糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的GC-MS分析及其抗炎活性

唐思琪，徐 依，2，索宗武，羅 姣，黃 浩，程齊來，劉向前，李小軍

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心-客家中醫(yī)藥資源研究分中心；2. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江西 贛州 341000；3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208）

糙葉五加（Acanthopanax henryi）為中國特有的五加科五加屬植物，廣泛分布于湖南、江西、湖北、浙江、安徽等地［1］。其根皮（也稱五加皮）收載于《湖南省中藥材地方標(biāo)準(zhǔn)》，具有祛風(fēng)利濕、活血舒筋、理氣止痛等功效，主要用于治療風(fēng)濕痹痛、拘攣麻木、筋骨痞軟、水腫、跌打損傷、疝氣腹痛等［1-3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，糙葉五加提取物及其化學(xué)成分具有多種藥理活性，如抗炎［3-5］、抗神經(jīng)炎［6］、抗菌［7］、抗脂肪蓄積［8］、抗腫瘤［3，9］、抗氧化［10］、抗乙酰膽堿酯酶［10］、抗丁酰膽堿酯酶及抗透明質(zhì)酸酶等活性［3］。前期有研究報道了糙葉五加主要含有萜類（單萜、二萜、三萜皂苷）［3，11-12］、苯丙素類［13］、咖啡?；鼘幩嵫苌铮?，14］、黃酮類［3，15］、木脂素類［3，16］、甾體等二次代謝產(chǎn)物［3，17］，然而，對于糙葉五加的揮發(fā)性及脂溶性化學(xué)成分及其抗炎活性研究鮮見報道。研究表明一氧化氮（NO）在炎癥的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。當(dāng)機(jī)體中的免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）激活，會產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子如NO、前列腺素E2（Prostagladin E2，PGE2）、白細(xì)胞介素（Interleukins，ILs）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）等。然而，促炎細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生，會造成實(shí)質(zhì)性的器官損害甚至死亡，并引發(fā)多種慢性炎癥疾病。因此，通過抑制促炎因子過度分泌是預(yù)防或抑制炎癥及其相關(guān)疾病發(fā)生的有效途徑［4-6］。基于此，我們首次對糙葉五加根皮和莖中的脂溶性成分進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用對比分析，并對其進(jìn)行抗炎活性評價，為今后對糙葉五加的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和綜合開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

安捷倫7890B-7000D型氣相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫）；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上 海 亞 榮）；酶 標(biāo) 儀（Bio-Rad， Hercules， CA，USA）；乙醇（批號：20190403）、石油醚（60～90 ℃，批號：20190315）、二氯甲烷（批號：20200812）均為分析純，購自國藥集團(tuán)；二甲基亞砜（DMSO）、脂多糖（LPS）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、Griess 試劑購自美國Sigma-Aldrich 公司；陽性對照紫鉚因（Butein）、RAW264.7 和BV2 細(xì)胞均來源于韓國圓光大學(xué)藥學(xué)院。

實(shí)驗(yàn)樣品于2021 年3 月份采自湖南省新化，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉向前教授鑒定為五加科五加屬植物糙葉五加［Acanthopanax henryi（Olive.）Harms］的根皮和莖，標(biāo)本保存于贛南醫(yī)學(xué)院江西省高校天然產(chǎn)物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)本號分別為AHR202103和AHS202103。

2 方 法

2.1 供試品的制備分別取陰干后的糙葉五加根皮和莖各100 g，粉碎至粗粉，用無水乙醇加熱回流提取2 次（2 h/次）后合并提取液（2 × 300 mL），減壓回收溶劑得總浸膏?？偨嗉尤?50 mL 蒸餾水分散后用石油醚（60～90 ℃）萃取3 次（3×200 mL），回收溶劑，得石油醚萃取物。取100 μL 石油醚萃取物（脂溶性成分）溶于1 mL二氯甲烷中，作為供試品用于GC-MS分析。

2.2 GC-MS 測試條件GC 條件：色譜柱為美國安捷倫DB-5MS 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），程序升溫初溫為60 ℃，保持4 min，以10 ℃·min-1的速率升至180 ℃，保持5 min，再以5 ℃·min-1升溫至250 ℃，保持5 min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為氦氣，柱前壓為72 kPa，進(jìn)樣量1 μL，流速1.2 mL·min-1。

MS 條件：離子源為EI，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，接口溫度270 ℃，溶劑延遲時間為3 min，掃描質(zhì)量范圍為60～600 amu。依據(jù)糙葉五加根皮和莖的脂溶性成分總離子流色譜圖，采用NIST17.L 質(zhì)譜計算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行檢索，對質(zhì)譜相似度＞70%的化合物進(jìn)行收集整理，以鑒定化合物，運(yùn)用面積歸一法計算得到不同化學(xué)成分占總體的相對百分含量。

2.3 MTT 細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用MTT 細(xì)胞毒性分析試劑盒檢測糙葉五加根皮和莖脂溶性成分對RAW264.7/BV2 細(xì)胞的毒性作用［15-16］。取對數(shù)生長期RAW264.7和BV2細(xì)胞分別接種于96孔板中（1×105個細(xì)胞/孔），37 ℃、5% CO2條件下溫孵培養(yǎng)12 h。設(shè)置對照組和給藥組，給藥組分別加入不同濃度的根皮和莖脂溶性成分（0.1%的DMSO 為溶劑，終濃度分別為50、100、200 μg·mL-1），對照組加入0.1%的DMSO。繼續(xù)溫孵培養(yǎng)12 h 后，每孔取出100 μL上清液，加入終質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1的MTT工作液孵育0.5 h。形成的甲臜鹽使用酸化異丙醇溶解，在酶標(biāo)儀540 nm 處測定各孔吸光度（A）值，計算細(xì)胞存活率，每組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞存活率 = （A給藥組/A對照組）×100%。

2.4 NO 試驗(yàn)采用Griess 法［15-16］檢測糙葉五加根皮和莖脂溶性成分對LPS刺激的RAW264.7/BV2細(xì)胞分泌NO 的抑制作用。取對數(shù)生長期RAW264.7和BV2 細(xì)胞分別接種于96 孔板中（1×105個細(xì)胞/孔），37 ℃、5% CO2條件下溫孵培養(yǎng)12 h 后分別加入100 μL 不同濃度的糙葉五加根皮和莖脂溶性成分（0.1%的DMSO 為溶劑，終濃度分別為50、100、200 μg·mL-1），溫孵培養(yǎng)1 h 后加入100 μL 的LPS（1 μg·mL-1），同時設(shè)空白對照組（培養(yǎng)液）、模型組（LPS+培養(yǎng)液）、陽性對照組（Butein+LPS+培養(yǎng)液），繼續(xù)溫孵培養(yǎng)12 h。將上清液（100 mL）與等體積的格氏試劑混合，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定混合物在540 nm 處的A值，計算NO 抑制率，每組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

NO抑制率=［（A模型組-A給藥組）/（A模型組-A對照組）］×100%。

3 結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)首次通過GC-MS 聯(lián)用技術(shù)對糙葉五加根皮和莖的脂溶性化學(xué)成分進(jìn)行分析研究，由分析結(jié)果可知，糙葉五加根皮脂溶性成分的主要種類為倍半萜及其含氧衍生物（57.39%）、長鏈脂肪酸及其酯類（17.37%）以及少量的單萜（0.18%）、長鏈脂肪醇（0.49%）、長鏈脂肪醛（1.55%）、小分子酚類（2.01%）、酚酸酯類（1.43%）、長鏈烯烴（3.56%）、呋喃類（0.28%）；其莖中主要含有長鏈烷烴（55.76%）、倍半萜及其含氧衍生物（13.52%）、長鏈脂肪醇（8.3%）及少量的不飽和脂肪酸（2%）、小分子酚類（2.03%）、酚酸酯類（0.72%）。其中，糙葉五加根皮中的主要脂溶性成分為Naphthalene， 1，2，3，4，4a，5，6，8a-octahydro-7-methyl-4-methylene-1-（1-methylethyl）-，（1. alpha.， 4a. beta.，8a. alpha.）-（依蘭油烯，8.26%）、Linoleic acid ethyl ester （亞油酸乙酯，8.14%）、1H-Benzocyclohepten-9-ol，2，4a-.beta.，5，6，7，8，9，9a-.beta.-octahydro-3，5，5，9-.beta.-tetramethyl-（5.25%）、Tricyclo［5.4.0.0（2，8）］undec-9-ene，2，6，6，9-tetramethyl- ，（1R，2S，7R，8R）-（4.49%）、1H-Benzocycloheptene，2，4a，5，6，7，8-hexahydro-3，5，5，9-tetramethyl-，（R）-（4.03%）；其莖中的主要脂溶性成分為Hentriacontane （正三十一烷，37.05%）、Triacontane （正三十烷，11.95%）、Naphthalene， decahydro-4a-methyl-1- methylene-7-（1-methylethenyl）-，［4aR-（4a. alpha.，7. alpha.，8a.beta.）］-（7.10%）、Pentacosane （正 二 十 五 烷，6.76%）、2，6，10-Dodecatrien-1-ol，3，7，11-trimethyl-， acetate，（E，E）- （5.53%）；根皮和莖的3 種共有成分為（E）-. beta. -Famesene（根皮：2.11%；莖：0.48%）、Naphthalene， decahydro-4a-methyl-1-methylene-7-（1-methylethenyl）-，［4aR-（4a. alpha.，7. alpha.，8a. beta.）］-（根皮：0.74%；莖：7.1%）、Benzenepropanoic acid，3，5-bis（1，1-dimethylethyl）-4-hydroxy-，ethyl ester（根皮：2.01%；莖：2.03%）。從糙葉五加根皮和莖的脂溶性成分中共鑒定出66個化合物，其中根皮和莖中分別鑒定出54 和15 種脂溶性化學(xué)成分，分別占總量的89.32%和82.33%。糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的化學(xué)成分、含量、總離子流色譜圖見表1、圖1、圖2。結(jié)果表明糙葉五加根皮和莖的脂溶性化學(xué)成分種類和含量均存在較大差異，建議在使用時加以區(qū)分。

圖1 糙葉五加根皮脂溶性成分的總離子流色譜圖

圖2 糙葉五加莖脂溶性成分的總離子流色譜圖

表1 糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的組成和相對含量

續(xù)表1 糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的組成和相對含量

續(xù)表1 糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的組成和相對含量

續(xù)表1 糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的組成和相對含量

續(xù)表1 糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的組成和相對含量

續(xù)表1 糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的組成和相對含量

續(xù)表1 糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的組成和相對含量

另外，MTT 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明在測試濃度為50 μg·mL-1時，對于RAW264.7 和BV2 細(xì)胞，根皮和莖的脂溶性成分均無明顯的細(xì)胞毒性；當(dāng)測試濃度為100 μg·mL-1時，根皮和莖的脂溶性成分對RAW264.7 和BV2 細(xì)胞均表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性；當(dāng)測試濃度增至200 μg·mL-1時，根皮和莖的脂溶性成分對RAW264.7 和BV2 細(xì)胞均表現(xiàn)出較顯著的 細(xì)胞毒性（圖3）。

圖3 糙葉五加根皮和莖脂溶性成分對LPS刺激的RAW264.7和BV2細(xì)胞存活率的影響

NO 試驗(yàn)結(jié)果表明在測試濃度為50 μg·mL-1時，根皮和莖的脂溶性成分對RAW264.7 和BV2 細(xì)胞均表現(xiàn)出較好的NO 生成抑制活性，且根皮效果優(yōu)于莖；當(dāng)測試濃度為100 和200 μg·mL-1時，根皮和莖的脂溶性成分對RAW264.7 和BV2 細(xì)胞均表現(xiàn)出顯著的NO 生成抑制活性。研究結(jié)果表明，糙葉五加根皮和莖的脂溶性成分具有潛在的抗炎活性（圖4）。

圖4 糙葉五加根皮和莖脂溶性成分對LPS刺激的RAW264.7和BV2細(xì)胞NO抑制活性

4 討 論

天然倍半萜類化合物在醫(yī)藥行業(yè)有重要作用，其藥理活性豐富多樣，包括抗炎、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、保護(hù)胃腸道、保肝、抗菌和抗病毒、降血糖等活性［18-19］。糙葉五加根皮和莖脂溶性成分中含有豐富的倍半萜類化合物，該類成分可能是根皮和莖脂溶性成分表現(xiàn)出抗炎活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，比如根皮中的杜松烷型倍半萜具有多種重要的藥理活性，如抗炎、抗菌、降血糖、抗腫瘤等［19］，具有深度開發(fā)的價值。同時，其根皮脂溶性成分中含有較多的不飽和脂肪酸，具有重要的醫(yī)藥功效，如亞油酸乙酯具有降低膽固醇和血脂的作用，主要用作制藥原料，防治動脈粥樣硬化癥［20］。同時，有研究報道，亞油酸乙酯對HepG2細(xì)胞具有較明顯的保護(hù)作用，表明其具有潛在的護(hù)肝活性［21］。糙葉五加根皮中還發(fā)現(xiàn)了角鯊烯，它是一種無毒性的海洋生物活性物質(zhì)，是一種高度不飽和烯烴類化合物，具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶活性、抗腫瘤、抗衰老等多種功能［22］。研究表明，角鯊烯還有耐缺氧、促進(jìn)皮膚健康、用于化妝品的保濕劑和抗氧化劑及自由基清除劑的作用，另外，角鯊烯也可用作高級香皂的高脂劑、食品機(jī)械設(shè)備中的潤滑劑、殺蟲劑、衣物護(hù)理劑、鉛筆芯穩(wěn)定劑等［23］。綜上所述，糙葉五加是一種很有開發(fā)前景的傳統(tǒng)中藥。本研究豐富了糙葉五加脂溶性成分的研究內(nèi)容，并進(jìn)一步豐富了五加科五加屬植物的研究內(nèi)容，為對其進(jìn)行深入物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了參考依據(jù)，也為糙葉五加的質(zhì)量評價提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。