中藥保健食品原料肝毒性預(yù)測研究△

雷蕾，張廣平，楊樂，李晗，李小陽，葉祖光*，王晰

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700；

2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700

中藥保健食品是指以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)的，在天然食物中加入中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會（以下簡稱衛(wèi)健委）頒布的既是食品又是藥品的可食藥材，經(jīng)過適當(dāng)加工而成的具有某些調(diào)節(jié)人體生理功能、有益于健康的保健食品[1]。保健食品是一類適宜于特定人群食用，不以治療疾病為目的，并且一般認(rèn)為對人體不會產(chǎn)生急性、亞急性或者慢性危害，是具有調(diào)節(jié)機體功能的食品[2]。然而，中藥作為保健食品的原料比作為藥物的食用時間更長、受用人群更廣。若中藥保健食品中的原料有不安全因素，則對人類健康影響更大。近年來，有諸多中藥保健食品原料典型風(fēng)險物質(zhì)及其潛在毒性作用的報道，如三七含有三七總皂苷，具有肝毒性，三七總皂苷450 mg·kg-1組動物體質(zhì)量顯著下降，肝功能指標(biāo)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）顯著升高[3]；何首烏、決明子、番瀉葉和大黃等所含的蒽醌類成分具有肝腎毒性，大黃提取物的毒性劑量范圍10～12 g·kg-1，大黃總蒽醌的毒性劑量范圍在135～4500 mg·kg-1[4]；吳茱萸中的吳茱萸堿和吳茱萸次堿等都具有肝毒性，吳茱萸次堿使肝細(xì)胞上清液中的AST、堿性磷酸酶（ALP）和乳酸脫氫酶（LDH）水平均升高[5]。如何做到對中藥肝毒性的早期預(yù)測是亟待解決的問題。

使用計算機輔助新藥篩選方法（CADD）構(gòu)建定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）已經(jīng)應(yīng)用在中藥保健食品評價中[6]。QSAR 通過使用數(shù)學(xué)模型來描述分子結(jié)構(gòu)和分子的某種生物活性特別是毒性效應(yīng)之間的聯(lián)系，用來預(yù)測其他已知結(jié)構(gòu)化合物的潛在毒性，有效節(jié)省時間、資金和人力。然而，目前中藥肝毒性預(yù)測模型的準(zhǔn)確率普遍不高，葉立等[7]構(gòu)建了3 種樹形算法模型，內(nèi)部交叉驗證準(zhǔn)確率為78%～85%。He 等[8]建立了由1254個化合物組成的大規(guī)模多樣的DⅠLⅠ數(shù)據(jù)集，通過集成方法獲得最佳模型，準(zhǔn)確度（ACC）為78.3%。Zhao 等[9]基于已發(fā)表的數(shù)據(jù)和美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的肝毒性知識庫（LTKB）構(gòu)建了QSAR模型，準(zhǔn)確率為80.2%。

本研究充分考慮中藥分子的化學(xué)空間，將訓(xùn)練集先進行聚類分析，然后針對不同的聚類構(gòu)建中藥化學(xué)成分的肝毒性QSAR 預(yù)測模型，并對衛(wèi)健委公布的113 個中藥保健食品原料成分可能的肝毒性進行了預(yù)測，為中藥保健食品安全性評價提供參考，技術(shù)路線見圖1。

圖1 中藥保健食品原料肝毒性預(yù)測技術(shù)路線

1 材料

1.1 構(gòu)建訓(xùn)練集

本研究使用的肝毒性數(shù)據(jù)以He 等[8]發(fā)表的建立肝毒性預(yù)測模型的1254 個化合物數(shù)據(jù)集（該數(shù)據(jù)集收集了DⅠLⅠrank、LiverTox、LTKB 等14個肝毒模型訓(xùn)練集數(shù)據(jù)并使用機器學(xué)習(xí)的方法進行優(yōu)化）為基礎(chǔ)，增加了Zhao 等[9]用來建立和驗證肝毒性預(yù)測模型的31 個中藥成分。同時在中國知網(wǎng)、萬方和維普數(shù)據(jù)庫中以“中藥”“肝毒”為檢索詞檢索2010 年以來的文獻，收集了43 個中藥成分肝毒性數(shù)據(jù)。合并以上數(shù)據(jù)，刪除重復(fù)項以后，共得到1271 個化合物作為訓(xùn)練集，其中具有肝毒性的化合物653 個、無肝毒性的化合物618 個。從PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載分子2D 結(jié)構(gòu)，保存為.sdf格式文件。

1.2 構(gòu)建待預(yù)測中藥化學(xué)成分集

中藥保健食品原料目錄來自《衛(wèi)生部關(guān)于進一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2002〕51 號），共113 個中藥[10]。中藥化學(xué)成分庫來自中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）[11]、中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫（ETCM，http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/）[12]、中藥化學(xué)數(shù)據(jù)庫TCMD（https://www.neotrident.com/）[13]3個數(shù)據(jù)庫。采集113個中藥包含的化學(xué)成分，合并查重后得到3540個化合物。同樣從PubChem下載分子2D結(jié)構(gòu)，保存為.sdf格式文件。

2 方法

2.1 訓(xùn)練集分子聚類及性質(zhì)的主成分分析

使用Discovery Studio 4.5 中的Small Molecules-Property Calculation-Calculate Molecular Properties 計算了分子的ALogP、Molecular_Weight、Num_H_Donors、Num_H_Acceptors、Num_Rotatable Bonds、Num_ Rings、Num_Aromatic Rings、Molecular_Fractional Polar Surface Area 8 個性質(zhì)，使用Small Molecules-Cluster-Cluster Ligands 對1271 個化合物進行了聚類；使用Small Molecules-Analyze-Calculate Principal Component 進行了主成分分析，并使用Origin 2018進行了分類結(jié)果的可視化。如果沒有特殊說明，均采用系統(tǒng)默認(rèn)值。

2.2 描述符的篩選

本研究使用FDA 公布的Mold2 軟件[14]對每個化合物的2D 結(jié)構(gòu)計算777 個分子描述符。在建立QSAR 模型時，對描述符的挑選是非常重要的。使用Python按以下步驟進行篩選：1）去掉全零和零占比超過80%的數(shù)列；2）篩選出皮爾遜相關(guān)系數(shù)＞0.8 的數(shù)列，保留1 個數(shù)列；3）計算歐氏距離，取距離最大的前60 個；4）計算余弦相似度，取夾角最小的前60 個；5）將第3 步和第4 步篩選的數(shù)列取并集。

2.3 建立QSAR預(yù)測模型

在預(yù)測模型構(gòu)建階段，對于2.1項下聚類得到的每一類，均使用9 種算法，包括樸素貝葉斯（NB）、邏輯回歸（LR）、鄰近算法（KNN）、隨機森林（RF）、支持向量機（SVM）、交叉驗證的支持向量機（SVMCV）、梯度提升迭代決策樹（GBDT）、自適應(yīng)增強（AdaBoost）、布袋法（Bagging）分別構(gòu)建模型，并利用交叉驗證方法對模型構(gòu)建方法進行內(nèi)部評估，使用準(zhǔn)確率、精度和召回率評價模型。

2.4 對中藥保健品原料包含的化學(xué)成分進行預(yù)測

計算113 個中藥保健食品原料包含3540 個化學(xué)成分的ALogP、Molecular_Weight、Num_H_Donors、Num_H_Acceptors 等8 個分子性質(zhì)，然后根據(jù)這些性質(zhì)按公式（1）計算每個成分到聚類中心化合物的歐式距離（d）。根據(jù)距離遠近，判斷待預(yù)測的化合物屬于哪類，進而使用這個類對應(yīng)的QSAR 模型進行中藥成分的肝毒性預(yù)測。

式中x和y為每個化學(xué)成分性質(zhì)投映到到多維空間后的坐標(biāo)值。

3 結(jié)果

3.1 QSAR模型的構(gòu)建和評價

3.1.1模型訓(xùn)練集的主成分分析和聚類分析 對QSAR模型訓(xùn)練集的1271個化合物進行聚類分析，得到3個聚類，每一類的有毒成分?jǐn)?shù)量、無毒成分?jǐn)?shù)量、成分總數(shù)、聚類的中心化合物及結(jié)構(gòu)詳細(xì)信息見表1。對1271 個化合物進行主成分分析，結(jié)果得到4個主成分表達式（表2）。以PC1、PC2 和PC3 分別為坐標(biāo)軸來構(gòu)建化學(xué)空間，進一步可視化聚類結(jié)果（圖2）。第1 類和第3 類的化合物數(shù)量分別為1080、181 個，在化學(xué)空間中顯示聚類效果較好，可以用于下一步構(gòu)建QSAR 模型。第2 類化合物數(shù)量較少，在化學(xué)空間上也比較分散，不利于構(gòu)建模型。

圖2 肝毒性預(yù)測模型訓(xùn)練集化合物的聚類結(jié)果

表1 肝毒性預(yù)測模型訓(xùn)練集聚類分析詳細(xì)信息

表2 肝毒性預(yù)測模型訓(xùn)練集化學(xué)成分主成分分析

3.1.2第1 類訓(xùn)練集和第3 類訓(xùn)練集QSAR 模型的構(gòu)建和評價 使用Mold2 軟件分別對第1 類訓(xùn)練集（1080 個成分）和第3 類訓(xùn)練集（181 個成分）進行了分子描述符計算，然后根據(jù)2.2項下方法對描述符進行了初步篩選，分別得到170、106 個分子描述符。使用2.3項下方法分別構(gòu)建了2 個QSAR 模型，得到的模型準(zhǔn)確率、精確度和召回率見表3。從均值可以看出第3 類的QSAR 模型準(zhǔn)確率和精確度均高于第1類的QSAR模型。

表3 肝毒性預(yù)測模型第1類訓(xùn)練集和第3類訓(xùn)練集構(gòu)建的QSAR模型

3.2 對中藥保健食品原料成分的肝毒性預(yù)測

根據(jù)2.4項下方法，通過比較每個成分到類中心的歐式距離，將這些成分歸到了QSAR 模型第1類（2767 個化學(xué)成分）和第3 類（783 個化學(xué)成分）中。第3 類的QSAR 模型優(yōu)于第1 類的QSAR 模型，因此，對使用第3類QSAR 模型預(yù)測的783個成分的結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

為了更加合理地表達預(yù)測結(jié)果，本研究使用多模型加權(quán)預(yù)測方法，按公式（2）計算加權(quán)平均概率。

在783 個成分中，肝毒性加權(quán)平均概率排列前5位的化合物見表4，中藥保健食品原料成分肝毒性預(yù)測加權(quán)平均概率分布見圖3。

圖3 中藥保健食品原料成分肝毒性預(yù)測加權(quán)平均概率分布

表4 中藥保健食品原料中的肝毒性加權(quán)平均概率排列前5位的化合物

預(yù)測結(jié)果中有肝毒性成分比例較大的10 個中藥和預(yù)測無肝毒性成分比例較大的10 個中藥見圖4。可以看到茜草包含了14 個預(yù)測有肝毒性的成分和7個預(yù)測無肝毒性的成分。

圖4 部分中藥成分的肝毒性預(yù)測統(tǒng)計結(jié)果

3.3 文獻驗證

為了進一步驗證QSAR 模型的準(zhǔn)確率，采用文獻驗證的方法，即從預(yù)測的結(jié)果中找出目前有文獻報道的結(jié)果進行比較，得出一致結(jié)果的比例。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在預(yù)測的783 個化合物中，有文獻報道毒理性質(zhì)的很少。經(jīng)過逐一檢索，具有肝保護作用的成分有10個，包括白芍苷[15]、人參皂苷人參皂苷Rb2[17]、野漆樹苷[18]、連翹酯苷[19]、山茱萸新苷[20]、絞股藍皂苷[21]、木犀草素[22]、芍藥苷[23]、芒柄花苷[24]，表明這些成分均無肝毒性，與預(yù)測結(jié)果一致。本研究預(yù)測阿魏酸的肝毒性概率0.566 9，為有肝毒，與實驗結(jié)果相反[25]。

在113 種中藥中，肝毒性所占比例較高的中藥有茜草、番瀉葉、當(dāng)歸、大黃、丹參、厚樸、川芎、桑枝、桑白皮、五味子等，其中實驗已經(jīng)證實具有肝毒性的有5 味藥，包括番瀉葉可引起胃腸、肝膽、神經(jīng)、泌尿等多系統(tǒng)損害，其中肝膽系統(tǒng)損害以黃疸為主，臨床表現(xiàn)為頭昏不適、發(fā)熱、尿黃等癥狀[26]，大黃中的大黃蒽醌具有潛在的肝腎毒性和致癌性[4]。茜草的70%乙醇提取物長期給藥劑量≥5 g·kg-1時具有輕微的肝、腎毒性[27]。當(dāng)歸提取物對正常小鼠無明顯急性肝毒性，但不同濃度劑量的提取液可能引起肝功能異常，在一定范圍內(nèi)呈劑量正相關(guān)[28]。厚樸葉、厚樸皮和厚樸花對大鼠的食物利用率、腎功能都有所影響，也影響肝、卵巢、睪丸的臟體系數(shù)[29]。

4 結(jié)論與討論

肝毒性是指藥物在肝臟代謝時，藥物本身或其代謝產(chǎn)物對肝臟造成的損害。在藥物開發(fā)和使用過程中，藥物肝毒性往往是導(dǎo)致新藥研發(fā)失敗或者撤市的主要原因之一。中藥在我國臨床上已經(jīng)使用了幾千年，隨著中藥現(xiàn)代化的發(fā)展，中藥不良反應(yīng)逐漸被人們重視。對中藥肝毒性的預(yù)測將會成為輔助以中藥為原料的保健食品毒性評價的一個重要途徑。QSAR 是化藥新藥研發(fā)階段的毒性預(yù)測的常用方法之一，其可以在沒有實驗信息的情況下，利用已知毒性的化合物，對未知化合物進行初步預(yù)測。然而，目前構(gòu)建QSAR 模型來預(yù)測中藥肝毒性的例子不多[4,9]，同時由于中藥化合物與化藥分子結(jié)構(gòu)的差異，基于化藥結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的預(yù)測模型預(yù)測中藥準(zhǔn)確率也不高。

本研究考慮到QSAR 主要基于分子結(jié)構(gòu)和分子特性與毒性效應(yīng)之間的聯(lián)系來建立機器學(xué)習(xí)模型，因此首先在訓(xùn)練集的化學(xué)空間上做了聚類分析，使得每一類的內(nèi)部化合物化學(xué)空間性質(zhì)比較相似，類之間的化合物化學(xué)空間性質(zhì)差異較大，然后對每一個類分別建模，可以提高模型準(zhǔn)確率。通過研究發(fā)現(xiàn)，本研究將訓(xùn)練集在化學(xué)空間上分為3類，第3類模型的準(zhǔn)確率為85%～91%，相比之前的報道有大幅度的提高。

在模型構(gòu)建上為了使預(yù)測的結(jié)果更加合理，本研究還提出了多模型加權(quán)預(yù)測方法，充分考慮到機器學(xué)習(xí)模型預(yù)測的概率性，綜合考慮多個模型的準(zhǔn)確率和預(yù)測概率，加權(quán)平均后得到總體值。最后，本研究對113種中藥保健食品原料的成分計算到第1類中心和第3類中心的歐式距離，選擇與第3類中心較近的783 個化學(xué)成分進行預(yù)測，根據(jù)加權(quán)平均概率最終預(yù)測得到肝毒性化合物48 個，不具有肝毒性的化合物735 個，肝毒性預(yù)測概率為0.15～0.30。為進一步驗證預(yù)測結(jié)果，筆者進行了相關(guān)文獻調(diào)查。文獻數(shù)據(jù)設(shè)計中藥成分共有10 個，其肝毒性均與預(yù)測結(jié)果一致。

綜上所述，本研究在傳統(tǒng)的QSAR 建模方法上進行了2 點改進，其一是對訓(xùn)練集化合物進行了聚類分析，然后對每一類分別使用NB、LR、KNN 等9種機器學(xué)習(xí)的方法構(gòu)建QSAR模型，并利用交叉驗證方法對模型構(gòu)建方法進行評估，得到了準(zhǔn)確率為85%～91%的最優(yōu)模型。其二是建立多模型加權(quán)預(yù)測方法，并預(yù)測了113 種中藥保健食品原料包含的783個化學(xué)成分的肝毒性，丹參、川芎、桑枝、桑白皮、五味子等預(yù)測肝毒性成分比重較高，有待進一步驗證。