多元統(tǒng)計(jì)法高效篩選薏苡仁蛋白抗氧化提升肽方法構(gòu)建*

楊土娣，陳展鵬，楊容，鄭文宇，林維杰，古敏，陳潼林，邱穗琳，周蘇斌，趙謀明，廖蘭,

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 300134；2.福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州 350102；3.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

薏苡仁為禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖血鈣、降血壓、抗病毒等作用[1-3]。薏苡仁中含有65%碳水化合物，其次是蛋白質(zhì)，約占18.7%[4-9]。

董紅艷[10]和韓麗麗[11]等采用商業(yè)蛋白酶對(duì)薏苡仁蛋白進(jìn)行酶解研究，利用單因素、響應(yīng)面等手段獲得了經(jīng)優(yōu)化的薏苡仁抗氧化肽的酶解條件。朱海峰等[12]的研究表明酶解法處理蛋白質(zhì)后，使處于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露出來產(chǎn)生苦味肽，使水解產(chǎn)物呈現(xiàn)出一定的苦味，限制了水解產(chǎn)物的最終應(yīng)用。因此，蛋白質(zhì)的水解不僅需要內(nèi)切酶，還需要外切肽酶的參與，內(nèi)切酶僅能將蛋白質(zhì)水解為多肽，而外切酶可以將多肽水解為氨基酸[13]。風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)既包含內(nèi)切位點(diǎn)又含有外切位點(diǎn)，復(fù)合蛋白酶(Protamex)主要作用于內(nèi)切位點(diǎn)，兩者均為商業(yè)蛋白酶。商業(yè)蛋白酶酶解蛋白質(zhì)是制備各功能性多肽的主要方法[14-16]。

單因素實(shí)驗(yàn)、回歸正交和響應(yīng)面優(yōu)化等是酶解過程篩選條件最常用的方法。傳統(tǒng)的單因素試驗(yàn)篩選策略在較多考察因子時(shí)需擴(kuò)大試驗(yàn)次數(shù)，不但延長(zhǎng)了試驗(yàn)周期，且易產(chǎn)生隨機(jī)誤差[17]。響應(yīng)面優(yōu)化方法雖解決了隨機(jī)誤差問題，但當(dāng)變量個(gè)數(shù)較多時(shí)，準(zhǔn)確構(gòu)造一個(gè)近似多項(xiàng)式以進(jìn)行確定性分析具有一定困難，特別是當(dāng)模型具有明顯的非線性特征，或誤差為非正態(tài)分布時(shí)，獲得模擬切真而合適的優(yōu)化更加困難[18]。因此，十分必要構(gòu)建一種高效快速篩選蛋白功能性酶解物的方法。

本研究利用相對(duì)豐度熱圖（Heatmap）、主成分分析法（Principle component analysis, PCA） 與差異條形圖分析法三者結(jié)合對(duì)三種酶（風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和兩者各50%復(fù)合酶）二次酶解薏苡仁蛋白堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L水酶法制得的苦味肽，對(duì)其水解度（Degree of Hydrolysis, DH）、蛋白質(zhì)回收率（Protein Recovery, PR）與抗氧化指標(biāo)進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析，以薏苡仁蛋白肽進(jìn)行抗氧化功能提升為目標(biāo)，利用樣品多元統(tǒng)計(jì)學(xué)的相關(guān)性與顯著性來確定最佳酶解物，進(jìn)而確定最優(yōu)酶解條件。該方法快速直觀，可為食品酶蛋白解領(lǐng)域高效篩選目標(biāo)樣品提供具有參考價(jià)值的工具。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏苡仁：福建南平浦城仙芝樓公司贈(zèng)予；堿性蛋白酶Alcalase 2.4L、風(fēng)味蛋白酶 Flavourzyme、復(fù)合蛋白酶 Protamex：北京Novozymes公司；其他試劑均為分析純級(jí)，由國(guó)藥試劑提供。

1.2 儀器與設(shè)備

ML204 分析天平，梅特勒-托利儀器有限公司；HWCL-3加熱磁力攪拌器，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；TGL-20MB高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)有限公司；THZ-82水浴恒溫振蕩器，常州市金壇鴻科設(shè)備有限公司；FM200高速分散均質(zhì)機(jī)，廈門精藝業(yè)主科技有限公司；WGL-125B電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯儀器有限公司；PHS-25 pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；FD-1C-50冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；EU-2600紫外可見分光光度計(jì)，上海昂拉儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 一次薏苡仁水酶法蛋白肽的制備

浦城薏苡仁精米→打粉、80目過篩→配制成20%（w/w）懸浮液→30 ℃恒溫水化12 h→高壓（20 MPa）均質(zhì)、3次→冷凍干燥制粉→25 ℃恒溫浸泡3 h→離心取渣→0.4%（w/w）L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液預(yù)處理浸泡30 min→調(diào)節(jié)pH值至9.6→Alcalase 2.4 L[2%（w/w）底物蛋白]35 ℃孵育3 h→沸水浴10 min滅酶活→離心得上清液→薏苡仁水酶法蛋白肽溶液。

1.3.1 二次酶解薏苡仁蛋白制備抗氧化功能提升肽的工藝流程

薏苡仁水酶法蛋白肽溶液→調(diào)節(jié)pH值至7，溫度50 ℃→加酶→分別孵育 0.5、1、1.5、2、3、4、5、6 h→定量取樣→沸水10 min滅酶活→離心得上清液。其中，酶為分別加入1% Flavourzyme（w/w，底物/蛋白）、1% Protamex（w/w，底物/蛋白）、0.5%Flavourzyme+0.5% Protamex的復(fù)合酶（w/w，底物/蛋白）。

1% Flavourzyme 處理n小時(shí)記作F-n；1%Protamex處理n小時(shí)記作P-n；0.5% Flavourzyme+0.5% Protamex的復(fù)合酶處理n小時(shí)記作FP-n；共24組樣品。

1.3.2 蛋白質(zhì)回收率（PR）測(cè)定方法

根據(jù)Aspevik等[19]人的方法測(cè)定酶解液樣品的蛋白質(zhì)含量，采用凱氏定氮法測(cè)定薏苡仁粗蛋白和酶解液中的蛋白含量。蛋白質(zhì)回收率為酶解液中蛋白含量與原始薏苡仁蛋白中蛋白含量的比值。

1.3.3 水解度（DH）測(cè)定方法

根據(jù)Zhao等[20]人的方法稍作修改，水解度的定義為水解的肽鍵數(shù)量（h）相對(duì)于每單位重量的肽鍵數(shù)量（htot），以百分比表示。

計(jì)算公式如下：

式中：x——樣品蛋白水解液的-NH2含量（μmol/mL）；

1.3.4 樣品蛋白水解液的-NH2含量

根據(jù)Bidlingmeyer等[21]人的方法稍作修改，精密稱取不同樣品1.0 g，加入20 mL水，浸泡2 h，60 ℃、250 W超聲提取1 h，抽濾30 min，取濾液冷凍干燥成粉，加水定容至10 mL備用，以不加樣品的溶液為空白對(duì)照，采用HPLC分析。

1.3.5 抗氧化性測(cè)定方法

1.3.5.1 DPPH 自由基清除能力

根據(jù)Liu等[22]人的方法稍作修改，分別取1 mL酶解樣品與1 mL 95%乙醇配置的0.1 mM DPPH溶液混合，室溫黑暗放置0.5 h后于517 nm測(cè)定吸光值。參比組為1 mL 95%乙醇溶液與1 mL酶解樣品混合，空白組為1 mL 95%乙醇配置的0.1 mM DPPH溶液與1 mL 95%乙醇混合溶液。

DPPH自由基清除能力

式中：Ai——樣品組吸光值；

Aj——樣品參比組吸光值；

A0——空白組吸光值。

1.3.5.2 ABTS 自由基清除能力

根據(jù)Re等[23]人的方法稍作修改，取7 mM ABTS與2.45 mM過硫酸鉀溶液等比例混合，室溫避光靜置12～16 h后，采用5 mM pH值7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋混合溶液至吸光值為0.70±0.02（λ=734 nm），配置成ABTS自由基溶液。分別取酶解樣品與ABTS自由基溶液等比例混合，室溫避光反應(yīng)20 min于λ=734 nm下測(cè)定吸光值，采用5 mM pH值7.4的磷酸鹽緩沖液調(diào)吸光值為零，空白組以蒸餾水代替。

ABTS自由基清除能力

式中：Acontrol——空白組吸光值；

A sample——樣品組吸光值。

1.3.5.3 Fe2+螯合能力

根據(jù)Guo等[24]人的方法稍作修改，取1 mL不同酶解樣品，分別添加4.7 mL蒸餾水和0.1 mL 2 mM FeCl2，充分混勻后加入0.2 mL 5 mM Ferrozine溶液反應(yīng)30 min，取上清液于562 nm測(cè)吸光值?？瞻捉M以1 mL蒸餾水替代樣品，參比組為1 mL樣品加入5 mL蒸餾水。

計(jì)算公式為：

式中：Ai—樣品組吸光值；

Aj—樣品參比組吸光值；

A0—空白組吸光值。

1.3.5.4 ·OH清除能力

根據(jù)Yang等[25]人的方法稍作修改，分別取1 mL酶解樣品，分別添加0.3 mL 8 mM FeSO4、1 mL 3 mM水楊酸和0.25 mL 20 mMH2O2，充分混勻后于37 ℃反應(yīng)0.5 h，待冷卻至室溫后補(bǔ)足蒸餾水使反應(yīng)液體系達(dá)到3 mL，離心取上清液于510 nm測(cè)吸光值，空白組以蒸餾水代替樣品。

·OH清除能力

式中：Acontrol——空白組吸光值；

Asample——樣品組吸光值。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)；用SPSS 22.0（IBM，美國(guó)）中Ducan分析法進(jìn)行差異顯著性分析（p<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。采用R語言（v 3.6.3，http://www.datavis.ca/R/）pheatmap包進(jìn)行熱圖聚類分析（Heatmap）；XLSTAT 2014（Addinsoft，美國(guó)）進(jìn)行主成分分析（PCA）以及STAMP（v 2.1.3，http://kiwi.cs.dal.ca/Software/STAMP）進(jìn)行差異條形圖（Extended error bar），對(duì)二次酶解薏苡仁蛋白制備抗氧化功能提升肽的DH、PR和4個(gè)抗氧化性指標(biāo)進(jìn)行綜合分析。

2 結(jié)果分析

2.1 二次酶解薏苡仁蛋白肽的水解度和蛋白質(zhì)回收率變化

3 種酶二次酶解薏苡仁蛋白肽的DH和PR的變化如圖1，樣品顏色和渾濁度外觀變化如圖2。由圖1可知0～0.5 h是二次酶解薏苡仁蛋白肽的主要作用時(shí)期，在反應(yīng)前0.5 h，3種酶酶解產(chǎn)物的DH與PR均顯著增加，1 h后緩慢增加并逐漸趨于平穩(wěn)。在前1 h反應(yīng)期，F(xiàn)lavourzyme組的PR與DH迅猛增加至62%，明顯高于另外2組，而Protamex組的增加幅度最小，說明Flavourzyme對(duì)二次酶解液的酶法敏感性高，原因可能是Alcalase 2.4L是內(nèi)切酶，一次酶解薏苡仁蛋白會(huì)產(chǎn)生大量中短肽，而Flavourzyme具有較多的外切位點(diǎn)，可以將堿性蛋白酶水解后的短肽進(jìn)一步水解為氨基酸，前1 h反應(yīng)期內(nèi)Flavourzyme相對(duì)內(nèi)切位點(diǎn)多的Protamex，底物中自由氨基酸含量更高。而Flavourzyme+Protamex組較Protamex組有明顯提升，表明風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶兩者的復(fù)合酶較單復(fù)合蛋白酶來說對(duì)于蛋白質(zhì)的水解作用有所提升，這應(yīng)該是由于風(fēng)味蛋白酶的加入，而風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶作用位點(diǎn)可能有所沖突，導(dǎo)致2種酶復(fù)合酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解能力不及單風(fēng)味蛋白酶的水解能力強(qiáng)。表觀現(xiàn)象也有相似的趨勢(shì)，F(xiàn)lavourzyme酶解1 h，酶解液顏色發(fā)生顯著變化，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，酶解顏色越來越深。Protamex組顏色變化較為緩慢，酶解3 h后才發(fā)生顯著的顏色變化，說明發(fā)生輕微的美拉德反應(yīng)。Flavourzyme+Protamex組從3 h后開始發(fā)生顯著的顏色變化，在酶解5 h后顏色變深變亮。因此，F(xiàn)lavourzyme酶解1 h對(duì)二次酶解薏苡仁蛋白肽的水解更有應(yīng)用價(jià)值。

圖1 二次酶解薏苡仁蛋白肽不同時(shí)間的水解度和蛋白質(zhì)回收率的變化

圖2 二次酶解薏苡仁蛋白肽不同時(shí)間的水解度和蛋白質(zhì)回收率的變化

2.2 二次酶解薏苡仁蛋白肽提升抗氧化性能結(jié)果分析

2.2.1 DPPH 自由基清除能力

由圖3可知，二次酶解顯著提高了薏苡仁蛋白肽的DPPH自由基清除能力。3種酶酶解物其DPPH自由基清除能力均隨水解時(shí)間的增加先增加再趨于穩(wěn)定。Flavourzyme組的清除DPPH自由基能力在酶解1 h最強(qiáng)達(dá)到78.37%，而Protamex組最小60.42%。但是反應(yīng)3 h后，Protamex組的清除DPPH自由基能力最強(qiáng)達(dá)到76.41%，而Flavourzyme組最小71.28%，原因可能是高含量的疏水性氨基酸或肽有關(guān)聯(lián)[26]。

圖3 不同組合酶在不同酶解時(shí)間的DPPH自由基清除能力

一次水酶法Alcalase 2.4 L單酶酶解其薏苡仁蛋白提取率僅為(70.78±1.3)%。一方面，一次酶解不徹底，剩余較多的部分完整蛋白未被酶解，加入Flavourzyme和Protamex可以進(jìn)一步酶解釋放更多具有活性的肽段；另一方面，一次酶解液中含有薏苡仁油脂，從圖2中樣本A表觀看出，一次酶解液是均一穩(wěn)定的乳液，推測(cè)一次酶解薏苡仁蛋白肽結(jié)構(gòu)中含有大量暴露的疏水性氨基酸短肽。因此，F(xiàn)lavourzyme的外切酶1 h就可將薏苡仁蛋白含有疏水性氨基酸的短肽鏈末端切斷釋放氨基酸，增加薏苡仁酶解物中疏水性氨基酸含量，而Protamex組酶切位點(diǎn)更加廣泛，3 h后薏苡仁蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)疏水性氨基酸才得到有序釋放。

2.2.2 ABTS 自由基清除活性

由圖4可知，相比于DPPH自由基清除能力, 薏苡仁多肽具有更為優(yōu)異的ABTS自由基清除活性。分析其原因，一方面可能由溶劑效應(yīng)引起，相比于溶解在乙醇中的DPPH自由基，溶解于水中的ABTS自由基能夠更加充分地與薏米多肽接觸，從而更容易發(fā)生反應(yīng)；另一方面，從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來說, 相比于具有較大位阻的DPPH自由基，ABTS自由基位阻更小，因此更有利于同自由基清除劑反應(yīng)。由此可見薏米多肽具有較強(qiáng)的ABTS自由基清除活性[27]，3種酶組合的ABTS自由基清除能力與DPPH自由基清除能力表現(xiàn)相似，都隨著時(shí)間先增加后趨于穩(wěn)定，F(xiàn)lavourzyme酶解1 h清除ABTS自由基能力達(dá)到最強(qiáng)為87.10%，Protamex 酶解3 h達(dá)到86.52%。

圖4 不同組合酶在不同酶解時(shí)間的ABTS自由基清除能力

2.2.3 ·OH清除能力

由圖5可知，3種酶組合的·OH清除能力都隨著時(shí)間先增加后減小再趨于穩(wěn)定。Flavourzyme組1 h的清除·OH能力最強(qiáng)達(dá)到62.47%。Flavourzyme良好的·OH清除效果和清除DPPH自由基類似，均是由于Flavourzyme酶切位點(diǎn)為疏水性氨基酸，導(dǎo)致酶解物產(chǎn)生良好的自由基清除能力[28]。大分子的蛋白的高度空間結(jié)構(gòu)不利于與自由基發(fā)生反應(yīng)，但經(jīng)水解后，形成許多小分子肽，暴露能參加反應(yīng)的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，因此對(duì)薏苡仁水解物的·OH清除能力明顯提升[26]。

圖5 不同組合酶在不同酶解時(shí)間的羥基自由基清除能力

2.2.4 Fe2+螯合能力

由圖6可知，與前3種抗氧化指標(biāo)變化趨勢(shì)相似，3種酶組合的Fe2+螯合能力隨著酶解時(shí)間先增加后趨于穩(wěn)定。Flavourzyme組在1 h時(shí)Fe2+螯合能力最強(qiáng)達(dá)到82.97%，Protamex組最小，Protamex酶解3 h達(dá)到81.46%。這是由于Alcalase 2.4 L酶解薏苡仁蛋白僅釋放了較少的螯合位點(diǎn)，而Flavourzyme組酶解較Protamex更快速破壞蛋白膠束產(chǎn)生了更多的自由氨基酸基團(tuán)，從而使其與Fe2+螯合位點(diǎn)隨之增加[29]，提高了Fe2+螯合能力。

圖6 不同組合酶在不同酶解時(shí)間的亞鐵離子螯合能力

綜上，從3種酶二次酶解薏苡仁蛋白肽的DH，PR，DPPH、ABTS、Fe2+螯合能力和·OH清除能力6個(gè)指標(biāo)變化指標(biāo)看出，F(xiàn)lavourzyme 1 h與Protamex 3 h二次酶解薏苡仁蛋白提升肽的各方面綜合表現(xiàn)差異不顯著。因此，Protamex 3 h組和Flavourzyme 1 h組在高效篩選抗氧化提升肽均有應(yīng)用價(jià)值。針對(duì)這2個(gè)樣本，進(jìn)一步科學(xué)評(píng)估綜合篩選到最合適的目標(biāo)樣本，而不是基于單一的因素的考量，將利用相對(duì)豐度熱圖（heatmap）、主成分分析法（PCA）與差異條形圖分析法對(duì)二次酶解薏苡仁蛋白進(jìn)行監(jiān)控和條件篩選構(gòu)建出一套新的方法。

2.3 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.3.1 基于熱圖分析對(duì)二次酶解的監(jiān)控和條件篩選

相對(duì)豐度熱圖可以反映樣品之間的相似性以及群落結(jié)構(gòu)的相似性[30]。圖7是基于本試驗(yàn)25個(gè)樣品（右縱坐標(biāo)）和6個(gè)變量（指標(biāo)）的豐富度的熱圖。如圖7所示，熱圖已縱向分成5大組，第3組大部分指標(biāo)的豐富度類似而第2組呈現(xiàn)顯著的差異性（p<0.05），例如ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率、·OH清除率、DH、PR、Fe2+螯合能力的差異性，F(xiàn)-1、P-3、P-4在數(shù)學(xué)模型上其結(jié)構(gòu)以及物理化學(xué)特性有顯著性差異。另一方面，從圖7可看6個(gè)指標(biāo)可以根據(jù)特征分為2類（一級(jí)分類），第一類是抗氧化性，第二類是酶解程度。聚類樹狀圖顯示6個(gè)指標(biāo)之間的相似性主要分為3類（二級(jí)分類）：第一類是DH；第二類主要聚集了PR、·OH；第三類主要聚集了ABTS、DPPH、Fe2+。進(jìn)一步分析第2組中的P-4、F-1、P-3的差異性，其中F-1和P-3在聚類上歸成一類，F(xiàn)-1相對(duì)于P-3所使用的時(shí)間短，具有較高的抗氧化性和酶解程度。

圖7 不同酶解時(shí)間下不同酶組合的酶水解產(chǎn)物的相對(duì)豐度熱圖

綜上，F(xiàn)-1和P-3的處理對(duì)二次酶解薏苡仁蛋白抗氧化提升肽具有顯著性影響，并且能顯著提升酶解程度和抗氧化特性，驗(yàn)證了上一節(jié)初步篩選的結(jié)論，為二次酶解篩選抗氧化提升肽的識(shí)別提供第一步依據(jù)。

2.3.2 基于PCA對(duì)二次酶解的監(jiān)控和條件篩選

主成分分析是基于降維的原理，用少數(shù)的綜合變量即主成分來代表原復(fù)雜的多變量，且最大程度保留了原始數(shù)據(jù)代表的信息，顯著降低數(shù)據(jù)的復(fù)雜度，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理[31]。圖8是基于本試驗(yàn)25個(gè)樣品（右縱坐標(biāo)）和6個(gè)變量（指標(biāo)）的主成分分析圖，獲得抗氧化性指標(biāo)與酶解特征指標(biāo)與PC1和PC2的關(guān)系以及對(duì)二次酶解薏苡仁蛋白制備抗氧化提升肽的抗氧化性指標(biāo)與酶解特征的影響。

圖8 不同酶解時(shí)間下不同酶組合的酶水解產(chǎn)物的主成分分析

由圖可直觀看出：第一主成分PC1的貢獻(xiàn)率為83.2，第二成分PC2的貢獻(xiàn)率為10.5。25份樣品呈現(xiàn)2種不同的區(qū)域分布，第一類，DH和Fe2+螯合能力都在第一象限。第二類，DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、·OH清除能力、PR在第四象限。通過皮爾遜相關(guān)系數(shù)與PCA圖的關(guān)系可知，DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、·OH清除能力、PR有較強(qiáng)的相關(guān)性，DH和Fe2+螯合能力有較強(qiáng)的相關(guān)性。F-1和P-3距離6個(gè)指標(biāo)的距離較近，具有較強(qiáng)的相關(guān)性，F(xiàn)-1與6個(gè)指標(biāo)的相關(guān)性強(qiáng)于P-3。綜合PCA結(jié)果分析，F(xiàn)-1與6個(gè)指標(biāo)的相關(guān)性比較強(qiáng)，顯著性高，在第一主成分上的占比高于P-3，篩選F-1作為二次酶解的條件，有利于提高薏苡仁酶解產(chǎn)物的抗氧化性和酶解程度，為二次酶解篩選抗氧化提升肽的識(shí)別提供第二步依據(jù)。

2.3.3 基于差異條形圖對(duì)二次酶解的監(jiān)控和條件篩選

圖9是STAMP軟件特有的誤差線圖，即差異條形圖。如圖所示，把DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、·OH清除能力、Fe2+螯合能力歸為抗氧化特性組，DH和PR歸為酶解程度組。利用這2組綜合指標(biāo)對(duì)25個(gè)樣品進(jìn)行顯著性分析，可以明顯地從圖中看出F-1的抗氧化特性指標(biāo)和酶解程度指標(biāo)的平均含量是最大的，且其p值為0.087，較P-3的0.328更具有顯著性，為二次酶解篩選抗氧化提升肽的識(shí)別提供第三步依據(jù)。

圖9 不同酶解時(shí)間下不同酶組合的酶水解產(chǎn)物的差異條形圖

綜上可知，采用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法可以有效對(duì)二次酶解薏苡仁蛋白肽提升抗氧化性的過程進(jìn)行監(jiān)控和條件篩選，結(jié)合酶解程度和抗氧化特性，對(duì)不同酶以及不同酶解時(shí)間的組合進(jìn)行綜合性的評(píng)判，利用指標(biāo)的樣品的相關(guān)性以及顯著性來確定F-1為最佳酶解產(chǎn)物。

3 結(jié)論

本文以風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和兩者復(fù)合酶酶解薏苡仁粗蛋白6 h的水解物進(jìn)行分析，測(cè)定了它們的DH、PR及4個(gè)抗氧化指標(biāo)，并采用了主成分分析、聚類分析豐度熱圖并結(jié)合誤差線條形圖對(duì)各個(gè)酶解樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，取得了以下結(jié)論：

⑴ 從理化指標(biāo)變化趨勢(shì)初步得到，風(fēng)味蛋白酶處理 1 h與復(fù)合蛋白酶處理 3 h酶解薏苡仁蛋白提升肽的綜合表現(xiàn)差異不顯著，對(duì)薏苡仁蛋白的高效提取均有應(yīng)用價(jià)值；

⑵ 進(jìn)一步，相對(duì)豐度熱圖分析統(tǒng)計(jì)學(xué)量化顯著性特征：F-1和P-3的處理?xiàng)l件都對(duì)酶解薏苡仁粗蛋白制備抗氧化肽具有顯著性影響，并且能顯著提升酶解程度和抗氧化特性；

⑶ 其次，主成分分析構(gòu)建的數(shù)學(xué)模型獲得分析結(jié)論：對(duì)25個(gè)樣品的綜合分析得出F-1為最佳酶解條件，可更為直觀、全面地篩選最佳酶解樣品；

⑷ 誤差線差異條形圖利用氧化特性和酶解程度2組綜合指標(biāo)最后驗(yàn)證F-1的抗氧化特性指標(biāo)和酶解程度指標(biāo)的平均含量最大且最顯著，即選用F-1作為最佳酶解條件。

本研究采用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法可有效對(duì)復(fù)合酶解薏苡仁制備抗氧化提升肽的過程進(jìn)行分析，有利于對(duì)酶解過程中的多種指標(biāo)進(jìn)行綜合篩選，進(jìn)而確立最佳酶解條件。