7種氨基酸與丙烯醛典型反應(yīng)產(chǎn)物的表征

歐雋瀅，郭鴻陽(yáng)，翁 婷，鄒照佳

（1 暨南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究院 廣州 510632 2 暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系 廣州 510632 3 藥明康德新藥開發(fā)有限公司 江蘇蘇州 215000）

丙烯醛是不飽和羰基化合物中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的物質(zhì)，分子式為C3H4O（CH2=CH-CHO），在室溫下為一種透明、無(wú)色至淺黃色易燃液體，具有刺激性氣味。作為一種具有高度反應(yīng)性的醛類，丙烯醛是合成其它有機(jī)物重要的中間介質(zhì)，如殺生物劑、蛋氨酸等[1]。丙烯醛是一種普遍存在的環(huán)境污染物，產(chǎn)生于汽油、柴油、香煙、木材或塑料等有機(jī)物燃燒過(guò)程中；它還廣泛存在于加工食品，特別是油炸和焙烤等熱加工食品以及酒類中，如啤酒、葡萄酒和朗姆酒等[2-7]。Logue 等[8]計(jì)算美國(guó)室內(nèi)空氣中1 192 種物質(zhì)對(duì)健康的累積影響，丙烯醛與PM2.5及甲醛被列為最重要的健康影響物質(zhì)，而且作為一種主要空氣和水毒物被記錄于美國(guó)環(huán)境保護(hù)署，其推薦水中含量不得超過(guò)65 μg/L，然而實(shí)測(cè)值往往高于此數(shù)據(jù)[1，9]。在生物系統(tǒng)中，它可由烯丙醇、烯丙胺、精胺、亞精胺和抗癌藥物環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)生[10-15]。

丙烯醛因含有α，β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)而極易發(fā)生親核反應(yīng)，與人體內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，損耗體內(nèi)谷胱甘肽（GSH）水平，破壞人體抗氧化系統(tǒng)，誘發(fā)活性氧產(chǎn)生，增加氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而誘發(fā)各種疾病，如阿爾茲海默癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣化、老年癡呆病以及癌癥等[2，16-20]。丙烯醛也是一種基因毒性物質(zhì)，通過(guò)損傷DNA 誘發(fā)基因突變，干擾DNA 修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21-23]。

從前人的研究可推斷，丙烯醛在油炸薯片中形成后迅速消減。Granvogl[24]、Ewert 等[25]將菜籽油和商用油炸油在180 ℃下加熱4 h 后用于油炸薯片、薯?xiàng)l和圈餅，而后檢測(cè)油炸油和油炸制品中丙烯醛含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)油炸油中的丙烯醛含量比薯片高出數(shù)千倍（菜籽油2 897～4 561 倍，商用油2 603～3 674 倍）。鑒于丙烯醛溶于食用油，油炸油和油炸品中的丙烯醛濃度理應(yīng)相等，以上現(xiàn)象說(shuō)明油炸制品中的丙烯醛大多被消除。本研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)在油炸過(guò)程中，薯片的一些組分，如多酚、糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸與丙烯醛發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致薯片中丙烯醛含量顯著降低。本團(tuán)隊(duì)前期研究[26-28]表明，半胱氨酸、γ-氨基丁酸、丙氨酸可與丙烯醛反應(yīng)降低丙烯醛含量。然而，其它氨基酸是否發(fā)揮消減作用及其機(jī)制尚不清楚。馬鈴薯游離氨基酸含量很高，Elmore 等[29]在馬鈴薯中檢測(cè)到22 種氨基酸，其中含量最高的天冬酰胺達(dá)27 mmol/kg，并且隨著薯片制品加工過(guò)程中含量逐漸減少，本團(tuán)隊(duì)推測(cè)其它氨基酸也會(huì)在丙烯醛的消除中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)中將馬鈴薯中含量較高的7 種氨基酸與丙烯醛反應(yīng)，分離純化出主要產(chǎn)物，檢測(cè)代表性產(chǎn)物在薯片中的含量，以闡明油炸薯片中丙烯醛的消減機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙烯醛（分析純級(jí)），中國(guó)成都艾克達(dá)化學(xué)試劑有限公司；L-纈氨酸 （Val，99%）、L-蘇氨酸（Thr，99%）、L-天冬氨酸 （Asp，99%）、L-谷氨酸（Glu，99%）、L-甘氨酸 （Gly，99%）、L-天冬酰胺（Asn，99%）、L-谷氨酰胺（Gln，99%）、正己烷（分析純級(jí)），北京百靈威科技有限公司；D2O，劍橋同位素公司 （Cambridge Isotope Laboratories）；DMSO-d6，上海麥克林生化科技有限公司；甲醇（色譜純級(jí)），美國(guó)Mallinckrodt Baker 公司；A-HG 型十八烷基鍵合硅膠（ODS），日本東京YMC 有限公司；葡聚糖凝膠LH-20（Sephadex LH-20），上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

HR-200 分析天平，廣州市艾安得儀器有限公司；LC-20AT 高效液相色譜儀【配有電噴霧離子源（ESI）】，日本Shimadzu 公司；SHA-BA 恒溫振蕩器，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；N-1300 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會(huì)社；Scientz-10N 型真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；X500R QTOF 型高分辨質(zhì)譜儀，美國(guó)SCIEX 公司；600 MHz Avance III 型核磁共振儀，瑞士布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 氨基酸-丙烯醛產(chǎn)物制備 反應(yīng)在150 mL具塞錐形瓶中進(jìn)行，研究發(fā)現(xiàn)[26]氨基酸與丙烯醛的反應(yīng)比例為2∶1（物質(zhì)的量的比）時(shí)效果比較理想，因此采用這一比例，并根據(jù)不同氨基酸反應(yīng)難易程度，在50～80 ℃、密封條件下反應(yīng)2～5 h。

1.3.2 反應(yīng)結(jié)果檢測(cè) 采用HPLC、HPLC-MS/MS檢測(cè)粗反應(yīng)產(chǎn)物以及對(duì)分離純化后物質(zhì)進(jìn)行純度和結(jié)構(gòu)鑒定。色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-Aq，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動(dòng)相：怡寶水（A）、色譜級(jí)甲醇（B）；檢測(cè)器：SPD-M20A 光電二極管陣列檢測(cè)器；分析條件：流動(dòng)相為5%B 水溶液，流速：0.6 mL/min，進(jìn)樣體積為2 μL。柱溫：40 ℃，產(chǎn)物的檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm 和254 nm。

質(zhì)譜條件：色譜柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）、色譜級(jí)甲醇（B）；分析條件：流動(dòng)相為5%B 水溶液，流速：0.4 mL/min，進(jìn)樣體積為0.5 μL。離子源為電噴霧離子源（ESI），掃描范圍為m/z 50～800；源溫度為300 ℃，去溶劑化溫度為250 ℃，毛細(xì)管電壓為4 000 V，掃描速率為1 000 u/s，碰撞能量為15～25 eV。

1.3.3 分離純化 柱層析法進(jìn)行產(chǎn)物分離純化，填料選擇為反相硅膠ODS 和葡聚糖凝膠LH-20，其中ODS 操作為：200 mL 填料于純甲醇中浸泡過(guò)夜，裝載于30 mm×500 mm 規(guī)格的玻璃層析柱中，梯度平衡后，5%甲醇（超聲后）作為洗脫液等度洗脫，流速為1 mL/min，各餾分體積為5 mL。

將100 mL 葡聚糖凝膠LH-20 于5%甲醇中浸泡48 h（期間不斷攪拌，保證充分溶脹）[30]后，裝柱于25 mm×100 cm 層析柱中，5%甲醇作為洗脫液等度洗脫，流速為0.125 mL/min，洗脫液總體積250 mL，各餾分體積為3 mL。

配制顯色劑：稱取0.2 g 2，4-二硝基苯肼（DNPH）溶于100 mL 乙醇中，滴加5 mL 濃鹽酸至溶解。取各餾分200 μL 與100 μL 顯色劑于96 孔板中混合，取有沉淀產(chǎn)生或有顏色變化的餾分于HPLC 和HPLC-MS/MS 檢測(cè)純度，HPLC 檢測(cè)為單峰且濃度含量達(dá)95%以上并于HPLC-MS/MS 下檢測(cè)為單一質(zhì)荷比的餾分混合冷凍干燥后收集固體樣品。

1.3.4 結(jié)構(gòu)鑒定 將純度達(dá)95%以上樣品于HPLC-MS/MS 獲得一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜，在高分辨質(zhì)譜【HRMS，離子源為電噴霧離子源（ESI），掃描范圍為m/z 50～1500】下，分析獲得精確相對(duì)分子質(zhì)量。稱取凍干樣品15 mg 溶解于500 μL DMSO-d6 以及D2O 中并用Avance III 光譜儀獲得氫譜、碳譜、Dept-135 譜圖。

1.3.5 食品中產(chǎn)物的含量檢測(cè) 選取市場(chǎng)上2 種鮮切油炸薯片，采用正己烷作溶劑，索氏抽提法[31]脫脂。將脫脂薯片用研缽碾碎后稱取1 g 樣品，置于50 mL 離心管中，加入10 mL 50%甲醇/水超聲10 min（重復(fù)該操作3 次），離心（10 000 r/min）30 min，取上清液真空旋干，加6 mL 50%甲醇溶液溶解，過(guò)0.22 μm 膜，用HPLC-MS/MS 檢測(cè)食品中丙烯醛-天冬酰胺反應(yīng)產(chǎn)物含量，采用MRM（正離子模式）模式進(jìn)行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 軟件處理，使用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示。

2 結(jié)果與分析

丙烯醛和7 種氨基酸反應(yīng)后，幾乎檢測(cè)不到體系中的丙烯醛（顯色法），而產(chǎn)生了含量很高的新產(chǎn)物（圖1～7）。

2.1 目標(biāo)產(chǎn)物的確定

試驗(yàn)所采用的反應(yīng)條件如表1所示（氨基酸與丙烯醛物質(zhì)量比為2∶1）。不同氨基酸與丙烯醛反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC 圖譜如圖1～7 所示。在不同波長(zhǎng)下找到主要生成物作為目標(biāo)產(chǎn)物，并對(duì)其進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明，大部分氨基酸與丙烯醛反應(yīng)的產(chǎn)物最大吸收波長(zhǎng)為λmax=220 nm。而結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的氨基酸——甘氨酸，與丙烯醛反應(yīng)后生成兩種含量較高的產(chǎn)物，分別為目標(biāo)產(chǎn)物1（λmax=220 nm），目標(biāo)產(chǎn)物2（λmax=275 nm）（圖7）；且兩個(gè)產(chǎn)物極性非常接近，保留時(shí)間分別為5.273，4.815 min。

表1 不同氨基酸的反應(yīng)條件Table 1 Reaction conditions of amino acids

圖1 天冬酰胺與丙烯醛反應(yīng)結(jié)果Fig.1 HPLC results of reactions between asparagine and acrolein

圖2 谷氨酸與丙烯醛反應(yīng)結(jié)果Fig.2 HPLC results of reactions between glutamate and acrolein

圖3 天冬氨酸與丙烯醛反應(yīng)結(jié)果Fig.3 HPLC results of reactions between aspartic acid and acrolein

圖4 谷氨酰胺與丙烯醛反應(yīng)結(jié)果Fig.4 HPLC results of reactions between glutamine and acrolein

圖5 蘇氨酸與丙烯醛反應(yīng)結(jié)果Fig.5 HPLC results of reactions between threonine and acrolein

圖6 纈氨酸與丙烯醛反應(yīng)結(jié)果Fig.6 HPLC results of reactions between valine and acrolein

圖7 甘氨酸與丙烯醛反應(yīng)結(jié)果Fig.7 HPLC results of reactions between glycine and acrolein

圖8 不同氨基酸與丙烯醛反應(yīng)結(jié)果的全波長(zhǎng)掃描圖Fig.8 Full-wavelength scan result of reactions between seven amino acids and acrolein

2.2 反應(yīng)產(chǎn)物的分離純化

氨基酸及其產(chǎn)物屬于極性偏大的化合物，ODS 作為填料進(jìn)行分離所用時(shí)間較短并且可以達(dá)到較好的分離效果。甘氨酸反應(yīng)混合物中的兩個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物因保留時(shí)間相近，極性相似，ODS 不能達(dá)到很好的分離效果。葡聚糖凝膠LH-20 洗脫溶劑為反相時(shí)，起反相分配作用，極性大的物質(zhì)保留弱，先被洗脫，極性小的化合物后出柱，并且可以通過(guò)增加柱長(zhǎng)及控制流速達(dá)到目標(biāo)分離效果，因此甘氨酸混合物在ODS 分離后，收集目標(biāo)餾分于葡聚糖凝膠柱進(jìn)行二次分離。

DNPH 是羰基物質(zhì)（醛、酮）的常用顯色劑。根據(jù)本團(tuán)隊(duì)的前期研究結(jié)果[26]，本研究的反應(yīng)產(chǎn)物可能具有羰基結(jié)構(gòu)，因此本文采用DNPH 顯色劑對(duì)洗脫成分進(jìn)行顯色，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生橙紅色沉淀（經(jīng)后期結(jié)構(gòu)鑒定，產(chǎn)生橙紅色沉淀的產(chǎn)物具有相似的結(jié)構(gòu)，λmax=220 nm，統(tǒng)稱為產(chǎn)物類1）。而甘氨酸目標(biāo)產(chǎn)物2 不同于其它產(chǎn)物，與該顯色劑顯色時(shí)并未有沉淀產(chǎn)生，且顯色劑顏色由橙黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t棕色（λmax=275 nm，統(tǒng)稱為產(chǎn)物類2），如圖9（以甘氨酸為例）所示。同時(shí)經(jīng)HPLC 檢測(cè)后，產(chǎn)物在HPLC 上呈現(xiàn)單峰，峰形窄且尖，含量占比95%以上，如圖10（以甘氨酸為例）所示。

圖9 甘氨酸兩類產(chǎn)物與DNPH 顯色劑反應(yīng)結(jié)果Fig.9 Chromogenic color of the reaction products of glycine by DNPH

圖10 甘氨酸分離純化后HPLC 檢測(cè)圖Fig.10 HPLC chromatograph of the purified adducts of glycine

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

分別對(duì)純化后的產(chǎn)物進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描及核磁分析。產(chǎn)物類1 樣品溶解于DMSO-d6 且出峰效果較好，產(chǎn)物類2 樣品在DMSO-d6 中出現(xiàn)沉淀，因此改用D2O 作為溶劑進(jìn)行核磁分析。核磁分析結(jié)果如表2～8 所示。核磁結(jié)果與前期研究結(jié)果[26]類似，兩類產(chǎn)物都存在δC 為193 附近的峰，且每種產(chǎn)物至少有一個(gè)δC 在170 附近出峰點(diǎn)，說(shuō)明氨基酸的羧基未參與反應(yīng)。綜合前期研究及本次研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)氨基酸與丙烯醛的反應(yīng)類型更傾向于氨基與丙烯醛雙鍵發(fā)生親核加成反應(yīng)（邁克爾加成反應(yīng)）后，丙烯醛殘余的兩分子羰基自身縮合形成含氮六元雜環(huán)，并且二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果表明該結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)穩(wěn)定性。該反應(yīng)機(jī)理也由Jiang 等[28]證實(shí)，合成了γ-氨基丁酸與丙烯醛的產(chǎn)物，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析也得出了具有類似環(huán)狀結(jié)構(gòu)的化合物，并且這些化合物相對(duì)于丙烯醛本身大大降低了其毒性，為氨基酸作為食品添加劑提供一種可能。

表2 天冬氨酸-丙烯醛產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的NMR 結(jié)果Table 2 Structure identification of aspartic acid-acrolein

甘氨酸與丙烯醛反應(yīng)產(chǎn)生了2 種主要產(chǎn)物（圖7）?；谀繕?biāo)產(chǎn)物1 的顯色反應(yīng) （橙紅色沉淀）、紫外吸收（λmax=220 nm）和一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果（圖11），其結(jié)構(gòu)類型應(yīng)屬于產(chǎn)物類1。采用高分辨質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物2 分析，得出該產(chǎn)物精確相對(duì)分子質(zhì)量為282.1285，化學(xué)式為C13H18N2O5。通過(guò)計(jì)算，其不飽和度為6，推算出為3 分子丙烯醛與2 分子甘氨酸發(fā)生反應(yīng)、脫去兩分子水的產(chǎn)物。經(jīng)二級(jí)質(zhì)譜及NMR 結(jié)果分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如表8所示。推測(cè)其反應(yīng)途徑如圖12（反應(yīng)途徑2）：同樣，1 分子甘氨酸先與2 分子丙烯醛發(fā)生邁克爾加成后，丙烯醛未參與反應(yīng)的兩個(gè)醛基，其中1 個(gè)與新1分子甘氨酸發(fā)生羰氨反應(yīng)后脫水，另1 個(gè)與新1分子丙烯醛發(fā)生羥醛縮合后脫水，產(chǎn)生1 個(gè)共軛結(jié)構(gòu)。該產(chǎn)物具有較多的雙鍵結(jié)構(gòu)且有明顯共軛，因此紫外吸收強(qiáng)（λmax=275 nm），并且由于結(jié)構(gòu)中多個(gè)雙鍵的存在容易與DMSO-d6 發(fā)生親核反應(yīng)，進(jìn)而核磁分析時(shí)不能以DMSO-d6 作為溶劑。由此，本研究認(rèn)為氨基酸與丙烯醛反應(yīng)有2 條途徑（圖12）：產(chǎn)物類1 按反應(yīng)途徑1 進(jìn)行，并且研究認(rèn)為其為氨基酸與丙烯醛反應(yīng)的主要途徑，且該產(chǎn)物生成溫度跨度可從37 ℃至160 ℃[28]；產(chǎn)物類2 按反應(yīng)途徑2 進(jìn)行。

圖11 甘氨酸-丙烯醛產(chǎn)物1 質(zhì)譜分析結(jié)果（a：正離子模式）、甘氨酸-丙烯醛產(chǎn)物2 高分辨質(zhì)譜結(jié)果（b）Fig.11 MS2 results of glycine-acrolein product 1 （a:positive ion mode），TOF-MS results of glycine-acrolein product 2 （b）

圖12 氨基酸與丙烯醛反應(yīng)機(jī)理Fig.12 Reaction mechanisms of amino acids and acrolein

表8 甘氨酸-丙烯醛產(chǎn)物2 結(jié)構(gòu)的NMR 結(jié)果Table 8 Structure identification result of glycine-acroelin-2

2.4 油炸薯片中天冬酰胺-丙烯醛產(chǎn)物含量檢測(cè)

馬鈴薯中天冬酰胺的含量最高為27 000 μmol/kg，且其含量隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少[29]。本研究以天冬酰胺-丙烯醛加合物為代表，開發(fā)了其基于HPLC-MS/MS 的檢測(cè)技術(shù)。MRM 分析條件：定量離子對(duì)：227/168（碰撞能量為20 eV，駐留時(shí)間為220 ms）；定性離子對(duì)：227/181（碰撞能量為22 eV，駐留時(shí)間為220 ms）。流動(dòng)相：A 相/B 相：水/乙腈（含0.1%甲酸），流速0.5 mL/min，洗脫程序：0～2 min，2%B～100%B；2～8 min，100%B～100%B；8～8.01 min，100%B～2%B；8.01～18 min，2%B。結(jié)果表明，兩種油炸鮮切薯片中的天冬酰胺-丙烯醛加合物含量分別為（1.89±0.30）μg/kg，（1.46±0.19）μg/kg，低于γ-氨基丁酸-丙烯醛加合物含量。天冬酰胺-丙烯醛加合物在油炸薯片中的存在說(shuō)明，鮮切薯片在油炸過(guò)程中，消失的丙烯醛與馬鈴薯中的氨基酸結(jié)合是丙烯醛在薯片中暴露量降低的原因之一。本研究的檢測(cè)技術(shù)為食品中其它氨基酸-丙烯醛加合物的檢測(cè)提供了參考。

表3 谷氨酸-丙烯醛產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的NMR 結(jié)果Table 3 Structure identification of glutamic acid-acrolein

表4 谷氨酰胺-丙烯醛產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的NMR 結(jié)果Table 4 Structure identification of glutamine-acrolein

表5 纈氨酸-丙烯醛產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的NMR 結(jié)果Table 5 Structure identification of valine-acrolein

表6 天冬酰胺-丙烯醛產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的NMR 結(jié)果Table 6 Structure identification result of asparagine-acrolein

表7 蘇氨酸-丙烯醛產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的NMR 結(jié)果Table 7 Structure identification result of threonine-acrolein

3 結(jié)論

本研究分離純化出8 種氨基酸與丙烯醛反應(yīng)主要產(chǎn)物，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨基酸與丙烯醛主要通過(guò)兩種途徑發(fā)生反應(yīng)：一是先進(jìn)行邁克爾加成反應(yīng)，再進(jìn)行羥醛縮合反應(yīng)，且該反應(yīng)途徑是幾乎所有氨基酸與丙烯醛反應(yīng)的主要途徑；二是先進(jìn)行邁克爾加成反應(yīng)，再發(fā)生羰氨反應(yīng)和羥醛縮合反應(yīng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，代表性產(chǎn)物天冬酰胺-丙烯醛反應(yīng)產(chǎn)物存在于鮮切油炸薯片中。本研究結(jié)果表明，馬鈴薯中存在的游離氨基酸可能在油炸薯片的丙烯醛消減中發(fā)揮重要作用，其作用機(jī)理是氨基酸的氨基與丙烯醛的烯基和羰基反應(yīng)形成新的產(chǎn)物。然而，這些新產(chǎn)物吸收后，是否會(huì)在體內(nèi)再次釋放出丙烯醛，從而增加丙烯醛的體內(nèi)暴露水平，還需進(jìn)一步研究。