痛風(fēng)石的微觀結(jié)構(gòu)及化學(xué)成分的測(cè)定

白 雪，張洪博，尹相林2，，姚嵩坡2，，王嘉淇2，，孫雪薇2，，張睿迪，關(guān)寶生2，

（1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.黑龍江省痛風(fēng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 佳木斯 154007；3.佳木斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

痛風(fēng)是由于機(jī)體內(nèi)尿酸分泌增多和（或）排泄障礙導(dǎo)致尿酸鹽逐漸在關(guān)節(jié)周圍沉積伴鈣化，最后形成痛風(fēng)石，局部骨質(zhì)進(jìn)一步被破壞，出現(xiàn)骨侵蝕，并對(duì)關(guān)節(jié)造成不可逆性損傷［1-3］。也有證據(jù)表明，足部或踝部的痛風(fēng)石可能會(huì)導(dǎo)致肌肉活動(dòng)減弱，從而導(dǎo)致肌肉萎縮［4］。據(jù)報(bào)道，全球痛風(fēng)的患病率為0.1%～10.0%，每年發(fā)病率為0.3～6例/1 000人［5］。中國高尿酸血癥相關(guān)疾病診療多學(xué)科專家共識(shí)中提到，我國不同地區(qū)的高尿酸血癥患病率為5.46%～19.30%，痛風(fēng)患病率為0.86%～2.20%［6］，已成為繼糖尿病之后又一常見代謝性疾病。最近，有研究發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)患者死亡率的升高與體內(nèi)痛風(fēng)石的存在有關(guān)［7］。痛風(fēng)主要表現(xiàn)為部分關(guān)節(jié)畸形，反復(fù)發(fā)作的劇烈疼痛，其模式類似于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［8-12］。在痛風(fēng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)中最重要的一項(xiàng)是關(guān)節(jié)腔中是否存在痛風(fēng)石［13］。痛風(fēng)石最先發(fā)于第一跖趾關(guān)節(jié)，隨著病情逐漸加重可能發(fā)生在指、腕、肘及膝等關(guān)節(jié)處［14-16］。有研究發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)石在電鏡下有兩種形態(tài)：一種是柱狀晶體，聚集形成球狀物，被組織包裹；另一種呈顆粒狀，堆積呈現(xiàn)塊狀。另外，痛風(fēng)石樣品中自由水和結(jié)合水約占9%，尿酸成分約占56%，無機(jī)鹽成分約占9%，其他有機(jī)成分約占14%［17］。因此，本研究重點(diǎn)分析痛風(fēng)患者身體不同部位痛風(fēng)石的形貌、化學(xué)成分及所含化學(xué)元素，有利于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制及病理過程，為減輕尿酸鹽誘發(fā)的炎癥反應(yīng)提供理論依據(jù)，為痛風(fēng)診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

痛風(fēng)的診斷參照中國高尿酸血癥與痛風(fēng)診療指南（2019）［18］，3 名研究對(duì)象來自于佳木斯中醫(yī)院，分別從3 名研究對(duì)象的膝關(guān)節(jié)或肘關(guān)節(jié)或足關(guān)節(jié)處取出痛風(fēng)石作為研究樣本，患者簽署知情同意書（倫理委員會(huì)許可證編號(hào)：JMSU-194）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

枸櫞酸溶液（博士德生物有限公司）、無水乙醇（國產(chǎn)分析純）、吐溫-20、β-巰基乙醇（美國Biosharp）、PBS（博士德生物有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 H＆E 染色 將手術(shù)獲得的痛風(fēng)石組織置于4%多聚甲醛中固定，石蠟切片并用伊紅溶液染色，在顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照。

1.3.2 掃描電鏡與能譜分析 將痛風(fēng)石粉末樣品固定于取樣臺(tái)，設(shè)定工作電壓為20 kV，工作距離分別為50、100、200、500 μm，將痛風(fēng)石粉末樣品放大50 倍、100 倍、500 倍觀察其掃描圖像。隨后截取特定區(qū)域進(jìn)行能譜分析，調(diào)整數(shù)值并生成圖譜。

1.3.3 X 熒光分析 設(shè)定測(cè)量時(shí)間為3～5 min，取充分研磨后的痛風(fēng)石粉末置于設(shè)備樣品室中進(jìn)行測(cè)試，并保存分析曲線。

1.3.4 X 射線衍射 取充分研磨后的痛風(fēng)石粉末置于設(shè)備的樣品槽中，設(shè)置合適的衍射條件及參數(shù)，進(jìn)行X 射線粉末衍射，最后記錄其譜圖并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 痛風(fēng)石組織結(jié)構(gòu)觀察

在光學(xué)顯微鏡下觀察，痛風(fēng)石組織被伊紅染成不同程度的紅色，可在鏡下觀察到尿酸鹽結(jié)晶呈針形、放射狀，周圍有成纖維細(xì)胞、多核巨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的包裹。圖1 中黑色箭頭所指為組織中的尿酸鹽結(jié)晶，即為痛風(fēng)石。見圖1。

圖1 不同部位痛風(fēng)石組織的H＆E 染色（200×）Fig 1 H＆E staining of tophi tissues in different parts of human body（200×）

2.2 痛風(fēng)石掃描電鏡觀察

對(duì)痛風(fēng)患者不同部位的痛風(fēng)石進(jìn)行掃描電鏡觀察，結(jié)果顯示，析出相較多的有近似圓形和橢圓形兩種形貌，析出相較亮的是重元素區(qū)，基體較暗的是輕元素區(qū)；圖像中明亮處為痛風(fēng)石，可見痛風(fēng)石均為大小不一的塊狀結(jié)構(gòu)，形狀不規(guī)則，周圍有組織細(xì)胞包裹；全黑處為導(dǎo)電膠。見圖2～4。

圖2 膝關(guān)節(jié)部位痛風(fēng)石掃描電鏡圖像（A.50×；B.100×；C.500×）Fig 2 Scanning electron microscope image of tophi at the knee joint（A.50×；B.100×；C.500×）

2.3 痛風(fēng)石能譜分析

2.3.1 膝關(guān)節(jié)部位痛風(fēng)石所含化學(xué)元素定性分析

對(duì)圖5A 進(jìn)行能譜分析并生成特征譜線，可見該處痛風(fēng)石由C、N、O、Na 及Cl 等元素組成，見圖6A；對(duì)圖5B 進(jìn)行能譜分析并生成特征譜線，可見該處痛風(fēng)石由C、N、O、Na 及Pt 等元素組成，見圖6B。

圖6 膝關(guān)節(jié)部位痛風(fēng)石的掃描電鏡能譜分析特征譜線Fig 6 Characteristic spectrum of the scanning electron microscopy energy spectrum analysis of tophi in the knee joint

2.3.2 膝關(guān)節(jié)部位痛風(fēng)石所含化學(xué)元素定量分析

對(duì)圖5A 進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示析出相中含有C、N、O、Na、Cl 等元素，各原子所占比例見表1；對(duì)圖5B 進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示析出相中含有C、N、O、Na、Pt 等元素，Pt 元素則是由于對(duì)痛風(fēng)石粉末樣品噴金操作摻入，具體各原子所占比例見表2。由上述結(jié)果可知，痛風(fēng)石中的化學(xué)元素以C、N、O、Na為主要，且上述元素均為其主要晶態(tài)成份C5H4N4O3Na 中的元素。

表1 膝關(guān)節(jié)部位痛風(fēng)石圖5A 的定量分析結(jié)果Tab 1 Quantitative analysis results of tophi in the knee joints shown in Figure 5A

表2 膝關(guān)節(jié)部位痛風(fēng)石圖5B 的定量分析結(jié)果Tab 2 Quantitative analysis results of tophi in the knee joints shown in Figure 5B

圖3 肘關(guān)節(jié)部位痛風(fēng)石掃描電鏡圖像（A.100×；B.200×；C.500×）Fig 3 Scanning electron microscope image of tophi at the elbow joint（A.100×；B.200×；C.500×）

圖4 足關(guān)節(jié)部位痛風(fēng)石掃描電鏡圖像（A.100×；B.200×；C.500×）Fig 4 Scanning electron microscope images of tophi in the foot joints（A.100×；B.200×；C.500×）

圖5 膝關(guān)節(jié)部位痛風(fēng)石掃描電鏡圖像（紅色方框區(qū)域?yàn)閽呙桦婄R能譜分析區(qū)域）Fig 5 Scanning electron microscopy image of tophi in the knee joint（the red box area is the analysis area of the scanning electron microscopy energy spectrum）

2.4 痛風(fēng)石X 熒光分析

采用能量色散型X 射線熒光分析儀對(duì)痛風(fēng)患者不同部位的痛風(fēng)石的化學(xué)元素相對(duì)含量進(jìn)行檢測(cè)，因該儀器的檢測(cè)范圍為11Na～92U，故試樣中原子序數(shù)小于11 的元素（如C、H、N、O 等元素）無法檢出，本檢測(cè)結(jié)果僅代表各元素的相對(duì)含量，而不是各元素在樣品中的實(shí)際含量。見表3。

表3 不同部位痛風(fēng)石的X 熒光分析結(jié)果（%）Tab 3 X-ray fluorescence analysis results of different parts of tophi（%）

2.5 痛風(fēng)石X 射線衍射分析

應(yīng)用X 射線衍射對(duì)痛風(fēng)患者不同部位的痛風(fēng)石晶體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)石的主要晶態(tài)成分為尿酸鈉水合物或尿酸二氫鈉水合物。在實(shí)驗(yàn)中，還觀察到許多衍射強(qiáng)度較弱的非晶態(tài)衍射峰，說明還存在少量的非晶態(tài)成分，可能為碳酸鈣或草酸鈣等。見圖7。

3 討論

痛風(fēng)最常影響足和踝關(guān)節(jié)，可導(dǎo)致足部及下肢的疼痛和殘疾，嚴(yán)重影響患者的日常生活能力和生活水平［19-21］。痛風(fēng)患者典型的影像學(xué)表現(xiàn)為邊界清楚的偏心性骨質(zhì)破壞，呈穿鑿狀或囊狀，可見硬化邊，骨質(zhì)破壞邊緣可見懸掛的骨質(zhì)，呈外翹狀突向痛風(fēng)石，嚴(yán)重者可見多個(gè)骨質(zhì)破壞區(qū)相互融合［22-25］。有研究發(fā)現(xiàn)，踝關(guān)節(jié)及膝關(guān)節(jié)韌帶和肌腱處的痛風(fēng)石多呈條塊狀，且鄰近骨質(zhì)呈弧形或波浪狀破壞，周圍軟組織多腫脹［26-29］。痛風(fēng)患者雙能量CT 掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿酸鹽沉積在關(guān)節(jié)內(nèi)、骨表面和骨內(nèi)時(shí)均伴有鄰近骨皮質(zhì)破壞，尿酸鹽晶體沉積對(duì)骨侵蝕有不同程度的促進(jìn)作用，可能導(dǎo)致軟骨損傷，主要表現(xiàn)為抑制軟骨細(xì)胞的活力和功能［30-34］。目前，對(duì)痛風(fēng)的研究主要集中在降血尿酸的藥物方面［18］，對(duì)痛風(fēng)石本身的結(jié)構(gòu)分析、成分性質(zhì)等研究，國內(nèi)罕有報(bào)道。

本研究通過H＆E 染色、掃描電鏡、能譜分析、X熒光分析以及X 射線衍射等多種手段和方法，對(duì)痛風(fēng)患者不同部位痛風(fēng)石的微觀結(jié)構(gòu)及化學(xué)成分進(jìn)行觀察和分析，發(fā)現(xiàn)不同部位的痛風(fēng)石均為不規(guī)則塊狀，呈圓形或橢圓形外貌；對(duì)痛風(fēng)石所含化學(xué)元素的分析結(jié)果顯示，其以C、N、O、Na、Cl 等元素為主，且上述元素均為其主要晶態(tài)成份尿酸鈉水合物（C5H3N4NaO3）和尿酸二氫鈉水合物（C5H2N4Na2O3）中的元素。另外，在檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)石中還存在少量的非晶態(tài)成份，且在X 射線熒光分析中發(fā)現(xiàn)有Ca、K、S、P、Fe、Zn、Cu 等多種元素存在，提示痛風(fēng)石在形成過程中也會(huì)促進(jìn)其他易沉淀物質(zhì)的附著。據(jù)此，可以推測(cè)痛風(fēng)石中可能同時(shí)存在碳酸鈣或草酸鈣等鈣鹽類物質(zhì)，后續(xù)還需更精確地檢測(cè)來確定，進(jìn)而通過痛風(fēng)石的成分來尋找能夠有效溶解痛風(fēng)石的方法。本研究為揭示尿酸鹽誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)，為臨床上進(jìn)一步治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎提供了理論支撐，為改善痛風(fēng)患者的生存質(zhì)量提供了可能。

作者貢獻(xiàn)度說明：

通訊作者為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)者，另外負(fù)責(zé)論文的審校與形式把關(guān)，第一作者、第二作者和第三作者為實(shí)驗(yàn)實(shí)施者，撰寫論文由第一作者負(fù)責(zé)，第四作者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評(píng)估，第五作者進(jìn)行了免疫組化分析，第六作者進(jìn)行了電鏡分析，第七作者負(fù)責(zé)處理數(shù)據(jù)。