基于表型性狀和SRAP標(biāo)記的觀賞用辣椒種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

赫 衛(wèi)，張 慧

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 貴州貴安 550025； 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院 哈爾濱 150069）

觀賞辣椒起源于南美洲熱帶，在明朝時(shí)傳入中國(guó)，最早作為觀賞花卉。辣椒色彩豐富、果形奇特，果形有羊角形、牛角形、球形、櫻桃形、風(fēng)鈴形、指天形、線形、燈籠形等，果色有紅、紫、黃、橙、黑、白、綠等，極具觀賞價(jià)值。觀賞辣椒可應(yīng)用于家庭園藝、花壇及現(xiàn)代農(nóng)業(yè)觀光園，也可開(kāi)發(fā)為禮品蔬菜、辣椒工藝品等。王學(xué)工等探討了觀賞辣椒的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景，認(rèn)為其可用于醫(yī)藥化工產(chǎn)品、辣椒加工產(chǎn)品和辣椒工藝品等。陳紅娜等報(bào)道了觀賞辣椒的應(yīng)用，表明其可用于庭院和室內(nèi)的擺放，還可用于學(xué)?？破罩参飳?shí)物教材。種質(zhì)資源篩選是觀賞辣椒應(yīng)用和新品種選育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。王佳敏等應(yīng)用AHP 法和灰色關(guān)聯(lián)法評(píng)價(jià)了12 份觀賞辣椒果實(shí)的外觀品質(zhì)。趙東風(fēng)等利用隸屬函數(shù)法結(jié)合生理測(cè)定評(píng)價(jià)9 份觀賞辣椒種質(zhì)資源的耐熱性。余文中等分析了50 份觀賞椒種質(zhì)材料的主要農(nóng)藝性狀差異性。目前，觀賞辣椒的研究主要集中在國(guó)內(nèi)外新品種選育、栽培技術(shù)、生理指標(biāo)測(cè)定等方面。采用表型性狀評(píng)價(jià)的方法，對(duì)觀賞辣椒種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀和觀賞性的研究較少。筆者調(diào)查了20 份辣椒材料的33 個(gè)農(nóng)藝性狀，作了相關(guān)性分析，并進(jìn)一步采用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）分子標(biāo)記研究了辣椒間的遺傳關(guān)系，希望為觀賞用辣椒的品種選育提供更為廣泛的親本來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料

選用了20 份辣椒材料（表1，圖1），由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院提供。

圖1 20 份辣椒材料結(jié)果期成株照片

表1 20 份辣椒材料的類型

1.2 性狀調(diào)查

辣椒材料于2014 年在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院試驗(yàn)基地種植，3 月18 日催芽，3 月25 日穴盤育苗，穴盤規(guī)格12 cm×6 cm；5 月25 日定植于大棚中，每個(gè)品種30 株，常規(guī)水肥管理。依據(jù)《辣椒種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》，共選取33 個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中，數(shù)量性狀9 個(gè)，分別為株高、株幅、首花節(jié)位、商品果縱徑、商品果橫徑、果梗長(zhǎng)度、果肉厚、單果質(zhì)量、單株果數(shù)；質(zhì)量性狀24 個(gè)，分別為株型、分枝性、葉節(jié)色、主莖色、莖茸毛、葉形、葉色、花冠色、花藥色、花柱色、花柱長(zhǎng)度、花梗著生狀態(tài)、熟性、青熟果色、老熟果色、果形、果面棱溝、果面特征、果肩形狀、果頂形狀、果基部宿存花萼、外果皮厚薄、胎座大小、果實(shí)橫切面形狀（表2），發(fā)現(xiàn)葉色中有綠葉帶紫脈的新類型。首花節(jié)位、葉節(jié)色、主莖色、莖茸毛、葉形、葉色、花冠色、花藥色、花柱色、花柱長(zhǎng)度、花梗著生狀態(tài)在6 月調(diào)查，株高、株幅、株型、分枝性、單株果數(shù)、青熟果色、果形、果面棱溝、果面特征、果肩形狀、果頂形狀、果基部宿存花萼、熟性在9 月調(diào)查，老熟果色、外果皮厚薄、胎座大小、果實(shí)橫切面形狀、商品果縱徑、商品果橫徑、果梗長(zhǎng)度、果肉厚、單果質(zhì)量在10 月收獲時(shí)調(diào)查。

1.3 SRAP標(biāo)記分析

采用CTAB 法提取辣椒葉片基因組DNA，從已報(bào)道文獻(xiàn)的SRAP 標(biāo)記序列中選取26 對(duì)引物（me1- em2、me1- em3、me1- em4、me1- em5、me1-em6、me1-em7、me1-em11、me2-em2、me2-em4、me2-em7、me2-em9、me2-em10、me3-em1、me3-em7、me4-em4、me5-em2、me5-em5、me5-em7、me6-em3、me7-em4、me7-em6、me8-em1、me8-em3、me8-em5、me9-em1 和me12-em5）

PCR 總反應(yīng)體系20 μL：引物0.30 μmol·L，酶 0.75 U，dNTP 0.20 mmol · L，Mg2.50 mmol · L，模 板DNA 50 ng，ddHO 補(bǔ) 齊20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染法染色。

1.4 數(shù)據(jù)分析

變異系數(shù)CV=SD/AVG×100%，SD 是標(biāo)準(zhǔn)差，AVG 是均值。多樣性指數(shù)Shannon-Weave公式為=－ΣPlnP其中，P是某一表型（比如果形）的第個(gè)性狀值出現(xiàn)的頻率。質(zhì)量性狀的頻率根據(jù)表2 的描述，數(shù)量性狀的頻率根據(jù)平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（）將數(shù)據(jù)分為10 級(jí)，0.5為1 級(jí)，從第1 級(jí)X＜（-2）到10 級(jí)≥（+2），每一級(jí)的相對(duì)頻率用于計(jì)算多樣性指數(shù)。SRAP 引物的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜上同一位置擴(kuò)增條帶的有和無(wú)分別記為“1”和“0”。應(yīng)用Ntsys 2.01 軟件和UPGMA 法進(jìn)行聚類分析，利用SPSS 18.0 和Excel 2017 進(jìn)行相關(guān)性分析和PIC 值統(tǒng)計(jì)。

表2 辣椒質(zhì)量性狀描述

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)量性狀的多樣性分析

對(duì)20 份材料的9 個(gè)數(shù)量性狀進(jìn)行分析（表3），平均變異系數(shù)為52.81%。其中，單果質(zhì)量（116.32%）的變異系數(shù)最大，表明單果質(zhì)量的表現(xiàn)型變異范圍廣，本試驗(yàn)中單果質(zhì)量最大的是一個(gè)短牛角果形的品種，最小的是一個(gè)圓球果形的品種。變異系數(shù)最小的是株幅（19.89%），表明株幅的人工選擇面窄。其余性狀變異系數(shù)分布范圍為29.08%～80.01% ，性狀間變異幅度差別大。9 個(gè)數(shù)量性狀的平均遺傳多樣性指數(shù)為1.74，分布范圍為1.40～1.97。其中，多樣性指數(shù)最大的是株高，最小的是單果質(zhì)量。所選材料中，單果質(zhì)量變化范圍很大，為1.61～75.53 g，但平均值只有15.34 g，說(shuō)明絕大部分材料的單果質(zhì)量小，單果質(zhì)量分布不均勻，這可能是導(dǎo)致單果質(zhì)量多樣性指數(shù)較低的原因。

表3 辣椒數(shù)量性狀統(tǒng)計(jì)

2.2 質(zhì)量性狀的多樣性分析

分析20 份材料的24 個(gè)質(zhì)量性狀（表4），多樣性指數(shù)范圍為0.50～1.89，平均值為0.97。其中，多樣性指數(shù)最高的是青熟果色（1.89），其次是果形（1.88），最低的是花冠色（0.50）。根據(jù)多樣性指數(shù)的意義，發(fā)現(xiàn)辣椒的青熟果色的表現(xiàn)型最多，果形其次，20 份材料共展示了8 種青熟果色和7 種果形。

表4 辣椒質(zhì)量性狀統(tǒng)計(jì)

多樣性指數(shù)與分布頻率有關(guān)。大部分性狀的分布頻率相對(duì)均勻，包括果形和果色。幾個(gè)性狀的分布頻率不均勻：花冠色以白色為主，紫色分布頻率為20%；葉色和主莖色以各種深度的綠色為主，紫色分布頻率分別僅為5%；而葉節(jié)色以紫色和淺紫色為主，綠色分布頻率僅為5%；果肩形狀、果頂形狀、果實(shí)橫切面形狀、分枝性、莖茸毛、花柱長(zhǎng)度的分布頻率不均勻。花冠色只有2 個(gè)表現(xiàn)型，且分布不均勻，因此多樣性指數(shù)最低?；ㄖ彩? 個(gè)表現(xiàn)型，分布十分均勻（白色占50%，紫色占50%）。因此，多樣性指數(shù)較高（0.69）。莖茸毛雖有3 個(gè)性狀，但分布不均勻，這也是其多樣性指數(shù)（0.52）較低的原因。由以上分析可知，所收集資源的果色和果形雖沒(méi)有囊括已知的所有表現(xiàn)型，但表現(xiàn)型多樣且分布均勻，多樣性指數(shù)較高，可滿足品種選育的需求。

2.3 主要農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析

不同組織器官顏色是觀賞用辣椒重要性狀之一。顏色性狀有8 個(gè)，分別為葉節(jié)色、主莖色、葉色、花冠色、花柱色、花藥色、青熟果色和老熟果色。對(duì)33 個(gè)主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行相關(guān)性分析（圖2）表明，花冠色、主莖色、葉色與青熟果色四者彼此呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)＞0.583），花冠色越淺，主莖色、葉色和青熟果色顏色越淺。當(dāng)幾個(gè)品種的花冠色是紫色時(shí)，主莖色以紫色或綠帶紫條紋為主，葉色是紫或綠帶紫脈，青熟果色是紫色。推測(cè)這些品種與其他品種，在花青素的代謝上有所不同。花柱色與老熟果色呈顯著負(fù)相關(guān)（-0.599）；花藥色與主莖色呈顯著正相關(guān)（0.678）；葉節(jié)色與其他顏色性狀無(wú)顯著相關(guān)。

圖2 辣椒主要農(nóng)藝性狀相關(guān)性

果形是觀賞用辣椒又一重要性狀。調(diào)查了果實(shí)形態(tài)的13 個(gè)性狀（圖2）。結(jié)果表明，果形與果頂形狀（-0.487）、商品果縱徑（-0.593）、果梗長(zhǎng)度（-0.458）呈顯著負(fù)相關(guān)；商品果縱徑（0.484）、果梗長(zhǎng)度（0.618）與果面特征呈顯著正相關(guān)；果頂形狀與果面棱溝（0.499）、果肩形狀（0.476）呈顯著正相關(guān)；果面棱溝與商品果橫徑（0.573）、果實(shí)橫切面形狀（0.725）呈顯著正相關(guān)；果肩形狀也與商品果橫徑（0.552）、果實(shí)橫切面形狀（0.685）呈顯著正相關(guān)；果基部宿存花萼與果肩形狀（-0.565）、商品果橫徑（-0.633）、果肉厚（-0.538）、果實(shí)橫切面形狀（-0.493）呈顯著負(fù)相關(guān)，與果面特征（0.502）、商品果縱徑（0.463）呈顯著正相關(guān)；外果皮厚薄與果面棱溝（-0.629）呈顯著負(fù)相關(guān)，與胎座大?。?.614）呈顯著正相關(guān)。

由上述分析可知，在篩選辣椒種質(zhì)資源時(shí)，需要注重各主要農(nóng)藝性狀之間的相關(guān)性。綜合各性狀來(lái)提高辣椒觀賞性，以求得到兼具多種優(yōu)良性狀的種質(zhì)資源，為觀賞用辣椒品種選育奠定基礎(chǔ)。

2.4 辣椒品種間的遺傳關(guān)系分析

以20 份辣椒種質(zhì)資源為材料，進(jìn)行了相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）分析（表5）。結(jié)果表明，26個(gè)引物組合共擴(kuò)增出305 條清晰條帶。其中，多態(tài)性條帶為82 條，每一引物組合擴(kuò)增到5～20 條，平均11.7 條；其中，有多態(tài)性條帶為1～8 條，平均3.2條，位點(diǎn)多態(tài)性信息含量PIC 變幅為0.093～0.935，平均為0.641。表現(xiàn)多態(tài)性的條帶占總擴(kuò)增條帶的26.89%。引物me2-em9、me1-em6 擴(kuò)增的條帶多，多態(tài)性豐富，可以有效地區(qū)分材料的差異。

表5 SRAP 標(biāo)記統(tǒng)計(jì)

20 份材料的農(nóng)藝性狀差異很大。因此，通過(guò)分子標(biāo)記來(lái)分析它們之間的親緣關(guān)系。根據(jù)26 對(duì)SRAP 引物的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析（圖3），表明辣椒材料相互分開(kāi)，在相似系數(shù)0.64 處可以將20份供試材料分為5 個(gè)類群。

圖3 20 個(gè)辣椒品種聚類圖

Ⅰ類，5 個(gè)品種聚在這一類，主要表現(xiàn)為單果質(zhì)量偏小，果實(shí)偏小，無(wú)莖茸毛，花柱長(zhǎng)于雄蕊，果面光滑，果頂鈍圓。

Ⅱ類包括3 個(gè)品種，主要表現(xiàn)為無(wú)莖茸毛，白色花冠和花柱，果面光滑，果頂鈍圓，果基部宿存花萼平展，商品果橫徑長(zhǎng)，果實(shí)橫切面不規(guī)則，老熟果紅色。

Ⅲ類，9 個(gè)品種，其農(nóng)藝性狀包括了絕大部分表現(xiàn)型。

Ⅳ類，2 個(gè)品種，綠葉藍(lán)花藥，花梗下垂，無(wú)果肩，鈍圓果頂，果基部宿存花萼下包，商品果縱徑長(zhǎng)，果實(shí)羊角形，果實(shí)橫切面近圓形。ICPN21-07（編號(hào)16）是青熟果乳黃色，單果較重、熟期最晚；B1436（編號(hào)13）是青熟果墨綠色。

Ⅴ類，1 份材料為丑妞（編號(hào)19），青熟果色黃綠，老熟果色橙黃，果實(shí)橫切面不規(guī)則，果面棱溝深，果形似長(zhǎng)錐形呈皺縮形態(tài)。

3 討論與結(jié)論

辣椒主要農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)分析表明，單果質(zhì)量變異系數(shù)最大，果實(shí)的大小是主要觀賞點(diǎn)之一，可以利用性狀的變異幅度選育新品種。多樣性分析表明，20 份辣椒種質(zhì)具有較豐富的形態(tài)多樣性，其33 個(gè)性狀的遺傳多樣性指數(shù)平均為1.16。數(shù)量性狀的多樣性指數(shù)數(shù)值相對(duì)比較集中，分布范圍為1.40～1.97。其中，多樣性指數(shù)最大的是株高，最小的是單果質(zhì)量。說(shuō)明了變異系數(shù)和多樣性指數(shù)沒(méi)有絕對(duì)的正負(fù)相關(guān)關(guān)系，與李寧等得出的結(jié)論一致。質(zhì)量性狀的多樣性指數(shù)中最高的是青熟果色（1.89），表現(xiàn)型最豐富，其次是果形（1.88），最低的是花冠色（0.50）。徐睿等也得出相似結(jié)果，對(duì)40 份觀賞辣椒種質(zhì)資源的主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量性狀中果形的多樣性指數(shù)最高，表現(xiàn)型最豐富。果色和果形也都是主要的觀賞點(diǎn)，豐富多樣的性狀可滿足人們的觀賞需求。辣椒作為觀賞品種，選育的主要觀賞性狀是果形和顏色，果形和青熟果色多樣性指數(shù)高，揭示所選材料多樣性豐富，有選育和改良的空間。性狀間的相關(guān)性分析結(jié)果表明，果形、果肩形狀、果基部宿存花萼、商品果縱徑、商品果橫徑、果實(shí)橫切面形狀與多種性狀顯著相關(guān)，性狀之間聯(lián)系緊密。因此，要提高辣椒的觀賞性，特別是果形的觀賞性，可以以這6個(gè)性狀為主進(jìn)行選育；要提高辣椒的果色的觀賞性，若育種目標(biāo)是改變青熟果色，需要關(guān)注花冠色、主莖色、葉色；若育種目標(biāo)是改變老熟果色，需要關(guān)注花柱色。在觀賞用辣椒品種選育過(guò)程中，可將上述性狀作為優(yōu)先篩選目標(biāo)。

筆者采用SRAP 標(biāo)記明確區(qū)分了20 個(gè)辣椒品種，有研究表明，SRAP 標(biāo)記可以用來(lái)進(jìn)行辣椒種質(zhì)資源間的遺傳多樣性分析或品種鑒定。SRAP標(biāo)記揭示了品種間的親緣關(guān)系，對(duì)20 份辣椒種質(zhì)資源聚類分析發(fā)現(xiàn)，遺傳相似系數(shù)為0.54，遺傳進(jìn)化關(guān)系比較遠(yuǎn)，可以應(yīng)用雜交技術(shù)選育品種。西安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心已經(jīng)經(jīng)過(guò)收集、自交純化、篩選和雜交這一過(guò)程培育出觀賞椒雜交新品種。本文的品種已經(jīng)經(jīng)過(guò)收集和純化，在篩選后可通過(guò)雜交技術(shù)培育新品種。如紫簇星（編號(hào)4）和B144（編號(hào)19）的相似系數(shù)最高，遺傳進(jìn)化關(guān)系最近，兩個(gè)品種都是紫色花冠，紫色青熟果，鮮紅色老熟果。丑妞（編號(hào)17）的花冠是紫色，青熟果是黃綠色，老熟果是橙黃色。丑妞與紫簇星或B144 的遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)，可以通過(guò)雜交改良花冠色和果色。20 份辣椒種質(zhì)資源材料的多樣性指數(shù)說(shuō)明了觀賞性相關(guān)辣椒品種有較豐富的遺傳多樣性，聚類分析也表明亞組間和亞組內(nèi)的表現(xiàn)型豐富，多樣性高。余文中等同樣通過(guò)50 份材料的遺傳多樣性分析，結(jié)果表明觀賞性辣椒種質(zhì)材料的性狀存在較大的差異性。說(shuō)明觀賞辣椒多樣性豐富，為品種選育提供了較多的選擇。筆者用26 對(duì)具有多態(tài)性SRAP 標(biāo)記進(jìn)行聚類分析，鑒定區(qū)分辣椒品種，并建立品種間的親緣關(guān)系，為觀賞用辣椒品種選育提供理論支持。