維生素E對(duì)大劑量藍(lán)光誘導(dǎo)損傷視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的影響

王珊珊，李泳寧，張?jiān)路?，陳鴻嬌，張文賢

0引言

人視網(wǎng)膜色素上皮(human retinal pigment epithelial, hRPE)細(xì)胞在物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)儲(chǔ)存、吞噬降解、合成細(xì)胞因子、構(gòu)成血-視網(wǎng)膜屏障等功能上起著關(guān)鍵作用[1]。隨著新型光照，如浴霸、高功率LED屏、眼科診療儀器等的出現(xiàn)，人眼接觸大劑量的藍(lán)光機(jī)會(huì)日益增多。相較于可見(jiàn)光，藍(lán)光對(duì)視網(wǎng)膜的損傷更嚴(yán)重[2]，波長(zhǎng)在400～499nm的藍(lán)光可通過(guò)眼屈光間質(zhì)直達(dá)視網(wǎng)膜[3-4]，誘導(dǎo)hRPE細(xì)胞引起氧化反應(yīng)，從而使視網(wǎng)膜發(fā)生退行性變疾病[5-8]。預(yù)防或減少藍(lán)光損傷，已成為保護(hù)hRPE細(xì)胞的新課題[9-11]，維生素E具有超強(qiáng)的抗氧化性，且在自然食物中廣泛存在，價(jià)格低廉，易于獲得。為此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察天然抗氧化劑維生素E(Vitamin E， Vit E)對(duì)大劑量藍(lán)光誘導(dǎo)損傷hRPE細(xì)胞的影響，為尋找減少hRPE細(xì)胞的大劑量藍(lán)光損傷的預(yù)后方案提供思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞D407 hRPE細(xì)胞(由福建醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng))。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑DMEM/F-12培養(yǎng)液、小牛血清和不含EDTA的胰酶(美國(guó)HyClone公司)；活性氧檢測(cè)試劑盒(北京Solarbio公司)；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基公司)；Hoechst染色試劑盒(上海碧云天公司)；Vit E標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物公司)。

1.1.3主要儀器藍(lán)光光源(主波峰451nm、色純度0.982，南京圖特光電科技公司)；數(shù)字式照度儀(GM1040，深圳聚茂源公司)、流式細(xì)胞儀(FACScalibur，美國(guó)BD公司)，熒光倒置顯微鏡(Leica DMIL，德國(guó)徠卡公司)，CO2培養(yǎng)箱(HERA cell150i，德國(guó)賀力氏公司)。

人本理念是思政工作的一種價(jià)值取向，這種理念的核心在于以學(xué)生為本，以滿足學(xué)生的需求為工作目標(biāo)，這種理念會(huì)在價(jià)值導(dǎo)向和價(jià)值判斷上給高校思政教育工作以影響。

1.2方法

1.2.1藍(lán)光損傷模型的建立參考已有的[8,12]藍(lán)光損傷建模方式，把P4～P5代hRPE細(xì)胞放在加入體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，并置于體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、溫度為37℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將主波峰451nm、色純度0.982的藍(lán)光燈安裝在恒溫培養(yǎng)箱的正上方，借助數(shù)字式照度儀的監(jiān)測(cè)，調(diào)整藍(lán)光燈高度，使hRPE細(xì)胞培養(yǎng)水平面的照射強(qiáng)度維持在3000±150Lx，照射時(shí)長(zhǎng)分別為3、6、9、12、24h。

1.2.2VitE添加濃度的確定Vit E添加濃度分為低、中、高三種濃度梯度。因成人血漿的Vit E正常濃度為11.6～46.4μmo/L[13]，故低濃度設(shè)為10μmol/L，以考察體內(nèi)正常水平的Vit E對(duì)藍(lán)光損傷hRPE細(xì)胞的影響；中國(guó)居民可耐受Vit E最高攝入量的800mg α-TE/d，按40%吸收[14]計(jì)算，血漿Vit E濃度為165μmol/L，故高濃度設(shè)為100μmol/L，以考察體內(nèi)的Vit E濃度達(dá)到毒性作用[15]之前，體內(nèi)Vit E對(duì)藍(lán)光損傷hRPE細(xì)胞的影響；中濃度則取二者的中間值附近，為50μmol/L。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組取P4～P5代hRPE細(xì)胞接種在六孔板，培養(yǎng)到細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～70%時(shí)，棄掉培養(yǎng)板中的舊液，加入無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。培養(yǎng)后分為12組。前6組用于比較不同時(shí)長(zhǎng)藍(lán)光照射的損傷差異，分別照射3000±150Lx的藍(lán)光0、3、6、9、12、24h，然后再培養(yǎng)24h；后6組用于比較在照射前后加入不同濃度Vit E保護(hù)效果的差異，其中3組添加Vit E后照射6h，3組在照射6h后添加Vit E，添加Vit E 濃度均分別為10、50、100μmol/L，然后再培養(yǎng)24h。前6組中的藍(lán)光照射0、6h組同時(shí)視為后6組中照射前、后添加組的空白對(duì)照。

1.2.4評(píng)價(jià)指標(biāo)凋亡是細(xì)胞對(duì)環(huán)境的生理性病理性刺激信號(hào)，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化的死亡過(guò)程。Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用雙重染色的方法，可以有效地區(qū)別凋亡早期細(xì)胞與壞死細(xì)胞和凋亡晚期的細(xì)胞，并借助流式細(xì)胞儀直接觀察[16]?；钚匝跏巧顒?dòng)中不可缺少的活性物質(zhì)，同時(shí)參與多種病理機(jī)制，有明確的病理意義，檢測(cè)細(xì)胞活性氧含量，可以了解活性氧在細(xì)胞一些生理和病理狀態(tài)中的變化，分析藥物效應(yīng)和相關(guān)機(jī)制[17]。因此，本實(shí)驗(yàn)基于hRPE細(xì)胞藍(lán)光損傷模型，檢測(cè)不同照射時(shí)長(zhǎng)、Vit E不同添加濃度與不同添加時(shí)機(jī)作用下，hRPE細(xì)胞的凋亡情況和活性氧含量，從而評(píng)價(jià)Vit E對(duì)hRPE細(xì)胞藍(lán)光損傷的防護(hù)作用。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)流式細(xì)胞儀檢測(cè)存活細(xì)胞以及早、晚期凋亡細(xì)胞的發(fā)生率，從細(xì)胞水平上反映損傷效應(yīng)；檢測(cè)活性氧相對(duì)量，則從代謝水平上反映損傷效應(yīng)。取12組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，均按說(shuō)明書加進(jìn)行染料標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)hRPE細(xì)胞存活細(xì)胞以及早、晚期凋亡細(xì)胞的發(fā)生率；同時(shí)按說(shuō)明書加DCFH-DA熒光探針，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)hRPE細(xì)胞的活性氧相對(duì)量。

1.2.6熒光顯微鏡觀察熒光顯微鏡觀察，檢測(cè)的是細(xì)胞核，是細(xì)胞凋亡的觀察指標(biāo)之一。取后6組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、未照射組和照射6h組，按說(shuō)明書加Hoechst 33258染色試劑，并在熒光顯微鏡下觀察hRPE細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

2結(jié)果

2.1藍(lán)光損傷效應(yīng)代謝變化先于細(xì)胞形態(tài)變化用流式細(xì)胞儀檢測(cè)同等強(qiáng)度的藍(lán)光照射hRPE細(xì)胞0、3、6、9、12、24h組的活性氧相對(duì)量以及hRPE細(xì)胞凋亡率?；钚匝跸鄬?duì)量和hRPE細(xì)胞凋亡率的總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7019.48、2778.09，均P<0.01)。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)藍(lán)光照射3、6、9、12、24h組的細(xì)胞活性氧相對(duì)量明顯高于藍(lán)光照射0h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；照射6、9、12、24h組的細(xì)胞凋亡率明顯高于藍(lán)光照射0h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，而照射3h組的細(xì)胞凋亡率相對(duì)于藍(lán)光照射0h組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.46)，見(jiàn)表1。說(shuō)明hRPE細(xì)胞受到藍(lán)光損傷后，細(xì)胞的活性氧相對(duì)量增多的現(xiàn)象要早于細(xì)胞凋亡，即代謝變化先于細(xì)胞形態(tài)變化。

表1 不同時(shí)長(zhǎng)藍(lán)光照射對(duì)hRPE細(xì)胞的損傷

表2 不同濃度Vit E對(duì)hRPE細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)

2.3照射前后添加VitE的保護(hù)效應(yīng)比較同一濃度的Vit E，除10μmol/L Vit E組在照射前或后的hRPE細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.34，P=0.08)外，其他各組的照射前加入Vit E組的細(xì)胞凋亡率均比照射后加入Vit E組的高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.55、16.28，均P<0.01)；而各組的照射前加入Vit E組的細(xì)胞活性氧相對(duì)量均比照射后加入Vit E組的高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.38、45.45、7.80，均P<0.01)。說(shuō)明hRPE細(xì)胞藍(lán)光損傷后的事后用藥比損傷前的預(yù)防性用藥的保護(hù)效果更好，但需要達(dá)到一定濃度才能顯效。

2.4熒光檢測(cè)與流式細(xì)胞儀檢測(cè)等效顯微鏡下觀察熒光和流式細(xì)胞儀檢測(cè)hRPE細(xì)胞凋亡情況，見(jiàn)圖1、2。照射6h后加Vit E組，熒光強(qiáng)度隨添加Vit E濃度的增加而增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞的比例隨添加Vit E濃度的增加而減少。

圖2 藍(lán)光照射后加入不同濃度Vit E對(duì)hRPE細(xì)胞凋亡率的影響 A：未照射未加Vit E組(完全空白組)；B：照射6h組未加Vit E組(照射空白組)；C：照射6h后加10μmol/L Vit E組；D：照射6h后加50μmol/L Vit E組；E：照射6h后加100μmol/L Vit E組。左上:死亡細(xì)胞，左下:正?；罴?xì)胞，右上:晚期凋亡細(xì)胞，右下:早期凋亡細(xì)胞。

3討論

目前，關(guān)于藍(lán)光引起hRPE細(xì)胞損傷越來(lái)越引起人們的關(guān)注，國(guó)內(nèi)外關(guān)于如何避免藍(lán)光損傷hRPE細(xì)胞的方法，可分為一級(jí)預(yù)防和二級(jí)預(yù)防兩類。一級(jí)預(yù)防是采用眼鏡或人工晶狀體遮擋藍(lán)光的手段，避免藍(lán)光損傷hRPE細(xì)胞。但藍(lán)光對(duì)人體不僅有弊，也有利，研究表明，藍(lán)光參與抑制近視，參與夜晝節(jié)律調(diào)節(jié)[18]。因此，單純地遮擋藍(lán)光可能不是最理想的防損傷方法。二級(jí)預(yù)防是通過(guò)使用保護(hù)劑，修復(fù)被藍(lán)光損傷的hRPE細(xì)胞，已報(bào)道的有槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷[19]、龍葵提取物[20]等，但作為最常見(jiàn)、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的天然抗氧化劑，Vit E對(duì)藍(lán)光損傷hRPE細(xì)胞的作用效果未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。由于臨床療效受到用藥劑量與用藥時(shí)機(jī)的影響，故此本研究試圖從這兩個(gè)方面進(jìn)行研究。

我們觀察到藍(lán)光誘導(dǎo)hRPE細(xì)胞的損傷呈現(xiàn)時(shí)間依賴，與蔡善君等[12]研究結(jié)果一致。我們還發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)hRPE細(xì)胞接受藍(lán)光照射，hRPE細(xì)胞出現(xiàn)胞內(nèi)活性氧相對(duì)量增多的現(xiàn)象早于細(xì)胞凋亡，而且hRPE細(xì)胞隨著活性氧相對(duì)量增多，逐漸從早期凋亡為主向晚期凋亡為主，由此推測(cè)活性氧增多是hRPE細(xì)胞受到藍(lán)光損傷細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要環(huán)節(jié)之一。這可能是因?yàn)閔RPE細(xì)胞富含多不飽和脂肪酸,在受到能量較高的短波長(zhǎng)光照時(shí),容易激發(fā)電離,引起氧化連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，活性氧作為信號(hào)受體激活了凋亡信號(hào)通路，損傷線粒體及細(xì)胞色素氧化酶，抑制線粒體呼吸鏈，最后導(dǎo)致細(xì)胞損傷，甚至凋亡[21-22]。因此，清除細(xì)胞活性氧，可成為減少大劑量藍(lán)光誘導(dǎo)hRPE細(xì)胞損傷及凋亡的思路。

Vit E是天然抗氧化劑，其苯環(huán)上的活性基團(tuán)酚羥基，能釋放羥基上的氫，可競(jìng)爭(zhēng)性與細(xì)胞內(nèi)的活性氧結(jié)合[23],本研究利用Vit E的抗氧化特性，清除hRPE細(xì)胞活性氧，保護(hù)其他物質(zhì)不被氧化，減少由hRPE細(xì)胞由藍(lán)光引起的損傷和凋亡。我們觀察到同一劑量Vit E對(duì)3000Lx藍(lán)光照射6h的hRPE細(xì)胞，在照射后給藥比照射前給藥的保護(hù)效果更好，可能是由于Vit E在照射過(guò)程中受藍(lán)光照射加速分解、濃度下降而導(dǎo)致的[24]。我們還觀察到Vit E的保護(hù)作用隨著Vit E濃度的增加而增強(qiáng)，但低濃度Vit E的防護(hù)效果不佳，需要達(dá)到一定濃度才有保護(hù)效果，而且損傷無(wú)法完全修復(fù)。

綜上所述，活性氧增多是hRPE細(xì)胞受到藍(lán)光損傷細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要環(huán)節(jié)之一，Vit E可能通過(guò)清除細(xì)胞活性氧以減少大劑量藍(lán)光誘導(dǎo)hRPE細(xì)胞損傷及凋亡，進(jìn)而促進(jìn)hRPE細(xì)胞的恢復(fù)。這種保護(hù)效應(yīng)可隨Vit E濃度升高而加強(qiáng)。當(dāng)受到大劑量藍(lán)光照射，為減少hRPE細(xì)胞的損傷和凋亡，可適當(dāng)補(bǔ)充Vit E。由于照射后用藥比照射前用藥好，故在可能遭受藍(lán)光損傷時(shí)，不必事前預(yù)防性補(bǔ)充，事后補(bǔ)充效果更好，也不至于因此濫用藥物。至于Vit E的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的探討。