人工模擬寒冷環(huán)境對呼吸道合胞病毒感染幼鼠肺組織中病毒載量及肺損傷的影響

張秀英，王雪峰，王 蕾，趙航宇，穆婧雯，劉 清，楊夢飛

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032)

呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒急性下呼吸道感染最常見的病原，常引發(fā)病毒性肺炎和毛細(xì)支氣管炎，是兒童生命健康的重大威脅之一[1-2]。RSV感染有明顯的季節(jié)性，北方地區(qū)多在寒冷季節(jié)流行，南方地區(qū)多在濕度大的季節(jié)流行，說明RSV病毒的傳播與氣溫、相對濕度密切相關(guān)[3-4]。目前寒冷氣候條件對肺組織RSV載量及肺損傷的影響程度尚不清晰，因此本實驗以幼鼠為研究對象，借助人工氣候箱模擬外界寒冷氣候進行了相關(guān)研究。

1 實驗材料與方法

1.1病毒 RSV-long株，首都兒科研究所提供，凍存于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病毒室，半數(shù)組織培養(yǎng)感染量為10-3。

1.2動物 SPF級SD雌性大鼠18只，鼠齡3～4周，體重60～80 g，購自武漢大學(xué)，動物合格證號：2021-0065。飼養(yǎng)于恒溫、恒濕動物房，溫度保持(23±2)℃，濕度(50±6)%，自由飲水、攝食。本實驗按照《實驗動物使用管理指南》(中國，2011年) 進行。

1.3主要儀器 全外排Ⅱ級生物安全柜(BSC-1300II B2，西班泰克)；精密輪轉(zhuǎn)切片機(LEiCA RM2016，上海徠卡儀器有限公司)；石蠟包埋機(JB-L5，武漢俊杰電子有限公司)；系統(tǒng)生物顯微鏡(Nikon YS100，Nikon)；低溫高速離心機(SCT-12 SCILOGCX)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad熒光定量PCR儀CFX96，美國伯樂)；RT-PCR試劑盒(反轉(zhuǎn)錄試劑盒：ABScript Ⅲ RT Master Mix for qPCR with gDNA remover；qPCR試劑盒：ABclonal 2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix)；人工氣候箱(恒溫恒濕試驗箱HD-E702-800，海達儀器)；移液器(Finnpipette)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(武漢一恒蘇凈科學(xué)儀器有限公司，37 ℃)；洗板機(Tianshi，988洗板機)；酶標(biāo)儀(Rayto，RT-6100，450 nm波長)；恒溫?fù)u床(HT-111B，上海赫田)；電子天平(1.120 g/0.1 mg電子分析天平，AE1204型，上海良平)；電子分析天平(XB220A型，瑞士PRECISA)；攪拌器(81-2恒溫磁力攪拌器)；細(xì)胞破碎儀(EasyWeLL系列，JY98-ⅢN型)；白細(xì)胞介素-8(IL-8)ELISA試劑盒(武漢傲星生物科技有限公司，AX1571)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(武漢傲星生物科技有限公司，AX29322)。

1.4實驗方法 幼齡大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為對照組、RSV感染組、RSV感染+寒冷環(huán)境組，每組6只。對照組幼鼠給予生理鹽水滴鼻，常溫下飼養(yǎng)；RSV感染組幼鼠給予RSV滴鼻感染，常溫下飼養(yǎng)；RSV感染+寒冷環(huán)境組幼鼠給予RSV滴鼻感染后4 h放入制備寒環(huán)境氣候的人工氣候箱[溫度(6±2)℃]，每天刺激4 h，其余時間正常環(huán)境飼養(yǎng)，連續(xù)刺激7 d。各組幼鼠均自由進食飲水。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1肺組織中RSV病毒載量 7 d刺激結(jié)束后，禁食1 d，無菌摘除大鼠肺臟，每只各取30 mg肺組織在液氮中充分研磨，研磨時加入1 mL Trizol，用勻漿器勻漿處理。從NCBI GenBank下載基因序列，用Primer premier 5.0軟件進行序列分析并設(shè)計引物，依據(jù)引物優(yōu)化原則確定引物的Tm值、GC含量及3’末端穩(wěn)定性等基本參數(shù)[3]，引物由武漢金開瑞生物科技有限公司合成。RSV引物序列：上游5’-AACTAATGCATTGGCTAAGG-3’，下游5’-TTGTAACACTGGCATTGTTG-3’，產(chǎn)物大小為548 bp。參照物為GAPDH，上游5’-GACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3’，下游5’-TGGAAATTGTGAGGGAGATGC-3’，產(chǎn)物大小為336 bp。提取總RNA，計算總RNA含量。RNA純度A260/A280在1．8～2.2范圍內(nèi)?；蚪MDNA去除體系:5 μL 200 ng/L total RNA，2.0 μL 5×g DNA Eraser Buffer，1.0 μL gDNA Eraser，2.0 μL RNase Free dH2O，反應(yīng)體系10 μL 。PCR 儀反應(yīng)條件:42 ℃ 2 min，4 ℃保存。RT反應(yīng)體系：2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 10 μL，DNA模板1 μL，正向引物(10 μmol/L)0.4 μL，反向引物(10 μmol/L)0.4 μL，ddH2O to 20 μL；反應(yīng)過程：預(yù)變性95 ℃ 3 min，循環(huán)反應(yīng)(變性95 ℃ 5 s，退火/延伸58 ℃ 30 s，循環(huán)50次)。反應(yīng)結(jié)束后通過熔解曲線分析來鑒定PCR產(chǎn)物的特異性。使用Sequence Detection System軟件分析PCR過程各檢測樣本的Ct值。

1.5.2肺濕干比 取各組大鼠左側(cè)肺組織，濾紙吸干血跡后稱濕重，然后置于60 ℃烤箱中烘烤72 h，再稱干重，計算出肺濕干重比。

1.5.3肺組織病理檢查 取各組大鼠左側(cè)肺臟，經(jīng)4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，連續(xù)切片，脫蠟，HE染色后鏡下觀察。每張切片隨機選高倍視野5個，根據(jù)肺泡充血、出血、血管壁中性粒細(xì)胞浸潤和肺泡間隔增厚的程度進行病理學(xué)評分，4項指標(biāo)得分相加為總分[5]。

1.5.4肺泡灌洗液中炎性因子含量 大鼠處死后，分離主支氣管，結(jié)扎右主管，注射器抽取0.5 mL生理鹽水注入主氣管，然后回抽，反復(fù)操作3次，收取1.5 mL肺泡灌洗液，然后離心收集上清液。按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-8、TNF-α含量。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 用GraphPad Prism8軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析作圖，組間差異比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肺組織RSV載量比較 RSV感染組、RSV感染+寒冷環(huán)境組大鼠肺組織中RSV載量均明顯高于對照組(P均<0.05)，且RSV感染+寒冷環(huán)境組明顯高于RSV感染組(P<0.05)。見圖1。

圖1 對照組和呼吸道合胞病毒感染7 d各組大鼠肺組織病毒載量

2.2各組大鼠肺濕干比比較 RSV感染組、RSV感染+寒冷環(huán)境組大鼠肺濕干比均明顯高于對照組(P均<0.05)，且RSV感染+寒冷環(huán)境組明顯高于RSV感染組(P<0.05)。見圖2。

圖2 對照組和呼吸道合胞病毒感染7 d各組大鼠肺濕干比

2.3各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及肺組織病理損傷評分比較 對照組大鼠肺組織未見異常變化；RSV感染組大鼠肺泡壁輕度或中度充血、水腫，肺泡壁增厚，管腔內(nèi)可見炎性滲出物；RSV感染+寒冷環(huán)境組肺泡壁重度充血、水腫，肺泡壁明顯增厚，管腔內(nèi)可見大量炎性滲出物。RSV感染組、RSV感染+寒冷環(huán)境組肺組織病理損傷評分均明顯高于對照組(P均<0.05)，且RSV感染+寒冷環(huán)境組明顯高于RSV感染組(P<0.05)。見圖3及圖4。

圖3 對照組和呼吸道合胞病毒感染7 d各組大鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×200)

圖4 對照組和呼吸道合胞病毒感染7 d各組大鼠肺組織病理評分

2.4各組大鼠肺泡灌洗液中炎性因子含量比較 RSV感染組、RSV感染+寒冷環(huán)境組大鼠肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α含量均明顯高于對照組(P均<0.05)，且RSV感染+寒冷環(huán)境組均明顯高于RSV感染組(P均<0.05)。見圖5。

圖5 對照組和呼吸道合胞病毒感染7 d各組大鼠肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α含量

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為傳染性疾病為六氣所化六淫所致，即氣候、致病因子、正氣的強弱等多種因素共同作用導(dǎo)致宿主、病毒、環(huán)境之間的相關(guān)性失衡所引發(fā)[6-7]。寒邪傷衛(wèi)陽，衛(wèi)陽被遏不能奮起抗邪，驅(qū)邪外出，導(dǎo)致病毒在體內(nèi)大量繁殖。“寒凝則血澀”，寒冷環(huán)境下呼吸道毛細(xì)血管痙攣、血流減慢，有利于病毒繁殖。現(xiàn)代研究顯示寒冷環(huán)境下病毒活性增強，其在外界環(huán)境中的存活時間延長[8]。本實驗使用人工氣候箱模擬寒邪環(huán)境，結(jié)果顯示RSV感染組、RSV感染+寒冷環(huán)境組大鼠肺組織中RSV載量、肺濕干比、肺組織病理損傷評分均明顯高于對照組，且RSV感染+寒冷環(huán)境組均明顯高于RSV感染組；病理觀察發(fā)現(xiàn)肺組織病理損傷明顯，且RSV感染+寒冷環(huán)境組更明顯。提示寒冷環(huán)境下肺組織中RSV病毒載量大，肺損傷更明顯。

既往研究認(rèn)為，高載量的病毒在肺內(nèi)復(fù)制，被氣道上皮細(xì)胞模式識別受體如Toll 樣家族受體、胞內(nèi)病毒傳感器視黃酸誘導(dǎo)基因1樣受體和核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體識別，釋放大量炎癥因子及趨化因子，誘發(fā)“炎癥因子風(fēng)暴”，破壞氣道上皮細(xì)胞，導(dǎo)致肺免疫病理損傷[9-12]。TNF-α和IL-8與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)[13]。TNF-α是炎癥早期機體分泌的主要炎性因子，可促使中性粒細(xì)胞向肺泡和肺間質(zhì)聚集，其過量分泌可釋放溶酶體、氧自由基和髓過氧化物酶等而損傷肺組織；其還可產(chǎn)生血小板活化因子，增加肺血管壁通透性[14]。IL-8 是介導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集的趨化因子，參與炎癥反應(yīng)[15]。本實驗結(jié)果顯示，RSV感染組、RSV感染+寒冷環(huán)境組大鼠肺泡灌洗液中IL-8、TNF-α含量均明顯高于對照組，且RSV感染+寒冷環(huán)境組均明顯高于RSV感染組。說明RSV感染、RSV感染聯(lián)合寒冷環(huán)境刺激均可導(dǎo)致IL-8和TNF-α釋放，RSV感染聯(lián)合寒冷環(huán)境刺激可引起二者大量釋放，進而引起嚴(yán)重的肺損傷。

綜上所述，寒冷環(huán)境對RSV誘導(dǎo)肺損傷時病毒載量、肺濕干比、病理損傷及相關(guān)細(xì)胞因子均有明顯影響，肺組織中的RSV含量及肺損傷的程度與寒邪環(huán)境密切相關(guān)，提示疾病的產(chǎn)生不是致病因子單一作用的結(jié)果，與“天地人”這一生態(tài)系統(tǒng)的相互作用密切相關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。