基于蛋白降解靶向嵌合體技術(shù)的分子膠降解劑的研究進(jìn)展

魏一飛，歐陽(yáng)毅翔，程齊來(lái)，郭小華

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；2. 贛南醫(yī)學(xué)院圖書館，江西 贛州 341000）

蛋白降解靶向嵌合體（Proteolysis Targeting Chimera，PROTAC），是一類可利用細(xì)胞內(nèi)的垃圾分類處理系統(tǒng)降解一些蛋白的新型藥物分子，PROTAC 藥物一端連接E3 連接酶，一端連接擬降解的蛋白，當(dāng)三者形成復(fù)合體，擬降解的蛋白就會(huì)被一種叫泛素的分子標(biāo)記，然后細(xì)胞內(nèi)的降解酶就會(huì)降解該蛋白，達(dá)到治病的目的?；赑ROTAC 技術(shù)設(shè)計(jì)藥物的最大的優(yōu)勢(shì)之一是能夠使靶點(diǎn)從“不可成藥性”變成“可成藥性”［1-3］。大多數(shù)小分子藥物或單抗需要結(jié)合酶的活性位點(diǎn)發(fā)揮作用，但對(duì)于那些無(wú)酶功能的蛋白，尤其那些缺乏酶活性或表面缺乏成藥位點(diǎn)的蛋白，卻是無(wú)能為力的。然而，人類細(xì)胞中80%以上的蛋白缺乏這樣的位點(diǎn)，而PROTAC 分子卻可以捕獲這些蛋白，并將其快速降解清除［4］。近年來(lái)，隨著誘導(dǎo)靶蛋白降解策略的突飛猛進(jìn)，PROTAC技術(shù)已成為很有希望的新藥開發(fā)技術(shù)之一［5-6］。

PROTAC 分子本身包含三個(gè)不同的部分：一個(gè)與目標(biāo)蛋白結(jié)合的配體、一個(gè)與E3連接酶結(jié)合的配體，以及一個(gè)連接這兩個(gè)配體的鏈接器。其作用機(jī)制如圖1：PROTAC 分子通過(guò)與目標(biāo)蛋白結(jié)合后將目標(biāo)蛋白與E3 泛素連接酶進(jìn)行拉攏，使得E3 可以泛素化標(biāo)記的目標(biāo)蛋白，被泛素化的目標(biāo)蛋白可以通過(guò)蛋白酶體途徑降解掉［7-8］。

圖1 PROTAC分子降解目標(biāo)蛋白的作用機(jī)制示意圖

從化合物設(shè)計(jì)方面，PROTACs 相對(duì)簡(jiǎn)單，用一個(gè)linker 連接泛素連接酶配體和特定靶點(diǎn)的配體，但這類分子分子量往往較大，成藥性難度較大［8］。除PROTACs 外，一類被稱為分子膠（glue）的小分子也可成功誘導(dǎo)靶蛋白的降解。沙利度胺類抗癌藥物是分子膠的一個(gè)顯著例子，這類藥物可重定向E3泛素連接酶CRL4CRBN，從而使轉(zhuǎn)錄因子IKZF1 和IKZF3 多聚泛素化，導(dǎo)致IKZF1 和IKZF3 被蛋白酶體降解［9］。類似地像磺胺類抗癌藥物Indisulam，可引導(dǎo)CRL4DCAF15E3泛素連接酶降解剪接因子RBM23和RBM39。這類能降解靶蛋白的小分子化合物被稱為分子膠降解劑（glue degraders）［10-11］。

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，分子膠降解劑是一類可誘導(dǎo)E3泛素連接酶底物受體與靶蛋白之間新型相互作用，從而導(dǎo)致靶蛋白降解的小分子。由于分子膠降解劑與PROTACs 一樣，可顯著減輕對(duì)靶蛋白上的活性相關(guān)口袋（pockets）的需求，而成為有潛力的可成藥候選分子，尤其在腫瘤的治療方面有廣泛的應(yīng)用前景［12-14］。

盡管現(xiàn)有的分子膠降解劑顯示出了靶向不可成藥蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子和剪接因子）的能力，但現(xiàn)有的分子膠降解劑都是偶然發(fā)現(xiàn)的，開發(fā)這類藥物仍極具挑戰(zhàn)性。本文將根據(jù)作用靶點(diǎn)的不同，分類對(duì)目前備受關(guān)注的分子膠降解劑進(jìn)行綜述。

1 靶向CRLs連接酶的分子膠降解劑

卡林環(huán)連接酶（cullin-ring ligases，CRLs）是E3泛素連接酶中最大的一個(gè)家族，通過(guò)將底物受體（substrate receptor，SRs）和適配器蛋白圍繞不同的cullin 骨架進(jìn)行組裝，形成了超過(guò)250 種CRLs［15-16］。針對(duì)一些不可成藥蛋白累積引起的嚴(yán)重疾病，傳統(tǒng)的拮抗劑研究策略很難有所創(chuàng)新和突破，而蛋白質(zhì)活性的藥理調(diào)節(jié)的一個(gè)有希望的替代方法就是將小分子重定向到E3泛素連接酶進(jìn)行降解。

研究發(fā)現(xiàn)，以E7820、Indisulam 和Tasisulam 為代表的磺酰胺類分子膠降解劑（圖2，化合物1-3），可化學(xué)重定向CRLs 的底物受體CRL4DCAF15連接酶并與之結(jié)合［12，17-19］。與連接酶結(jié)合后的分子膠被包裹在DCAF15 表面的一個(gè)由R552、V556、V559 等氨基酸構(gòu)成的淺口袋中，以協(xié)同的方式與DCAF15結(jié)合，其中磺酰胺中磺?；系难踉优c淺口袋周圍的氨基酸形成了氫鍵相互作用力［20］。

圖2 DCAF15蛋白分子膠降解劑

動(dòng)力學(xué)研究表明，磺酰胺類化合物作為一類分子膠降解劑，在與CRL4DCAF15連接酶結(jié)合后，可識(shí)別基因剪接因子RBM39、RBM23 的RRM2 結(jié)構(gòu)域，誘導(dǎo)RBM39、RBM23 向CRL4DCAF15連接酶靠籠并使之發(fā)生泛素化，遂被降解［18］。

SIMONETTA K R 等［21］在2019 年報(bào)道了一類酰胺類分子膠降解劑（圖3，化合物5-11），作用機(jī)制與磺酰胺分子膠降解劑類似，可與CRL4 E3 連接酶底物受體蛋白Cereblon（CRBN）結(jié)合，促進(jìn)與非原生淋巴轉(zhuǎn)錄因子Ikaros（IKZF1）和Aiolos（IFZF3）以及酪蛋白激酶1α（CK1α）的相互作用，導(dǎo)致它們被RING E3 連接酶CRL4CRBN泛素化，隨后被26S 蛋白酶體降解。

圖3 CRBN蛋白分子膠降解劑

MAYOR-RUIZ C 等［12］通過(guò)差異化學(xué)分析方法發(fā)現(xiàn)了一類酰胺類分子膠降解劑（圖4，化合物12-19），要通過(guò)重定向CRL4 連接酶專屬的底物受體才能發(fā)揮降解目標(biāo)蛋白作用。他們采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)、功能基因組策略等方法交叉研究，探索這類分子膠降解劑誘導(dǎo)靶蛋白降解的機(jī)制，結(jié)果表明，這類酰胺類分子膠可增強(qiáng)DDB1、CRBN 等專屬底物受體與cyclin K 之間的親和力，促進(jìn)cyclin K 泛素化而被降解［22］。

圖4 DDB1、CRBN蛋白分子膠降解劑

2 靶向細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的分子膠降解劑

BETTAYEB K 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，CR8（圖5，化合物20）是一種選擇性周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑，是CDK1、2、5 和9 的有效抑制劑，其中對(duì)CDK1、CDK2 蛋白的抑制活性分別達(dá)到了0.09 μmol·L-1和0.041 μmol·L-1。

2020 年，S?ABICKI M 等［14］報(bào)道稱，CR8 其類似化合物（圖5，化合物20-23）作為一種分子膠降解劑可誘導(dǎo)CDK12-cyclin K 和CUL4 底物蛋白DDB1 之間形成復(fù)合物，將cyclin K 進(jìn)行泛素化和降解。這類分子膠降解劑與CDK蛋白結(jié)合后，可占據(jù)CDK蛋白的ATP 結(jié)合口袋，并通過(guò)結(jié)構(gòu)中的苯基吡啶部分與口袋周圍的氨基酸形成疏水相互作用力?；衔?2 苯環(huán)上無(wú)吡啶基取代、化合物23 無(wú)苯環(huán)結(jié)構(gòu)，其誘導(dǎo)與CDK蛋白的結(jié)合能力逐漸減弱［24-26］。

圖5 CDK1、CDK2蛋白依賴性激酶分子膠降解劑

LV L 等［27］利用高通量小分子化合物篩選發(fā)現(xiàn)了一類新的分子膠降解劑（圖6，化合物24-35），并利用化學(xué)遺傳學(xué)和生物化學(xué)重組實(shí)驗(yàn)，揭示了這類分子膠是通過(guò)誘導(dǎo)CDK12 和DDB1 的相互作用，導(dǎo)致CDK12結(jié)合蛋白cyclin K 泛素化和降解的作用機(jī)理，這項(xiàng)研究為靶向蛋白降解提供了一種新的策略。

圖6 CDK12蛋白依賴性激酶分子膠降解劑

李金秀等［28］在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，介紹了目前處在臨床研究中的CDK9 蛋白的分子膠降解劑（圖7，化合物36-43）。盡管這些CDK9 抑制劑有潛在的抗腫瘤活性，但由于臨床不良反應(yīng)較明顯，其臨床研究進(jìn)展緩慢，僅化合物37進(jìn)入了Ⅲ期臨床研究，活性和安全性也有待于進(jìn)一步評(píng)估［29-30］。隨著PROTAC 技術(shù)興起，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)也相繼報(bào)道了一些新型的CDK9抑制劑，為基于CDK9靶點(diǎn)的分子膠降解劑的藥物研發(fā)提供了廣闊的思路［31-35］。

圖7 CDK9蛋白依賴性激酶分子膠降解劑

3 靶向細(xì)胞色素P450 1B1的分子膠降解劑

細(xì)胞色素P450 1B1（CYP1B1）在多種腫瘤中高度表達(dá)，是腫瘤預(yù)防、治療的一個(gè)有吸引力和潛在的靶點(diǎn)，抑制CYP1B1是目前治療CYP1B1介導(dǎo)的惡性腫瘤的主要治療模式，但目前治療效果甚微［36］。利用PROTAC 技術(shù)設(shè)計(jì)分子膠降解劑可能是促進(jìn)CYP1B1 蛋白泛素化和蛋白酶體降解的一種有效途徑。

ZHOU L 等［37］以α-萘黃酮類為母核，設(shè)計(jì)了一類靶向CYP1B1 蛋白的特異性分子膠（圖8，化合物44-52），能促進(jìn)CYP1B1 蛋白的降解，降低化療藥物的耐藥性。其中在α-萘黃酮上用不同碳鏈連接沙度利胺得到的衍生物，能有效克服CYP1B1 介導(dǎo)的多西他賽耐藥，特別是化合物51，在無(wú)毒濃度下幾乎完全逆轉(zhuǎn)DU145/CY 細(xì)胞的耐藥性，被認(rèn)為是最有潛力的CYP1B1靶向降解劑［37］。

圖8 CYP1B1蛋白特異性分子膠降解劑

4 靶向轉(zhuǎn)錄抑制因子BCL6的分子膠降解劑

BCL6是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，在抗體親和成熟過(guò)程中起關(guān)鍵作用。BCL6的調(diào)控異常，可誘導(dǎo)生發(fā)中心的B 細(xì)胞發(fā)生腫瘤，BCL6 因此被認(rèn)為是彌漫性B細(xì)胞淋巴瘤的治療靶點(diǎn)［38］。

BELLENIE B R 等［39］報(bào)道了兩個(gè)能誘導(dǎo)B 細(xì)胞中BCL6 蛋白的迅速降解的苯并咪唑酮抑制劑（圖9，化合物53-54），在對(duì)這兩個(gè)苯并咪唑酮化合物結(jié)構(gòu)優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)了化合物CCT369260（化合物55）。研究表明［39］，CCT369260 口服給藥后可降低淋巴瘤異種移植小鼠模型中BCL6 水平，該化合物目前在進(jìn)行臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究，有望成為血液系統(tǒng)腫瘤的治療靶點(diǎn)。

圖9 BCL6蛋白分子膠降解劑

5 靶向表皮生長(zhǎng)因子受體的分子膠降解劑

表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）是一種受體酪氨酸激酶（tyrosine kinase，RTK），在調(diào)控細(xì)胞增殖、代謝、凋亡和存活等基本細(xì)胞過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，EGFR 過(guò)表達(dá)或突變是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）發(fā)病和發(fā)展最常見的原因之一［40-41］。臨床上治療NSCLC的藥物主要是靶向EGFR，但遺憾的是，不管是第一代、第二代還是第三代EGFR 抑制劑，都不可避免出現(xiàn)不同程度的耐藥性，這給NSCLC的治療提出了新的挑戰(zhàn)［42］。

受PROTAC 技術(shù)的啟發(fā)，ZHANG H 等［43］研制了第四代EGFR 抑制劑（圖10，化合物56-69）作為分子膠降解劑，誘導(dǎo)EGFR 蛋白的降解，以期克服EGFR突變體介導(dǎo)的耐藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明［43］，化合物57和化合物65 在HCC827 細(xì)胞中誘導(dǎo)EGFR 蛋白降解的DC50值分別為45.2 nmol·L-1和34.8 nmol·L-1，有潛力成為有效的靶向EGFR的分子膠降解劑。

圖10 EGFR蛋白分子膠降解劑

除以上綜述的各靶點(diǎn)的分子膠降解劑外，靶向其他一些蛋白的降解劑也逐漸被發(fā)現(xiàn)。如YANG C Y 等［44］和LU X P 等［45］報(bào)道的靶向溴域和外末端（BET）蛋白分子膠降解劑，以酪氨酸激（BTK）［46］、間變性淋巴瘤激酶（ALK）［47］、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）［48］為靶點(diǎn)的分子膠降解劑正逐漸進(jìn)入研究者的視野。不斷涌現(xiàn)的新型分子膠降解劑也為藥物治療耐藥性及蛋白缺乏成藥位點(diǎn)等問(wèn)題提供了新的解決策略。

6 總結(jié)與展望

PROTAC 技術(shù)是當(dāng)前新藥研發(fā)領(lǐng)域最熱門的技術(shù)之一，以PROTACs概念為基礎(chǔ)的分子膠降解劑通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)誘導(dǎo)靶蛋白降解，使靶點(diǎn)由“不可成藥性”變成“可成藥性”，克服了目前腫瘤等疾病治療的耐藥性等問(wèn)題，是藥物研究的一大突破性成果。盡管PROTAC 技術(shù)被認(rèn)為是藥物研發(fā)的“大殺器”，但其成藥之路并不順利，目前這類藥物的研發(fā)仍處于臨床前研究或臨床研究的初期。主要原因有：分子膠降解劑分子量普遍偏大，其水溶性、口服生物利用度不理想；分子膠降解劑易降解除致病蛋白之外的其他蛋白而產(chǎn)生脫靶毒性，其毒性評(píng)價(jià)有待于進(jìn)一步研究；分子膠降解劑合成難度和合成成本較高，開發(fā)周期較長(zhǎng)。

基于PROTAC 技術(shù)的分子膠降解劑已經(jīng)為新藥研發(fā)開啟了新的篇章，給全球制藥巨頭企業(yè)帶來(lái)了前所未有的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。隨著 PROTAC 技術(shù)的不斷發(fā)展完善，分子膠降解劑的諸多瓶頸勢(shì)必被打破，這類藥物幫助更多患者的曙光也即將到來(lái)。