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      球形與立方體納米銀對斜生柵藻毒性差異研究

      2022-02-17 13:36:42李海波鄧寧燦
      關鍵詞:斜生柵藻葉綠素

      李海波, 柴 睿, 鄧寧燦, 楊 悅

      (東北大學資源與土木工程學院, 沈陽 110819)

      金屬及氧化物納米材料一般都具有細胞毒性,毒性大小決定于納米材料的質量濃度、形狀、表面電荷性質等[1]。 納米銀(Nano Silver Particles,AgNPs)通過生產、處置和排放等各個過程進入環(huán)境而導致直接或潛在的生物毒性的情況已被大量報道[2]。

      存在于水體中的AgNPs可能因物理、化學和生物等作用而轉化/降解,并且納米材料之間會發(fā)生團聚與分散的行為,甚至發(fā)生形貌轉化,進而影響其環(huán)境歸趨及遷移轉化,并最終深刻影響其生物毒性[3]。而元素的不同形態(tài)在很大程度上影響著它們的毒性強弱,其形態(tài)的不同使機體對元素的吸收、分布、排泄產生很大差異,生物效應和致毒作用也不同[4]。大量研究表明:即使納米材料的組成元素相同,但是其形貌、尺寸的差異也會對其生物學效應產生較大影響[5]:石墨烯納米片的尺寸是影響其毒性的一個重要因素[6];三氧化鎢(WO3)納米棒的尺寸效應影響其對肝臟和腎臟的毒性效應[7];棒狀納米氧化鋁對大鼠腦星形膠質細胞毒性的影響作用明顯強于片狀納米氧化鋁[8]。同時,制備所得的納米銀的形狀、尺寸和聚集度等理化性質存在一定差異,不同的合成流程對納米銀的理化性質也有很大影響,而理化性質又直接影響其毒性[9-11]。雖然AgNPs可致生物毒性已獲學界共識,如HE等[12]證實AgNPs會對藻類生長產生影響,DAVID和ABDALLAH[13]認為AgNPs抑制藻類的光合系統(tǒng)。但AgNPs形態(tài)與毒性效應之間的關系尚不十分清楚,其致毒的誘導途徑、傳遞路徑、分子過程及解毒機制均與其微觀形態(tài)有關。

      為此,本文擬對比球形AgNPs(Silver nanosphere,AgNSs)和立方體AgNPs(Silver nanoscube,AgNCs)對斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)的毒性效應差異,包括對藻密度、葉綠素a(Chlorophyll a)的質量濃度、活性氧(ROS)含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響,以期為AgNPs排放控制提供基礎數據。

      1 材料與方法

      1.1 實驗材料

      斜生柵藻(Scenedesmusobliquus):購自中國科學院淡水藻種庫(FACHB),標號(FACHB-417)。在進行暴露實驗前將斜生柵藻培育至對數生長期,并在培育過程中將其在680 nm處的UV-Vis的光密度值(A680)與對應的藻密度擬合得到關系曲線。

      AgNPs:實驗室自制。

      1.2 實驗方法

      1.2.1 2種形貌的AgNPs的制備及表征 參考并改良劉錦濤等[14]的制備方法,得到AgNSs和AgNCs:以銀氨溶液為前驅體、聚乙烯吡絡烷酮(PVP)溶液為保護劑、葡萄糖溶液為還原劑,在一定條件下制備得到AgNSs;將硝酸銀溶液為前驅體、PVP溶液為保護劑、葡萄糖溶液為還原劑,并以氯化鎂溶液為刻蝕劑,利用氧化還原反應制備得到AgNCs。將制備所得的AgNSs和AgNCs在波長為200~600 nm的區(qū)間進行紫外-分光光度計(HACH DR6000,USA)分析,并通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM,Carl Zeiss AG,ULTRAPLUS)表征形貌和粒徑。

      1.2.2 暴露實驗方法 KIM等[15]的研究表明AgNPs 能抑制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌菌落的生長,且質量濃度為10 mg/L的AgNPs對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的菌落形成有明顯抑制效應。因此,本次實驗中的AgNPs的質量濃度梯度的中間值設為10 mg/L。

      取處于對數增長期的斜生柵藻,在無菌環(huán)境下接種至BG-11培養(yǎng)基[16]中進行擴大培養(yǎng); 然后參照OECD201藻類生長抑制實驗方法[17],將同一批次的斜生柵藻等量接種在滅菌后的三角錐形瓶中;再分別加入定量AgNSs、AgNCs母液,使錐形瓶中的最終質量濃度分別為5、10、15、20 mg/L,且各質量濃度組設3個平行樣,并設置對照組(0 mg/L);在溫度為25 ℃、光暗周期比為12 h∶12 h的光照培養(yǎng)箱中暴露一定時間后,測定藻中葉綠素a的質量濃度、ROS含量、MDA含量和SOD活性,并分析這些指標隨AgNPs劑量及暴露時間的變化,以探明AgNPs對斜生柵藻的毒性效應。

      1.2.3 分析測定方法 藻密度測定:每24 h取一定量未受試藻液,先利用紫外分光光度計測定其在680 nm處的光密度值(A680),再用血球計數板進行計數(熒光顯微鏡,Olympus,BX53),建立此批次斜生柵藻的藻密度與光密度之間的線性關系;每12 h取一定量受試藻液并測定其A680,通過藻密度與吸光度之間的關系計算每個樣品的藻密度。

      葉綠素a 的質量濃度測定采用紫外-分光光度法[18],ROS含量的測定采用DCFH-DA法[19],MDA含量的測定采用過硫代巴比妥酸法[20],SOD活性的測定采用NBT光還原法[18]。

      2 結果與討論

      2.1 AgNPs的結構表征

      對制備得到的AgNPs進行UV-Vis分析及FE-SEM觀察。由AgNSs、AgNCs的吸收光譜圖(圖1)可知:吸收曲線的最大吸收峰均在420 nm左右,證實了制備所得均為單質銀溶液。由AgNSs、AgNCs的SEM照片(圖2)可知:AgNSs的粒徑約50 nm,呈球型;AgNCs粒徑約1 μm,呈立方體型。

      圖1 AgNSs 和 AgNCs的紫外可見吸收光譜Figure 1 The UV-Vis absorption spectrogram of AgNSs and AgNCs

      圖2 AgNSs 和 AgNCs的SEM照片Figure 2 The SEM pictures of AgNSs and AgNCs

      2.2 AgNPs對斜生柵藻的毒性效應

      2.2.1 AgNPs對斜生柵藻的生長抑制效應 在不同質量濃度的AgNSs、AgNCs暴露處理下,觀察同一批次的斜生柵藻密度的變化。由結果(圖3)可知:AgNSs、AgNCs對斜生柵藻的生長均產生了一定的影響,但其影響效應存在差異。具體表述如下:

      (1)由圖3A可知,在不同暴露時間下,各實驗組的藻密度均低于其相應對照組的藻密度。當斜生柵藻暴露于質量濃度為5 mg/L的AgNPs時,藻密度隨暴露時間的增加而增加;當AgNSs的質量濃度分別為10、15、20 mg/L時,藻密度并未隨著毒物濃度、暴露時間的變化而變化,即在宏觀上可認為斜生柵藻在該條件下基本停止生長。AgNSs對斜生柵藻的長期作用表現出毒物興奮效應:當化學品劑量較低時會對機體產生刺激作用(如生長、繁殖);當化學品劑量稍高時會產生毒性抑制作用[21]。

      (2)由圖3B可知,當暴露時間為12 h時,所有質量濃度組的藻密度相較于對照組均有所增加,且藻密度隨著AgNPs的質量濃度的增大而增大。即在較短暴露時間下,AgNCs表現出的弱毒性會刺激斜生柵藻的生長。當暴露時間大于12 h后,AgNCs對斜生柵藻的生長有明顯的抑制作用,藻在宏觀上呈現停止生長的狀態(tài)。AgNPs在水環(huán)境中所表現出的抑菌性主要由其游離出的Ag+決定[22]。有研究[11]表明,粒徑>50 nm的AgNPs釋放Ag+的速率低,但持續(xù)時間長,像穩(wěn)定的Ag+排放源。因此,AgNCs可能在較短暴露時間(12 h)內所釋放的Ag+的質量濃度較小,即使在20 mg/L下,所釋放的Ag+的質量濃度仍在藻可抵抗的范圍內。 藻受到毒性物質脅迫時,酶活性增強、代謝速率提高以抵抗毒物,從而導致繁殖速率加快,藻密度增大[23]。而隨著暴露時間的增長(>12 h),因AgNCs的持續(xù)釋放,Ag+的質量濃度超過了斜生柵藻所能承受的閾值,表現出生長抑制效應。

      圖3 不同質量濃度的AgNSs和AgNCs對斜生柵藻密度的影響Figure 3 The effects of different concentrations of AgNSs and AgNCs on the density of Scenedesmus obliquus

      從研究結果來看,這2種形貌的AgNPs均影響藻類的生長:AgNSs對斜生柵藻的生長有毒物興奮效應;AgNCs對藻類表現出暴露時間較短時促進生長、暴露時間較長時抑制生長的現象。這2種形貌的AgNPs在藻類生長上所表現出的差異性可能是其尺寸不同所導致的Ag+環(huán)境濃度差異引起的。

      2.2.2 AgNPs對斜生柵藻葉綠素a的質量濃度的影響 葉綠素a在實驗室培養(yǎng)條件下與藻細胞生物量有著顯著的正相關關系,可間接反映生物量指標[23]。在本研究中,葉綠素a的質量濃度除了能體現宏觀生物量的變化趨勢外,也能反映AgNPs對斜生柵藻光合系統(tǒng)的影響。

      在不同質量濃度的AgNSs、AgNCs暴露下,觀察斜生柵藻中葉綠素a的質量濃度的變化情況。由結果(圖4)可知:所有實驗組的葉綠素a的質量濃度與其對應的對照組相比均顯著降低,但也存在較大差異。說明AgNPs嚴重影響了斜生柵藻的光合作用,體現出毒性抑制效應。且如圖3和圖4所示,各實驗組斜生柵藻的藻密度與葉綠素a的質量濃度間具有明顯的同步增減關系,究其原因為:藻類依賴光合作用攝取生長代謝所需物質,葉綠素a的質量濃度高則藻細胞密度大,反之亦然,因此,AgNPs脅迫對葉綠素a的質量濃度所造成的影響,必然會在藻細胞密度的變化上得到對應體現。

      由圖4A可知:在質量濃度為5 mg/L的AgNSs的脅迫下,葉綠素a的質量濃度隨暴露時間的增長而增加,在宏觀生物量上呈現毒物興奮效應;當AgNSs的質量濃度為10、15、20 mg/L時,葉綠素a的質量濃度一直保持較低水平,葉綠體處于不活躍狀態(tài),以致在宏觀上體現出藻密度基本不變的情況。由圖4B可知:實驗組葉綠素a的質量濃度均低于相應對照組的。AgNCs的質量濃度僅為5 mg/L時就能顯著抑制葉綠素a;而在20 mg/L的質量濃度下,抑制效應有所緩解,此現象的產生是由于更高濃度的毒物刺激使藻細胞做出了更激烈的應激反應。雖然粒徑>50 nm 的AgNPs緩慢釋放的Ag+會隨時間積累,但這種毒性的積累仍在細胞可抵御的范圍內,即葉綠素a的質量濃度在較高濃度的毒物脅迫下有上升趨勢。這種暴露時間所表現出的環(huán)境毒性差異比在藻密度上的體現更明顯。

      圖4 不同質量濃度的AgNSs和AgNCs 對斜生柵藻中葉綠素a質量濃度的影響Figure 4 The effects of different concentrations of AgNSs and AgNCs on Chlorophyll-a content in Scenedesmus obliquus

      綜上分析,2種形貌的AgNPs均導致了葉綠素a質量濃度的下降,說明藻細胞的色素分子因受損或其合成代謝受到抑制,影響了藻類的光合系統(tǒng)。當毒物脅迫時的質量濃度進一步增加時,可能會形成大量活性氧(ROS),從而進一步破壞色素的結構和功能[23]。但AgNSs和AgNCs在尺寸上的差異性使其對葉綠素a的抑制程度不同,這在藻密度上也有對應體現。

      2.2.3 典型酶應激反應

      (1)AgNPs對ROS含量的影響。ROS是具有氧化性的含氧分子,具有很強的化學反應活性,可用于表征對生物體引起的化學損傷[24]。ROS的累積會抑制細胞生長,破壞細胞結構、脂質、蛋白質和核酸,最終導致細胞死亡[25]。但在污染物的質量濃度較低時,在污染物刺激下,ROS的產生會受到抑制,是一種環(huán)境脅迫下的自我保護反應[25]。暴露于不同質量濃度的AgNSs和AgNCs 48 h后,斜生柵藻中ROS含量的變化(圖5)顯示:

      圖5 不同質量濃度的AgNSs和AgNCs對斜生柵藻中ROS含量的影響Figure 5 The effects of different concentrations of AgNSs and AgNCs on ROS content in Scenedesmus obliquus

      ①各實驗組的ROS含量均小于對照組的。正常情況下,藻細胞內ROS的產生和清除處于一個平衡狀態(tài),且為了防止因環(huán)境脅迫而打破這種平衡態(tài),藻細胞的抗氧化系統(tǒng)介入,更多的抗氧化酶在胞內合成以抵制脅迫[23]。而本實驗結果發(fā)現,在2種形貌的AgNPs脅迫下,藻細胞內ROS的清除較其產生更為活躍。這一結果說明斜生柵藻可能有其他的機制來耐受污染物[26],同時這種機制在作用的過程中會刺激細胞的抗氧化系統(tǒng),而受刺激產生的抗氧化酶可能會參與或加速ROS的分解,以致ROS含量下降。

      ②同質量濃度下,AgNSs實驗組的ROS含量均小于AgNCs實驗組的。已有研究[27-28]表明,納米ZnO的比表面積越高,粒徑越小,其抗菌活性往往更強。而AgNSs的比表面積大于AgNCs的,且實驗所用的AgNSs的粒徑小于AgNCs的,由此推斷AgNSs對藻細胞具有更強的刺激性,這種刺激表現為ROS含量的下降。

      (2)AgNPs對MDA含量的影響。當藻類受到環(huán)境脅迫時,細胞內酶系統(tǒng)產生的ROS能夠引發(fā)脂質過氧化,并促進合成脂質過氧化物,而MDA就是一種脂質過氧化物[24]。MDA含量可以反映機體脂質過氧化的程度,間接反映細胞的損傷程度[25]。暴露于不同質量濃度的AgNSs和AgNCs 48 h后,斜生柵藻中MDA含量的變化(圖6)顯示:

      圖6 不同質量濃度的AgNSs和AgNCs對斜生柵藻中MDA含量的影響Figure 6 The effects of different concentrations of AgNSs and AgNCs on MDA content in Scenedesmus obliquus

      ①與對照組相比,AgNPs對斜生柵藻中MDA的產生有明顯的抑制作用。受AgNSs脅迫的實驗組,MDA含量有明顯的劑量-效應關系。對于經AgNCs處理的斜生柵藻而言,藻中MDA含量基本不隨AgNCs的質量濃度的變化而改變。當斜生柵藻暴露于質量濃度為5、10、15 mg/L的AgNSs和AgNCs時,同質量濃度下經AgNSs處理的藻細胞中MDA含量高于AgNCs處理組的,而AgNPs的質量濃度為20 mg/L時的結果則相反。

      ②MDA作為ROS的反應產物,可能因ROS含量的減少而受到抑制。從ROS及MDA產生的抑制情況進一步說明斜生柵藻可能有其他機制來耐受污染物[26]。除此之外,對于晶體而言,尖銳頂點和邊緣與酶表面的幾何匹配更好[29],即AgNCs對MDA酶具有更顯著的影響。 由于AgNCs的幾何特性對MDA酶的抑制作用及毒物本身對氧化應激反應的抑制,AgNCs實驗組的MDA含量一直處于穩(wěn)定的較低水平。藻細胞在毒物的刺激作用下會出現MDA含量下降的現象,當毒物質量濃度大于15 mg/L后,受比表面積和粒徑的影響,AgNSs呈現強于AgNCs的毒性效應。

      ③MDA含量的下降是ROS含量下降和MDA酶受到抑制的共同作用的結果。而ROS含量的變化主要是由藻細胞的應激反應引起,影響因素為AgNPs的比表面積和粒徑大??;毒物對MDA的抑制作用主要受AgNPs幾何形狀的影響。

      (3)AgNPs對SOD活性的影響。隨著污染物質量濃度的升高,ROS含量并非是單調地升高或減少。在逆境條件下,植物體內ROS的生成和自我清除的平衡將被打破,同時也改變了SOD等抗氧化酶的活性[25]。為了保護自身免受氧化應激的損害,藻類細胞形成了高效的抗氧化機制,以中和逆境下細胞中累積的ROS,如SOD[25]。

      暴露于不同質量濃度AgNSs和AgNCs 48 h后,斜生柵藻中SOD活性的變化(圖7)顯示:

      圖7 不同質量濃度的AgNSs和AgNCs對斜生柵藻中SOD活性的影響Figure 7 The effects of different concentrations of AgNSs and AgNCs on SOD activity in Scenedesmus obliquus

      ①AgNSs和AgNCs均使藻細胞產生應激反應而增強了SOD活性,且SOD活性在這2種形貌的毒物刺激下所達到的峰值無較大差異。

      ②在AgNSs的質量濃度大于10 mg/L后,實驗組的SOD活性基本不變;在AgNCs的質量濃度大于5 mg/L后,實驗組的SOD活性呈下降趨勢,但其活性始終高于對照組。劉敏等[25]的研究表明,在高質量濃度的暴露下,SOD合成酶的活性并不能被成功激活,從而導致SOD的產生受到抑制。該結論與本實驗結果一致。 AgNCs在高質量濃度所引起的SOD活性降低的現象,可能是因為立方體所具有的尖銳頂點和邊緣與酶表面具有較好的幾何匹配性,以致其對SOD的活性抑制更顯著。

      3 結論

      本文制備得到2種形貌(球形、立方體)的AgNPs,即AgNSs及AgNCs,以斜生柵藻為受試生物,通過水環(huán)境暴露實驗,觀測了受試生物的生理生化響應,探討了AgNPs的形貌與藻類表觀毒性的相互關系。主要結果如下:

      (1)從宏觀生物量來看,2種形貌的AgNPs均影響藻類的生長:AgNSs對斜生柵藻的生長有毒物興奮效應;AgNCs對藻類表現出暴露時間較短時促進生長、暴露時間較長時抑制生長的現象。AgNSs和AgNCs在藻類生長上所表現出的差異性,可能是其尺寸不同所導致的Ag+環(huán)境濃度差異引起的。

      (2)2種形貌的AgNPs均對斜生柵藻的光合作用產生影響。相較而言,AgNCs能在更低濃度(5 mg/L)環(huán)境下對藻細胞的光合系統(tǒng)造成損傷。同時,葉綠素a的質量濃度在毒物脅迫下的變化與藻密度相對應,間接體現了AgNSs和AgNCs因尺寸不同所導致的毒性差異。

      (3)本研究印證了斜生柵藻可能有其他機制來耐受污染物,但AgNPs仍會對抗氧化系統(tǒng)產生刺激作用,主要表現在ROS含量、MDA含量的下降和SOD活性的增強。但2種形貌的AgNPs引起的典型酶應激反應存在差異:AgNSs因具有較大比表面積和較小的粒徑,而對細胞有更強的刺激性,因此對ROS的抑制作用更顯著,且較高濃度的暴露使MDA含量處于較低水平;AgNCs因其幾何形狀而與酶具有更好的匹配性,以致其MDA含量一直處于較低且穩(wěn)定的水平,且較高濃度的暴露使SOD活性有下降趨勢。

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