M2型丙酮酸激酶在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用

田雅靜，曹 鑫，段程偉，王曉樂，華玲艷，宋 愈

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是一種與持續(xù)高血糖相關(guān)的慢性、進(jìn)行性、潛在危害視力的高度特異性的視網(wǎng)膜微血管疾病，主要病理改變包括視網(wǎng)膜炎癥、視網(wǎng)膜微血管病變及增殖期新生血管的形成[1-2]。有氧糖酵解是腫瘤細(xì)胞重要特征之一，指即使在氧氣充足的條件下,細(xì)胞仍可以通過糖酵解產(chǎn)生能量，也稱為Warburg效應(yīng)[3]，不僅可以迅速為機(jī)體提供能量，還可以產(chǎn)生大量的中間產(chǎn)物促使生物合成。最近的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞多數(shù)通過糖酵解產(chǎn)生的ATP來維持其功能[4]。M2型丙酮酸激酶(M2 isoform of pyruvate kinase，PKM2)作為糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，通過糖酵解作用調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能，亦可轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，作為蛋白激酶發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控等非糖酵解作用[5]，進(jìn)一步在DR等多種炎癥性疾病中發(fā)揮作用。

1 PKM2簡(jiǎn)介

丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)作為糖酵解過程中的最后一個(gè)限速酶，將磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvic acid，PEP)轉(zhuǎn)化為丙酮酸并產(chǎn)生ATP，在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝中起著關(guān)鍵作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，PKR和PKM兩種基因編碼PK的四種亞型，由于基因的選擇性剪切，不同亞型的表達(dá)和分布可反映其組織特異性[7]。PKR基因編碼的PKL和PKR亞型分別在肝臟和紅細(xì)胞中表達(dá)；PKM基因在其他多數(shù)組織中都有表達(dá)，可選擇性剪切形成PKM1(包含9外顯子)或PKM2(包含10外顯子)亞型。M1型丙酮酸激酶(M1 isoform of pyruvate kinase, PKM1)主要表達(dá)于骨骼肌、大腦和心臟;PKM2主要表達(dá)在增殖細(xì)胞,如胚胎細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等[7-8]，近幾年研究表明，PKM2在內(nèi)皮細(xì)胞等非增殖細(xì)胞中也有表達(dá)。PKM1只有穩(wěn)定的四聚體形式，發(fā)揮經(jīng)典的PK活性；而PKM2則以單體、二聚體和四聚體等不同形式存在[9]，從而發(fā)揮不同的功能。PKM2的活性可以通過穩(wěn)定或破壞四聚體的構(gòu)型來控制，其四聚體的形式受多種修飾調(diào)節(jié)，如磷酸化、氧化及去乙?；?，還受其上游的糖酵解中間體——果糖1-6-二磷酸(fructose-1-6-diphosphate，F(xiàn)BP)的變構(gòu)激活[10]。與FBP結(jié)合形成的四聚體構(gòu)型，僅限于胞漿，發(fā)揮經(jīng)典的PK活性，促進(jìn)糖酵解通量，限制有氧糖酵解，促進(jìn)氧化磷酸化[10]。PKM2經(jīng)過翻譯后修飾，以對(duì)底物親和力低的二聚體形式存在，具有低PK活性，可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，發(fā)揮蛋白激酶活性，不僅可以促進(jìn)有氧糖酵解，導(dǎo)致糖酵解中間體的積累，有助于合成代謝所需的生物大分子[10-12]，還可以調(diào)控炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展及細(xì)胞增殖等[13]；此外，非糖酵解代謝物、氨基酸和小分子化合物等其他的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子也影響PKM2的活性。其中小分子DASA-58和TEPP-46作為PKM2的高度特異性激活劑，主要是通過穩(wěn)定四聚體構(gòu)型，使PKM2的動(dòng)力學(xué)參數(shù)幾乎與PKM1相同,作為催化糖酵解最后一步的限速酶，為三羧酸循環(huán)提供丙酮酸，該過程可以逆轉(zhuǎn)PKM2第105位酪氨酸位點(diǎn)(Y105)磷酸化的效應(yīng)[11]。在沒有變構(gòu)激活劑的情況下，PKM2主要以二聚體或單體形式存在，由于缺乏酶活性，會(huì)導(dǎo)致糖酵解中間體的積累，從而利于被激活或增殖細(xì)胞合成需要[11,14]。

PKM2具有糖酵解和非糖酵解功能:一方面，它可以通過其糖酵解功能為增殖細(xì)胞優(yōu)化能量供應(yīng)和促進(jìn)底物的合成，糖酵解增多引起的局部酸性微環(huán)境促進(jìn)血管生成；另一方面，在表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)或白細(xì)胞介素-3(interleukin-3，IL-3)等上游因素的刺激下，PKM2會(huì)發(fā)生二聚化并轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，作為組蛋白激酶或轉(zhuǎn)錄輔激活因子發(fā)揮非代謝作用[15]。在腫瘤的相關(guān)研究中表明，PKM2可通過直接結(jié)合并磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transduction and transcriptional activators，STAT3)，增強(qiáng)其與受調(diào)控基因的啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞周期的進(jìn)展[11]。PKM2作為磷酸酪氨酸結(jié)合蛋白，受到低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的調(diào)控，同時(shí)，核內(nèi)PKM2可以直接與HIF-1α的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域結(jié)合[16]，形成一個(gè)PKM2/HIF-1a正反饋回路，從而在核PKM2誘導(dǎo)的細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞糖酵解通量中起重要作用。PKM2可以在JMJD5的調(diào)控作用下進(jìn)一步促進(jìn)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性，增強(qiáng)HIF-1α下游的基因轉(zhuǎn)錄，包括乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase, LDHA)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporter 1, GLUT1)，促進(jìn)有氧糖酵解，以及促進(jìn)炎癥相關(guān)因子如白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β)的表達(dá)[17]。此外，核內(nèi)PKM2還可以通過激活β-連環(huán)蛋白參與糖酵解相關(guān)酶的調(diào)控，促進(jìn)Warburg效應(yīng)[18],或者通過參與組蛋白H3的乙酰化調(diào)控某些特定基因的表達(dá)[19]。近年來，PKM2在DR等炎癥性疾病的作用引起了廣泛的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，PKM2在氧化應(yīng)激作用下會(huì)發(fā)生二聚化并轉(zhuǎn)移進(jìn)入線粒體中，通過穩(wěn)定Bcl2調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20]。在DR中，與高血糖誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥和損傷密切相關(guān)的膜蛋白——STEAP4(six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 4)，可以通過抑制HIF-1α/PKM2信號(hào)通路，減少高血糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和凋亡[21]。在腎臟疾病的研究中，二聚體形式的PKM2通過核移位誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)和有氧糖酵解，從而參與腎臟纖維化[22]。高糖條件下誘導(dǎo)HUVECs的體外模型表明，PKM2可以二聚并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，通過STAT3和NF-κB信號(hào)通路進(jìn)一步調(diào)節(jié)ICAM-1的表達(dá)水平，從而參與2型糖尿病腎病的炎癥調(diào)控[23]。HIF-1α作為血管生成和糖酵解的重要環(huán)節(jié)之一，在缺氧的胰腺腫瘤中，PKM2可以移位到細(xì)胞核通過HIF-1α和NF-κB共同調(diào)節(jié)VEGFA的轉(zhuǎn)錄和分泌，從而參與血管生成[24]。此外，Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)FOXM1D(Fork head box M1)作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可以與PKM2、importin4、NF-κB和VPS11等多種蛋白相互作用，它通過與PKM2組裝異位聚合體來促進(jìn)有氧糖酵解，通過增加VEGF的表達(dá)和釋放來促進(jìn)血管生成。因此，PKM2的二聚體形式可通過核移位與重要的轉(zhuǎn)錄因子如STAT3、HIF-1α、Erk1/2及Bcl-2相互作用，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及血管生成[11]，在炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。

2 DR簡(jiǎn)介

DR是糖尿病最常見的一種高度特異性并發(fā)癥，是由持續(xù)高血糖引起的伴有血管病變的代謝性疾病[26-29]。DR在全球糖尿病患者中的發(fā)病率約為1/3，其中約1/10的患者表現(xiàn)為威脅視力的糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)或增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)[29]。視網(wǎng)膜微血管病變是DR的基本病理過程[30]，視網(wǎng)膜血管基底膜增厚是DR的一個(gè)組織學(xué)特征[31]，血視網(wǎng)膜屏障(blood retinal barrier，BRB)的破壞，包括緊密連接的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的視網(wǎng)膜內(nèi)屏障，及由視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)組成的視網(wǎng)膜外屏障，也作為其病理變化之一[32]。DR的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及到炎癥、免疫激活及氧化應(yīng)激，包括晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的增加、過氧化物產(chǎn)物的升高、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和蛋白激酶C的激活、白介素的升高等[33]。近來研究表明，基因、環(huán)境及表觀遺傳學(xué)也在其中發(fā)揮重要作用。大量研究表明，糖尿病的持續(xù)時(shí)間和高血糖的嚴(yán)重程度在DR中起著重要作用[34]。持續(xù)高血糖引起視網(wǎng)膜缺血缺氧，導(dǎo)致HIF-1α表達(dá)增加，可進(jìn)一步增加VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)DR的新生血管形成[34-36]。在之前的體內(nèi)體外研究表明，DR不僅具有血管生成疾病的許多特征，而且具有低級(jí)別炎癥性疾病的許多特征[37]。糖尿病引起的視網(wǎng)膜損傷與持續(xù)高血糖介導(dǎo)的慢性低級(jí)別炎癥狀態(tài)，會(huì)引起視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞的選擇性丟失，周細(xì)胞(perithelial cells，PCs)作為BRB的重要組成部分，維持內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接[38]，PCs的丟失或功能障礙會(huì)相應(yīng)地伴隨著毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的喪失[39]，導(dǎo)致血視網(wǎng)膜屏障破壞及滲透性增加，引起血管功能障礙[40]。高血糖條件下的代謝異常，會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增加，進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB和HIF-1α的活化，此外，炎性細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子活性的增加亦可導(dǎo)致毛細(xì)血管閉塞和微血管滲漏引起視網(wǎng)膜缺血，從而加重糖尿病引起的黃斑水腫和新生血管形成[41]。越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)皮細(xì)胞代謝障礙在DR等眼部新生血管性疾病中起著重要的作用[42]。糖酵解是內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成的驅(qū)動(dòng)力，同時(shí)是維持視網(wǎng)膜進(jìn)行光轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)傳遞的重要能量來源[43]，PKM2作為糖酵解的關(guān)鍵調(diào)控因子，在維持細(xì)胞的功能及炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用，因此我們推測(cè)PKM2可能參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展過程。

3 PKM2與DR

3.1PKM2通過內(nèi)皮細(xì)胞參與DR的進(jìn)展

3.1.1PKM2在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)位于血管和血管壁的交界面，作為血管的組成部分，在控制血管的張力和內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[44]。一方面，大多數(shù)ECs基本上是靜止的，分布在血管壁上，為溶質(zhì)提供屏障，維持血流內(nèi)穩(wěn)態(tài)[8]。靜止的ECs與癌細(xì)胞明顯不同:它們退出細(xì)胞周期，進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)，并受到接觸抑制，通過形成緊密連接來發(fā)揮屏障作用[8]。另一方面，ECs可以通過生理刺激或創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤等病理刺激被激活，迅速增殖，侵入缺氧和缺血組織，參與血管重建，這一過程被稱為血管生成[8]。ECs通過增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)的形成在血管生成過程中起中心作用[4,16]。最近的研究表明，ECs具有高糖酵解率，在生理狀態(tài)下，這些細(xì)胞在無氧條件下代謝近90%的葡萄糖以產(chǎn)生乳酸[4,45]。PKM2作為糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠和人類的增殖細(xì)胞和靜止細(xì)胞以及大血管和微血管系統(tǒng)中，PKM2都是PK的主要異構(gòu)體[8]，即使是靜止的ECs也主要表達(dá)PKM2而不是PKM1[8]，以維持血管完整性和內(nèi)皮生長(zhǎng)[44]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，ECs像腫瘤細(xì)胞一樣，通過糖酵解消耗大量的葡萄糖，即使有氧氣存在，也會(huì)通過糖酵解產(chǎn)生能量，這種現(xiàn)象在腫瘤生物學(xué)中被稱為有氧糖酵解或Warburg效應(yīng)[46]，其主要表現(xiàn)為葡萄糖攝取和乳酸生成增加，它既提供細(xì)胞功能所需的ATP，也提供中間代謝物，為其他生物大分子合成提供營(yíng)養(yǎng)[47]。PKM2作為有氧糖酵解的關(guān)鍵調(diào)控因子之一[48]，與PKM1相比，具有更高的有氧糖酵解率。研究人員[49]通過對(duì)H1299細(xì)胞穩(wěn)定沉默PKM2，發(fā)現(xiàn)PKM2是有氧糖酵解和癌細(xì)胞增殖所必需的。既往大多致力于PKM2在腫瘤細(xì)胞中的研究，近年來PKM2在ECs中的作用也得到了廣泛的關(guān)注。PKM2是ECs糖酵解所必需的，PKM2表達(dá)降低的ECs，糖酵解受損，siPKM2顯著抑制ECs的糖酵解通量[8]。研究者[50]在淋巴管畸形的相關(guān)研究中，采用紫草素及通過shRNA-PKM2轉(zhuǎn)染抑制人真皮淋巴內(nèi)皮細(xì)胞(human dermal lymphatic endothelial cells, HDLECs)中PKM2表達(dá)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)糖酵解相關(guān)指標(biāo)均下調(diào)，進(jìn)一步分析表明過表達(dá)PKM2促進(jìn)HDLECs的增殖、遷移和管的形成，從而表明PKM2可能通過糖酵解在淋巴管畸形中發(fā)揮重要作用。盡管大量的證據(jù)表明PKM2介導(dǎo)的糖酵解與快速增殖疾病密切相關(guān)，比如腫瘤，ECs通過增殖、遷移和管的形成參與血管生成，如前所述，HDLECs中的PKM2通過參與淋巴管生成在淋巴管畸形中發(fā)揮重要作用，但PKM2是否通過ECs參與DR等炎癥性疾病的血管生成，其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。

3.1.2PKM2參與ECs的緊密連接ECs功能障礙在DR的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，靜止的ECs可通過分泌基底膜，招募PCs，促進(jìn)鈣黏素(VE-cadherin)的表達(dá)上調(diào)形成緊密連接，維持血管屏障功能。VE-cadherin位于內(nèi)皮細(xì)胞連接處，是ECs間連接形成和穩(wěn)定的主要調(diào)控因子，PKM2活性及其介導(dǎo)的局部ATP的產(chǎn)生調(diào)節(jié)鈣黏素的動(dòng)態(tài)和內(nèi)化，從而參與血管屏障功能的維持，PKM2沉默破壞連接的穩(wěn)定性，導(dǎo)致緊密連接和屏障功能的退化[4]。Kim等[8]通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明，在融合接觸抑制的內(nèi)皮細(xì)胞中，PKM2是血管屏障功能所必需的，進(jìn)一步表明PKM2通過抑制NF-κB和ANGPT2的表達(dá)來維持血管屏障功能，這一作用獨(dú)立于PK活性。MMP-1是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)的家族成員之一，作為加速糖尿病血管疾病進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素，可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能。唐磊等[19]通過體外培養(yǎng)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVECs)，采用PKM2激活劑TEPP-46處理細(xì)胞，表明PKM2具有調(diào)節(jié)MMP-1表達(dá)的作用，進(jìn)一步證明高糖通過上調(diào)mTORC2的表達(dá)，促進(jìn)PKM2磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)其二聚化并且核轉(zhuǎn)位來調(diào)控MMP-1的表達(dá)，參與ECs血管屏障損害。PKM2對(duì)于ECs介導(dǎo)的血管屏障的維持是必不可少的，因此我們推測(cè)PKM2可能通過參與視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮間的緊密連接，在DR的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

3.1.3PKM2參與ECs的增殖和遷移PDR最核心的表現(xiàn)為視網(wǎng)膜新生血管的形成。新生血管的萌生是一個(gè)多步驟的過程，包括ECs的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的水解、ECs向缺氧刺激部位的遷移、管樣結(jié)構(gòu)的形成、環(huán)路的發(fā)育以及周邊細(xì)胞的招募等[51]。既往研究表明，這一級(jí)聯(lián)反應(yīng)受到血管生成因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的嚴(yán)格控制。在視網(wǎng)膜血管生成中，持續(xù)的VEGF梯度最終將到達(dá)現(xiàn)有的血管前端，與內(nèi)ECs中的VEGFR2結(jié)合，使這些ECs成為尖端細(xì)胞，進(jìn)一步延伸形成新芽，參與血管生成[33,52]。但新的概念表明，ECs在代謝途徑中的變化也調(diào)節(jié)血管生成[53]。糖酵解被認(rèn)為是ECs增殖和血管生成的驅(qū)動(dòng)力，PKM2作為糖酵解的關(guān)鍵酶，其PK活性對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞增殖和集體遷移是必不可少的[8]。Zhang等[54]在肺動(dòng)脈高壓(PAH)患者及PAH模型中證明PKM2激活可抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。Li等[55]研究發(fā)現(xiàn)，血液循環(huán)中的PKM2通過增加血管ECs遷移和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)附著，促進(jìn)腫瘤血管生成。糖酵解增加而引起的乳酸水平上調(diào)也可通過促進(jìn)HIF-1α和VEGF的表達(dá)，進(jìn)一步通過VEGFA/VEGFR2信號(hào)通路最終誘導(dǎo)血管生成[33]。大量研究致力于PKM2在腫瘤血管生成中的作用，然而，它在正常增殖細(xì)胞如血管常駐內(nèi)皮祖細(xì)胞(VR-EPCs)中的作用尚不清楚，Ren等[56]從SD大鼠心臟中分離出VR-EPCs，分別采用PKM2激活劑(DASA-58)及PKM2抑制劑(compound 3K，C3K)探討PKM2在大鼠中的作用，發(fā)現(xiàn)PKM2通過調(diào)節(jié)糖酵解、線粒體分裂和融合調(diào)節(jié)VR-EPCs的血管生成。PKM2的丟失限制了ECs的生長(zhǎng)并觸發(fā)先天免疫信號(hào),為了了解PKM2對(duì)血管生成發(fā)芽的功能重要性，Stone等[45]評(píng)估了ECs、原代細(xì)胞、斑馬魚和小鼠的遷移和增殖，發(fā)現(xiàn)PKM2的缺失損害了EC在體內(nèi)的增殖和遷移，結(jié)果表明PKM2是內(nèi)皮遷移和增殖的關(guān)鍵調(diào)控因子，其缺失會(huì)抑制血管擴(kuò)張，阻礙血管新生。為了研究PKM2在ECs參與的血管新生中的作用，Gómez-Escudero等[4]通過采用紫草素及2-DG等抑制PKM2后進(jìn)行血管生成相關(guān)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明PKM2沉默破壞ECs的集體遷移，PKM2活性參與新生血管的調(diào)節(jié)，從而說明PKM2是體內(nèi)體外血管新生所必需的，而這一作用主要是通過介導(dǎo)ATP的產(chǎn)生調(diào)節(jié)ECs集體遷移實(shí)現(xiàn)的。這一結(jié)論與之前的研究是一致的，即在出生后的小鼠中，PKM2沉默和紫草素處理后，小鼠的視網(wǎng)膜發(fā)生血管缺陷。 PKM2是Warburg效應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，最近研究表明，抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVECs的糖酵解，對(duì)管的形成和遷移有明顯的抑制作用，白藜蘆醇(resveratrol， RST)通過調(diào)控ECs中Erk1/2磷酸化介導(dǎo)的PKM2核易位來抑制有氧糖酵解，進(jìn)一步抑制血管生成[16]。對(duì)于依賴PKM2 的有氧糖酵解，主要是通過二聚體形式的蛋白激酶活性調(diào)控的[12]。EGFR磷酸化PKM2，促進(jìn)PKM2二聚化并轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞核，作為蛋白激酶發(fā)揮作用，上調(diào)c-Myc及cyclin D1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)有氧糖酵解和細(xì)胞周期的進(jìn)展[57]。因此，PKM2可以通過其經(jīng)典的PK作用參與血管新生；在某些刺激作用下，亦可通過二聚體核易位發(fā)揮蛋白激酶作用，促進(jìn)血管生成。

3.2PKM2通過光感受器細(xì)胞參與DR的進(jìn)展

3.2.1PKM2在光感受器細(xì)胞中的表達(dá)及作用視網(wǎng)膜的感光功能主要在視網(wǎng)膜的神經(jīng)上皮內(nèi)完成，是由視網(wǎng)膜光感受器介導(dǎo)的，主要包括視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞。視網(wǎng)膜是高度代謝的，其光感受器細(xì)胞的外節(jié)不斷脫落，需要RPE細(xì)胞持續(xù)吞噬、代謝[58]，為了滿足代謝需求，它們需要不斷的視紫紅質(zhì)轉(zhuǎn)換，所需要的能量來源于有氧糖酵解[59]。糖酵解對(duì)于感光細(xì)胞的存活是必不可少的，該通路的消融導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性，而該通路的上調(diào)具有神經(jīng)保護(hù)作用，可防止視錐細(xì)胞變性[60]。作為糖酵解的重要調(diào)控因子[48]，PKM2主要表達(dá)于光感受器的內(nèi)節(jié)和外叢狀層[61]。在視網(wǎng)膜中，PKM2介導(dǎo)的有氧糖酵解不僅為細(xì)胞提供能量，而且為細(xì)胞增殖和血管生成方面提供物質(zhì)基礎(chǔ)，包括核酸，蛋白質(zhì)等。對(duì)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的研究表明，PKM2在桿狀和錐狀細(xì)胞中都是主要的亞型，以代謝和非代謝形式調(diào)節(jié)感光細(xì)胞，在感光細(xì)胞的功能和存活中發(fā)揮重要作用[62]。

3.2.2PKM2通過調(diào)節(jié)光感受器細(xì)胞參與DR的進(jìn)展DR通常伴有進(jìn)行性視力喪失[63]。在許多視網(wǎng)膜疾病中，光感受器細(xì)胞死亡是視力喪失的最終原因[64]。在DR中，隨著疾病的進(jìn)展，RPE細(xì)胞之間的緊密連接復(fù)合體被拆解，引起血視網(wǎng)膜外屏障的破壞，導(dǎo)致血管滲漏[58]，引起視力喪失。PKM2作為一種糖酵解酶，發(fā)揮代謝作用，其活性的調(diào)節(jié)可導(dǎo)致糖酵解中間體的積累，并增加戊糖磷酸途徑的通量，與光感受器的存活密切相關(guān)。在主要表達(dá)PKM2的細(xì)胞中，ML-265可將PK活性提高到與僅表達(dá)PKM1亞型的細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃剑芯咳藛T[65]通過玻璃體腔將ML-265注射到大鼠眼睛，利用661W錐形細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ML-265可以在細(xì)胞環(huán)境中增加PK活性，從而規(guī)避光感受器凋亡[64]。Qi等[66]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病條件下的高血糖會(huì)通過磺化作用降低小鼠腎小球和培養(yǎng)的足細(xì)胞中PKM2四聚體的形成和活性，PKM2激活可防止糖尿病性腎小球病變和線粒體功能障礙的進(jìn)展。因此，糖尿病患者視力下降可能是由于糖尿病引起PKM2的PK活性水平降低[66]。此外，PKM2還具有非代謝作用，Rajala等[67]有條件地敲除桿狀細(xì)胞光感受器中的PKM2，發(fā)現(xiàn)桿狀細(xì)胞中PKM1的表達(dá)代償性增加,體外分析也表明PKM2能夠調(diào)控磷酸二酯酶6β(phosphodiesterase 6β，Pde6β)啟動(dòng)子調(diào)節(jié)視覺功能的轉(zhuǎn)錄活性，參與調(diào)節(jié)光感受器的功能，從而說明PKM2的代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能可能有助于光感受器的結(jié)構(gòu)、功能和活力。該研究組通過類似研究表明PKM2在錐細(xì)胞的合成代謝過程中是至關(guān)重要的，以保持它們的正常功能和支持錐細(xì)胞結(jié)構(gòu)[60]。之前有研究報(bào)道，PKM2在腫瘤中發(fā)揮代謝和非代謝作用，為了進(jìn)一步研究PKM2在DR的代謝和非代謝作用，Rajala等[62]采用具有肥胖和2型糖尿病表型的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)PKM2表達(dá)降低而PKM1表達(dá)不變，因此推測(cè)PKM1在PKM2水平降低時(shí)代償性增高可能是db/db小鼠視網(wǎng)膜中PK活性升高的原因。最近研究表明[68]，在視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment，RD)中，視網(wǎng)膜外部會(huì)出現(xiàn)急性營(yíng)養(yǎng)缺乏，在自噬存在的情況下，會(huì)導(dǎo)致PKM2的酪氨酸磷酸化降低，從而提高了PK活性，可能促進(jìn)分解代謝和ATP的產(chǎn)生，以防止細(xì)胞死亡，而自噬的缺失使得PKM2保持磷酸化并處于低活性狀態(tài)，不利于光感受器的存活。視網(wǎng)膜脫離同時(shí)也作為DR的晚期表現(xiàn)之一，PKM2通過代謝及非代謝作用參與DR的進(jìn)展，然而，其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，PKM2可能作為治療DR的一個(gè)靶點(diǎn)。

4總結(jié)與展望

目前對(duì)于PKM2參與DR的研究主要集中于光感受器方面，其驅(qū)動(dòng)的糖酵解對(duì)于光感受器功能維持是至關(guān)重要的。眾所周知，DR是由慢性高血糖引起的微血管并發(fā)癥，持續(xù)的高血糖及其介導(dǎo)的慢性低度炎癥在DR的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。ECs在血管生成各個(gè)步驟中發(fā)揮重要作用，越來越多的證據(jù)表明，ECs代謝障礙在DR的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。近年來，PKM2在糖尿病腎病等炎癥性疾病中的作用受到廣泛關(guān)注。如前所述，PKM2可以通過代謝和非代謝作用參與內(nèi)皮細(xì)胞及光感受器細(xì)胞的功能。最近研究表明，自噬是光感受器在DR中維持自身穩(wěn)態(tài)和提高存活率所必需的，這一作用可能是自噬通過改變糖酵解中的關(guān)鍵酶包括HK2和PKM2實(shí)現(xiàn)的,然而具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。目前，對(duì)于PKM2通過內(nèi)皮細(xì)胞參與DR的相關(guān)研究還在進(jìn)展階段，研究人員僅提出STEAP4可以抑制HIF-1α/PKM2信號(hào)通路降低高血糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。VEGFA作為HIF-1α的靶分子，同時(shí)也是血管生成的重要調(diào)控因子，研究表明，PKM2/HIF-1α正反饋通路在腫瘤的血管生成過程中發(fā)揮重要作用，腫瘤中的血管生成與DR中的血管生成類似，均表現(xiàn)為微血管異常生長(zhǎng)，因此我們猜測(cè)PKM2/HIF-1α可能在DR的血管生成過程中發(fā)揮重要作用，其具體的作用機(jī)制還值得進(jìn)一步探討。因此，PKM2是否會(huì)通過參與血管新生在DR的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，及其具體的作用機(jī)制還值得進(jìn)一步探討，而其深入的研究，對(duì)于DR的診斷和治療具有一定的指導(dǎo)意義。