藏藥肺熱普清散中烏頭堿的限量檢測(cè)

馬 靜，鄒 麗△，王 曙

（1.四川省藥品檢驗(yàn)研究院院·四川省醫(yī)療器械檢測(cè)中心，四川 成都 611731；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041）

肺熱普清散（藏文名為洛才更賽），收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥：第一冊(cè)》［1］中，主要由天竺黃、紅花、力嘎都、叢菔、鐵棒錘幼苗等14味藏藥組方，具有清肺、泄熱、消炎功效，可用于治療小兒肺炎、流感、風(fēng)熱、癘熱等。方中鐵棒錘幼苗為鐵棒錘Aconitum pendulumBusch和伏毛鐵棒錘A.flavumHand.Mazz.的干燥幼苗，為藏醫(yī)、羌醫(yī)和回醫(yī)民族習(xí)用藥材，多用于治療感冒、瘟疫、熱毒、瘡疔等［2-3］。鐵棒錘有大毒，各器官中均含有二萜生物堿，含量由高到低依次為根、果、莖、葉，母根和子根毒性雖大，但療效顯著，幼苗的毒性稍小，但療效稍次［4］。塊根中的總生物堿含量隨生長(zhǎng)發(fā)育期的變化而不同，其中6～11月的塊根中總生物堿含量隨生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)而逐漸升高，10 月的含量可達(dá)（9.07±0.92）mg/g［5-7］。肺熱普清散方中所用鐵棒錘幼苗而非塊根，說(shuō)明藏醫(yī)藥前輩已注意到了該類(lèi)藥材的毒性。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)該制劑中含有雙酯型二萜類(lèi)生物堿中主要成分烏頭堿進(jìn)行含量限度檢測(cè)，克服了薄層色譜鑒別中樣品的雜質(zhì)干擾和斑點(diǎn)不清晰的狀況［8-12］?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10AT型高效液相色譜儀，包括SPD-M10Avp型紫外檢測(cè)器、CLASSVP 工作站（日本Shimadzu 公司）；HWS24 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；XP205DR 型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

肺熱普清散（西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為171101，171102，171103，171201，171202，171203）；烏頭堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110720-200410，含量＞98.0%）；醋酸銨、乙腈、四氫呋喃為色譜純，乙醇、鹽酸、氨水、乙酸乙酯為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex ODS 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L醋酸銨（A，用氨水調(diào)pH至10）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取烏頭堿對(duì)照品14.4 mg，置100 mL 容量瓶中，加異丙醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）溶液溶解并定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.144 mg/mL 的對(duì)照品貯備液；精密吸取1 mL，置10 mL容量瓶中，加異丙醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）溶液定容，搖勻，制得質(zhì)量濃度為14.4 μg/mL的對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取樣品20 g，用乙醇200 mL 加熱回流提取2 次，每次1 h，合并提取液，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)?%鹽酸溶液40 mL使溶解，用氨水調(diào)pH 至5；經(jīng)D101大孔吸附樹(shù)脂（柱體積為50 mL），依次用水和10%乙醇150 mL 洗脫，棄去洗脫液，再用85%乙醇100 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?%鹽酸溶液40 mL 溶解，并轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用氨水調(diào)pH 至10，以乙酸乙酯萃取3 次，每次40 mL，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓⑥D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按處方工藝制備不含鐵棒錘幼苗的陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下3 種溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，理論板數(shù)按烏頭堿峰計(jì)應(yīng)不低于2 000；分離度大于1.5，基線分離良好。色譜圖見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察：取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，加異丙醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）溶液，制成質(zhì)量濃度分別為4.6，8.8，24.0，48.0，72.0，144.0 μg/ mL 的系列對(duì)照品溶液。精密吸取10 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以烏頭堿進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=49 878X+8 166（r=0.999 6，n=6）。結(jié)果表明，烏頭堿進(jìn)樣量在0.046～1.440 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限與檢測(cè)限考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)?.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比（S/N）10∶1 和3∶1 時(shí)的質(zhì)量濃度記作定量限和檢測(cè)限。結(jié)果烏頭堿的定量限和檢測(cè)限分別為5.0 μg/mL和1.2 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果烏頭堿峰面積的RSD為1.08%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，10 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果烏頭堿峰面積的RSD為1.43%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱(chēng)取樣品（批號(hào)為171101）適量，共6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果烏頭堿平均含量的RSD為1.51%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為171101）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取6 批樣品各適量，分別按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定3 次，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品中烏頭堿含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of aconitine in the samples（mg/g，n=3）

健康成人口服0.2 mg 烏頭堿可發(fā)生中毒反應(yīng)，2.0～4.0 mg 即可致死。本試驗(yàn)中，烏頭堿的平均含量為0.004 5 mg/g，肺熱普清散的用量為每次1 袋，每袋1 g，每日2次，故每日服用烏頭堿的量為9.0 μg，遠(yuǎn)低于烏頭堿的中毒劑量，表明在該劑量下常規(guī)用藥合理、安全。

3 討論

肺熱普清散為藏藥，藏藥的來(lái)源多為民間草藥，由于人們對(duì)民族醫(yī)藥的認(rèn)知過(guò)少，常忽略個(gè)別藥材毒副作用的危害，加之我國(guó)民族藥的有效性、安全性和毒性評(píng)價(jià)體系不健全，一直影響和制約著民族醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。預(yù)試驗(yàn)中測(cè)定過(guò)鐵棒錘幼苗中雙酯型生物堿（烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿），但僅檢出烏頭堿，故本研究中僅對(duì)不同來(lái)源鐵棒錘幼苗藥材中的烏頭堿進(jìn)行了含量測(cè)定，并制訂了肺熱普清散中烏頭堿的限量。

預(yù)試驗(yàn)中也考察了不同流動(dòng)相，包括0.25 mol/ L乙酸銨溶液（用濃氨水調(diào)pH 至9.5）-乙腈（48∶52，V/V）［13］，甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀-醋酸-異丙醇（67∶173∶4∶4，V/V/V/V）［14］，甲醇-0.2 mol/ L 醋酸銨-冰醋酸（67∶33∶1，V/V/V）［15］，以及乙腈-四氫呋喃（25∶15，V/V）-0.1 mol/L 醋酸銨（梯度洗脫）［16］對(duì)結(jié)果的影響，但部分主峰與其他雜質(zhì)峰不能完全分離，或陰性干擾較嚴(yán)重。故對(duì)上述流動(dòng)相條件進(jìn)行了優(yōu)化，以0.05 mol/L 乙酸銨溶液（pH 10）-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)的效果較好，雜質(zhì)無(wú)干擾。

預(yù)試驗(yàn)中還考察了不同廠家的色譜柱，包括Shimpack C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm；日本Shimadzu 公司）和Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；廣州菲羅門(mén)科學(xué)儀器有限公司），結(jié)果表明，在不同色譜柱上，基線分離均較好，含量測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異。

綜上所述，所建立的方法穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，可用于測(cè)定肺熱普清散中烏頭堿的含量。