)器(Molecular function regulator)等。推測靶點基因主要是通過誘發(fā)炎癥反應、調(diào)節(jié)細胞代謝、調(diào)節(jié)酶的催化、誘導細胞凋亡等過程達到抗菌效果。

    KEGG 通路富集分析結果顯示上述步驟篩選出的交集基因與癌癥和感染通路相關性高(圖4),可以證明網(wǎng)絡藥理學結果可靠。KEGG 共富集通路272 條,根據(jù)P值排序選擇排名前20 的通路進行展示,其中17 個與人類疾病相關,2 個與環(huán)境因素有關,1 個與微生物有關。根據(jù)P值排序,相關性排名前5 的信號通路依次為: Pathways in cancer、Human cytomegalovirus infection、Proteoglycans in cancer、MicroRNAs in cancer、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection(圖5、表3)。

    表3 KEGG通路富集分析排名前20的信號通路

    圖4 KEGG通路富集結果

    圖5 KEGG通路富集分析圈圖

    2.4 構建成分-靶點-通路圖將藥材裸花紫珠中15 種抗菌活性成分、交集靶點及富集得到的信號通路導入Cytoscape 3.9.0 中構建網(wǎng)絡圖(圖6)。成分-靶點-通路圖中有272 個節(jié)點和1 210 條邊。根據(jù)degree 值大小設置節(jié)點大小,degree 值越大節(jié)點越大。排名前5 的活性成分為:Quercetin、Luteolin、Apigenin、5,7-Dihydroxy-3',4',5'-trimethoxyflavone、Isorhamnetin;排 名 前5 信 號 通 路 為:Human cytomegalovirus infection、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、 Hepatitis B、 Human papillomavirus infection、 Epstein-Barr virus infection。

    圖6 成分-靶點-通路圖

    2.5 分子對接將degree 值排名前2 的化合物作為代表性藥物分子與degree 值排名前5 的核心靶點(表4)進行分子對接驗證實驗結果如表5所示,木犀草 素(Luteolin)和 槲 皮 素(Quercentin)與STAT3、TNF、AKT1、IL-6、VEGFA 的libdockscore 均>100,木犀草素-AKT1,槲皮素-STAT3 有更高的libdockscore值,說明本課題組前期篩選出的裸花紫珠抗菌活性成分可靠,且AKT1 與STAT3 可能為發(fā)揮抗感染作用的主要靶點。對配體-受體復合物進行可視化展示可以得到藥物小分子木犀草素和槲皮素,能夠分別穩(wěn)定對接到蛋白AKT1、STAT3 的活性口袋中,對接2D 結構示意圖(圖7、圖8)顯示藥物小分子與靶點蛋白結合主要為氫鍵和Π 鍵,Π 鍵主要包括烷基-Π 鍵(Pi-alkyl)、陰離子-Π 鍵(Pi-cation)、陽離子-Π鍵(Pi-anion),除此之外鹽橋、范德華力和碳氫鍵等也在某些分子結合中發(fā)揮作用。分子對接2D 結果顯示,藥物小分子木犀草素與靶點蛋白AKT1 中的ASP、THR、PRO、MET、HIS 等氨基酸殘基結合;藥物小分子槲皮素與靶點蛋白STAT3 中的ARG、LYS、ASN、HIS、SER等氨基酸殘基結合。

    圖7 木犀草素-AKT1 分子對接結果及結合方式

    圖8 槲皮素-STAT3分子對接結果及結合方式

    表4 degree值排名前5的核心靶點蛋白RCSB號

    表5 分子對接Libdockscore值

    3 討 論

    感染一般是由病原微生物侵入人體導致,表現(xiàn)為局部血流量增加、組織液滲出、白細胞聚集增多等,與“炎癥”表現(xiàn)相似[17-19]。張靜怡等[20]研究發(fā)現(xiàn),止癢皮膚液因含有抗炎抗菌成分對皮疹有更好的治療效果,裸花紫珠不僅可以抗菌還具有消炎、解毒等作用[21],因此對于感染類疾病的治療可能具有更加優(yōu)越的治療效果。

    通過PPI 網(wǎng)絡圖得到degree 值排名前5 的核心靶點為STAT3、TNF、AKT1、IL6、VEGFA。孫云等[22]研究發(fā)現(xiàn),IL6、STAT3 與孕婦B 族鏈球菌感染有關;雷聲云等[23]研究發(fā)現(xiàn),女性人乳頭瘤病毒感染與STAT3 相關。STRANGFELD A 等[24]通過免疫和臨床研究發(fā)現(xiàn),TNF 在防御細菌感染中起到非常關鍵的作用,使用TNF 抑制劑治療的患者具有更高的細菌易感性。此外,俞曉進等[25]通過建立小鼠動物模型證實,多種細菌可以誘導機體產(chǎn)生TNF,TNF主要通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和改善代謝來抵御細菌侵襲,證明TNF 在抗菌感染中發(fā)揮重要作用。ZHAO J 等[26]研究發(fā)現(xiàn),TNF、AKT1、IL6 為清肺排毒湯治療新冠肺炎的關鍵分子。GUAN J等[27]研究發(fā)現(xiàn),在大腸桿菌、肺炎克雷伯菌感染時IL-6表達上調(diào),治療后IL-6表達下降。SHEN X 等[28]通過網(wǎng)絡藥理學方法篩選地榆抗幽門螺桿菌得出AKT1、VEGFA 等為核心靶點。LIU G 等[29]研究發(fā)現(xiàn),蛋白激酶(AKT1)在細菌感染時被下調(diào),在急性炎癥性肺損傷和金黃色葡萄球菌感染小鼠模型中,AKT1 缺乏導致嚴重的疾病進展,伴隨著中性粒細胞的募集和殺菌活性的增強。YANG R 等[30]研究發(fā)現(xiàn),VEGFA 可以通過調(diào)節(jié)TLR2-MAPK-ERK1/2 信號通路參與腦膜炎大腸桿菌誘導的血腦屏障破壞,表明VEGFA為預防臨床大腸桿菌腦膜炎的基本靶標。由此可知,本文篩選出的前5 個核心靶點STAT3、TNF、AKT1、IL6、VEGFA均參與炎癥反應和調(diào)節(jié)免疫應答,表明裸花紫珠中抗菌活性成分可能是通過作用于多個靶點發(fā)揮抗感染作用。

    最后通過分子對接技術對網(wǎng)絡藥理學結果進行驗證,結果表明,祼花紫珠抗菌活性代表性成分木犀草素、槲皮素與核心靶點中degree 值排名前5的基因對接結果良好,其中AKT1、STAT3 具有更高的結合趨勢。

    4 結 論

    綜上所述,通過網(wǎng)絡藥理學對15 個裸花紫珠抗菌活性成分靶點進行篩選,而后選擇核心靶點degree 值排名前5 的靶點STAT3、TNF、AKT1、IL6、VEGFA 分別與代表性藥物進行分子對接,對接結果均良好,其中AKT1、STAT3 具有更高的libdockscore值,表明AKT1、STAT3 可能為裸花紫珠發(fā)揮抗感染作用的關鍵靶點。推測裸花紫珠抗菌活性成分主要通過調(diào)控細胞代謝和人體免疫應答發(fā)揮抗感染作用。本研究可為后續(xù)裸花紫珠抗感染作用機制的深入研究指明方向。

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