禽衣原體病實驗室診斷技術(shù)研究進(jìn)展

李小軍，鄧海燕，黃潔瑩，王自強(qiáng)，張險朋

（東莞市動物疫病預(yù)防控制中心，廣東東莞 523086）

禽衣原體?。╝vian chlamydiosis）是多種衣原體感染不同禽類后引起疾病的總稱，主要由鸚鵡熱衣原體（Chlamydophila psittaci，C.psittaci）感染引起。鸚鵡熱衣原體可感染禽類等多種動物，也可感染人[1-5]。衣原體屬包括12 種公認(rèn)的衣原體種，其中鸚鵡熱衣原體、鳥衣原體和雞衣原體是從鳥類中分離而來的[6]。衣原體病從19 世紀(jì)（1879 年）開始逐漸被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時瑞士醫(yī)生Jakob Ritter 首次報道了人類感染病例，并指出這種致命性呼吸道流行疾病可能與接觸籠中的鸚鵡和雀類有關(guān)，但當(dāng)時并沒有引起廣泛重視[7]。隨著PCR 方法的出現(xiàn)，衣原體病的分子診斷方法得到發(fā)展，這才被發(fā)現(xiàn)世界各地的疫情暴發(fā)與之相關(guān)聯(lián)，從而引起了研究人員的極大關(guān)注[8-15]。禽間的衣原體感染率較高，據(jù)統(tǒng)計2012—2021 年全球的禽衣原體感染率約為20%[16]。其中鸚鵡熱衣原體是人類鸚鵡熱的潛在感染源，對公共衛(wèi)生構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

禽衣原體病沒有典型臨床癥狀，成年禽類多表現(xiàn)為隱性感染，不表現(xiàn)臨床癥狀，因此其確診需要利用實驗室診斷方法[17]。目前，針對禽衣原體的檢測方法有很多：血清學(xué)方法包括補(bǔ)體結(jié)合試驗（CFT）、凝集試驗、免疫熒光試驗（IFT）、免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等，其中主要方法是CFT 和ELISA；分子生物學(xué)方法包括常規(guī)PCR、熒光PCR、微滴式數(shù)字PCR、等溫擴(kuò)增和DNA 微陣列等，其中熒光PCR 是主流方法。本文從病原學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)方面，綜述了禽衣原體病診斷方法的研究進(jìn)展和應(yīng)用現(xiàn)狀，分析各種檢測方法的優(yōu)缺點，以期為禽衣原體病的診斷和防控提供參考。

1 病原學(xué)診斷

1.1 組織化學(xué)染色法

組織化學(xué)染色法是常用的禽衣原體檢查方法，包括Gimenez、改良Gimenez（PVK 染色）和姬姆薩染色。對新鮮樣品涂片，最常用改良Giménez技術(shù)對病理組織切片進(jìn)行觀察，能夠看到組織細(xì)胞漿內(nèi)的圓形或者不規(guī)則形包涵體[18]。在涂片過程中要注意涂層厚度，如果樣品涂得太厚，染色液就會聚集在一起，從而影響顯微鏡觀察。組織化學(xué)染色法不如抗原檢測方法或特異性核酸檢測方法敏感，其應(yīng)用范圍逐漸縮小。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)分離法

細(xì)胞培養(yǎng)分離法被公認(rèn)為是衣原體檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。常用的培養(yǎng)細(xì)胞有McCoy、Hela、Vero、L929 和BGM，其中BGM 最為敏感[19]。培養(yǎng)時，可以采用經(jīng)過改良的培養(yǎng)方法，使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)需要一定的設(shè)施設(shè)備和環(huán)境，包括染色、接種樣品離心、生物安全防護(hù)等。為了長期觀察感染細(xì)胞，提高衣原體培養(yǎng)效率，通常通過放射或使用含細(xì)胞毒性的化學(xué)物質(zhì)來抑制宿主細(xì)胞分裂。其中，放線菌酮是最常用的細(xì)胞毒性化學(xué)物質(zhì)。在接種細(xì)胞單層時，按照0.5～2.0 μg/mL 的質(zhì)量濃度向培養(yǎng)液加入放線菌酮，發(fā)現(xiàn)其對禽衣原體生長具有促進(jìn)作用，而對宿主細(xì)胞有抑制作用。另外一種提高培養(yǎng)效率的方法是，通過離心將禽衣原體病原離心至單層細(xì)胞上，感染2～3 d 后，將細(xì)胞單層固定，然后通過染色檢查包涵體。檢測包涵體的首選方法是針對衣原體LPS 或MOPM 上的特異性抗原表位單克隆抗體進(jìn)行直接熒光染色，也可以通過Gimenez、Stamp、Macchiavello 或姬姆薩染色方法檢測包涵體。

1.3 雞胚培養(yǎng)分離法

雞胚培養(yǎng)分離法主要用于禽衣原體的初步分離。樣品應(yīng)通過抗生素預(yù)處理，標(biāo)準(zhǔn)接種程序是，將0.5 mL 的樣品接種到培養(yǎng)6～7 d 無特定病原體的胚胎卵黃囊中，然后在39 ℃潮濕環(huán)境中孵化卵子，在較高溫度下，衣原體繁殖大大增加。在雞胚中的復(fù)制通常會導(dǎo)致胚胎在3～10 d 內(nèi)死亡，如果沒有死亡，通常在指定檢測樣品為陰性時，再進(jìn)行兩次額外的盲檢。禽衣原體感染雞胚會導(dǎo)致卵黃囊膜的典型血管充血，這也可當(dāng)作是否感染的輔助判斷。采集死亡雞胚卵黃囊懸液，并使用適當(dāng)?shù)娜旧珓┲苯油科旧?，或利用血清學(xué)試驗檢測抗原，即對禽衣原體做出初步判定。

1.4 動物接種培養(yǎng)法

動物接種培養(yǎng)方法采用小鼠進(jìn)行動物回歸試驗居多，主要用于污染樣品中的禽衣原體培養(yǎng)。將污染的樣品離心，配成溶液接種于出生3～4 d的小白鼠腹腔內(nèi)，接種量為0.5～1.0 mL。接種后4～7 d 內(nèi)小白鼠的病理解剖變化是，腹腔有大量的纖維素蛋白滲出，脾臟腫大。無菌操作取出滲出物或脾臟組織進(jìn)行涂片，采用Gimenez、Stamp、Macchiavello 或姬姆薩染色方法檢測包涵體，如果檢出包涵體即為禽衣原體感染。

2 血清學(xué)檢測

2.1 CFT 方法

CFT 方法是檢測衣原體血清抗體常用方法之一，也是世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）診斷試驗手冊推薦的衣原體抗體檢測金標(biāo)準(zhǔn)。衣原體病臨床主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，有時為隱性感染，根據(jù)臨床癥狀很難判定。要想從采集的臨床樣品中分離到衣原體，通常情況下會先采集動物血清進(jìn)行抗體檢測。在動物感染禽衣原體的初期或者經(jīng)過四環(huán)素類藥物治療后，采用CFT 方法進(jìn)行檢測時，結(jié)果可能會出現(xiàn)弱陽性或陰性，所以CFT 方法主要用于急性期診斷。CFT 方法對實驗室及操作人員要求較高，雖然樣品經(jīng)過高溫處理后特異性會提高，但敏感性會降低。

2.2 IFT 方法

IFT 方法是用熒光素標(biāo)記禽衣原體單克隆抗體（FA），當(dāng)抗體與抗原結(jié)合后，通過熒光顯微鏡觀察的方法。帶有熒光素的抗體會進(jìn)入衣原體感染的細(xì)胞內(nèi)，需要通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。Beliz等[20]通過改良的Gimenez 染色（mGS）、直接熒光素FA 染色，對寵物鳥糞便進(jìn)行衣原體檢測，用常規(guī)PCR 檢測糞便中的核酸，用上述3 種方法檢測糞便樣品接種到雞胚卵黃囊6 d 的制備接種物。結(jié)果顯示，96 例糞便樣品中，常規(guī)PCR 檢出陽性33 份（34.4%），mGS 檢出陽性21 份（21.9%），IFT 檢出陽性29 份（30.2%）。雖然改良mGS 及IFT 靈敏度均低于常規(guī)PCR，但3 種方法都有各自優(yōu)點，其中mGS 方法易于實施、檢驗成本低，IFT方法具有突出的臨床應(yīng)用優(yōu)勢和抗干擾能力。

2.3 ELISA 方法

ELISA 方法是檢測禽衣原體抗原和抗體常用方法之一，也是WOAH 診斷試驗手冊推薦的方法。目前，禽衣原體抗原檢測主要是檢測脂多糖（LPS）抗原，結(jié)果為陽性就證實衣原體的存在。張暢等[21]采用禽衣原體抗原ELISA 試劑盒對疑似鸚鵡熱衣原體感染的臨床樣品進(jìn)行檢測，平均陽性檢出率為58.7%，高于直接熒光染色法，但低于常規(guī)PCR 方法。禽衣原體抗原ELISA 檢測最大的優(yōu)勢是可以高通量檢測，陰陽性結(jié)果容易判斷，受操作人員主觀影響小，但其中一些衣原體LPS 與其他革蘭氏陰性菌LPS 共享一些表位，并且這些表位可以交叉反應(yīng)，因而導(dǎo)致抗原檢測中存在假陽性的問題。另外在研的試劑盒仍缺乏高的敏感性，需要有大量病原體才能產(chǎn)生陽性反應(yīng)。

目前，還沒有商品化的禽衣原體病疫苗投入使用，因此抗體陽性就表明禽類感染或曾經(jīng)感染過禽衣原體，為此研究者建立了ELISA 抗體檢測方法。Verminnen 等[22]在2006 年建立了鸚鵡熱衣原體重組rMOMP ELISA 方法，檢測火雞血清中鸚鵡熱衣原體主要外膜特異性抗體，與免疫印跡、競爭ELISA 和間接ELISA（LPS/LGP）方法相比，靈敏度最高，特異性最好。Liu 等[23]建立了鸚鵡熱衣原體PmpD-N ELISA 方法，應(yīng)用建立的方法對7 個省份的雞血清樣品進(jìn)行了鸚鵡熱衣原體抗體檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率達(dá)95.6%。雖然單憑血清學(xué)抗體陽性并不能對禽衣原體病作出確診，還需結(jié)合抗原或基因的檢測結(jié)果，但在禽衣原體病的流行病學(xué)調(diào)查和大規(guī)模監(jiān)測中，抗體ELISA 方法檢測結(jié)果具有一定的參考意義。

3 分子生物學(xué)診斷

3.1 常規(guī)PCR 方法

當(dāng)前PCR 檢測技術(shù)已趨于成熟，并通過與其他技術(shù)結(jié)合使用，獲得了更高的特異性和靈敏度。目前，常規(guī)PCR 技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于鸚鵡熱衣原體的蛋白基因檢測[24]，主要是根據(jù)pmp基因、ompA基因、16S rRNA、MOPM基因和23S rRNA 來設(shè)計特異性引物[25]。根據(jù)不同基因設(shè)計引物建立的常規(guī)PCR 方法的敏感性和特異性會有所不同，但常規(guī)PCR 方法比細(xì)胞培養(yǎng)法或ELISA 方法的敏感性會高很多，能夠?qū)η菀略w病作出快速診斷。劉婷婷[26]根據(jù)鳥源鸚鵡熱衣原體MOPM基因序列設(shè)計特異性引物，建立了鸚鵡熱衣原體常規(guī)PCR 方法，應(yīng)用該方法對臨床樣品進(jìn)行檢測，并將陽性樣品接種小白鼠，進(jìn)行動物回歸試驗，結(jié)果在小白鼠中腹腔液中分離到了鸚鵡熱衣原體，證明常規(guī)PCR 檢測結(jié)果與動物分離培養(yǎng)檢測方法一致。Ruiz-Laiton等[27]2022 年以鸚鵡熱衣原體外膜蛋白MOMP基因和ompA基因為目標(biāo)片段設(shè)計引物，建立了鸚鵡熱衣原體常規(guī)PCR 方法，并應(yīng)用該方法對機(jī)構(gòu)罰沒的177 只鸚鵡泄殖腔樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率達(dá)77.77%，并指出這些鸚鵡作為寵物飼養(yǎng)，存在人感染鸚鵡熱衣原體的風(fēng)險。Hisada 等[28]2021 年基于一種全新的特異性猝滅探針（QC），建立了用于快速區(qū)分肺炎衣原體和鸚鵡熱衣原體的新型PCR 檢測方法（PCR-QC）。該方法通過識別獨特的熔解溫度，精確檢測混合樣品中的2 種不同類型的DNA 片段，結(jié)果與分離培養(yǎng)方法一致。與常規(guī)PCR 方法相比，PCR-QC 方法縮短了檢測時間，這將更利于禽衣原體病的實驗室快速診斷。

禽衣原體PCR 檢測方法因體系、引物及樣品的差異，其靈敏度和特異性也各有不同，但與熒光PCR 方法相比總體較差，在研究中通常通過靶向相對較短的DNA 片段或使用嵌套程序來提高靈敏度。常規(guī)PCR 方法通過相應(yīng)基因片段分析，可以對病原體進(jìn)行遺傳分析，但該方法需要對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，在操作時如果不采取有效的防污染措施，就容易產(chǎn)生實驗室污染。

3.2 熒光PCR 方法

熒光PCR 方法是在PCR 反應(yīng)基礎(chǔ)上加入熒光基團(tuán)，通過擴(kuò)增實現(xiàn)熒光信號的累積，并實時監(jiān)控PCR 反應(yīng)的全過程，最終根據(jù)循環(huán)數(shù)和曲線對DNA 模板進(jìn)行半定量檢測的方法。PCR 檢測從定性到半定量轉(zhuǎn)換的這一過程，最早于1996 年由AB 公司實現(xiàn)。目前，熒光PCR 方法因具有較高的特異性，不需要對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，避免了常規(guī)PCR 方法容易出現(xiàn)污染的問題，成為了動物疫病檢測的主流方法，并在不同級別實驗室中得到應(yīng)用[29-30]。2022 年Lee 等[31]比較分析了鸚鵡熱衣原體、鳥衣原體和雞衣原體基因組序列，確定了3 個物種的特定遺傳區(qū)域，并根據(jù)23S rRNA特異性區(qū)域分別設(shè)計引物探針，建立了針對禽衣原體病的三重?zé)晒釶CR 方法，其靈敏度均達(dá)到了10 copies/μL。Cadario 等[32]根據(jù)ompA基因建立了鸚鵡熱衣原體TaqMan 熒光PCR 方法，驗證了該方法大規(guī)模檢測的可行性，同時進(jìn)一步佐證了熒光PCR 方法在禽衣原體病診斷中的高通量檢測能力。吳東海等[33]2008 年針對鸚鵡熱衣原體外膜蛋白MOPM基因建立了鸚鵡熱衣原體SYBR Green Ⅰ熒光PCR 方法，發(fā)現(xiàn)DNA 濃度在1.78×102～1.78×108copies/μL 時，線性相關(guān)系數(shù)可達(dá)到0.998，批內(nèi)變異系數(shù)為1.30%～4.59%，批間變異系數(shù)為5.72%～9.87%，并證實該方法可用于鸚鵡熱衣原體的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。王建忠[34]在2013 年根據(jù)衣原體16S—23S rRNA 和外膜蛋白MOPM基因建立了鸚鵡熱衣原體TaqMan熒光PCR 方法，與常規(guī)PCR 方法相比，此方法的靈敏度提高了130～5 000 倍，進(jìn)一步證明了熒光PCR 方法具有靈敏、高效、特異、快速的優(yōu)勢，可用于禽衣原體臨床樣品檢測。

熒光PCR 方法具有快速、高通量和易于標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點，且具有定量潛力，從而成為實驗室的首選診斷方法；靈敏度與套式PCR 相當(dāng)；由于在封閉系統(tǒng)中反應(yīng)，所以大大減少了污染問題；但因需要專用的熒光PCR 儀，因而增加了其檢測成本。

3.3 核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)

核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）和重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）方法。等溫擴(kuò)增技術(shù)在基因擴(kuò)增檢測過程中不需要溫度的循環(huán)變化，所以無需配備專用的PCR 擴(kuò)增儀，只需要恒溫的儀器設(shè)備就可開展檢測。近年來，等溫擴(kuò)增技術(shù)得到了快速發(fā)展，被廣泛應(yīng)用于動物疫病檢測。LAMP 方法采用專用的引物設(shè)計系統(tǒng)，在6個目標(biāo)基因區(qū)域設(shè)計4 對特異性引物，通過DNA聚合酶反應(yīng)，在恒溫條件實現(xiàn)高效擴(kuò)增。孫翔翔等[35]2020 年根據(jù)鸚鵡熱衣原體的23S rRNA 基因序列設(shè)計引物，建立了鸚鵡熱衣原體LAMP 方法，在63 ℃ 1 h 內(nèi)完成高效擴(kuò)增，靈敏度可達(dá)100 copies/μL，與常見病原體無交叉反應(yīng)，在臨床樣品檢測中與熒光PCR 方法檢測結(jié)果一致，證明了該方法具有快速、特異和不需要昂貴儀器等特點，為鸚鵡熱的現(xiàn)場快速診斷提供了技術(shù)支撐。目前，關(guān)于禽衣原體LAMP 方法的研究逐漸增多，該方法在人醫(yī)臨床和獸醫(yī)臨床已經(jīng)實現(xiàn)了衣原體病的現(xiàn)場快速診斷[36-37]。

RPA 方法根據(jù)活體內(nèi)DNA 復(fù)制原理，在恒溫條件下擴(kuò)增模板。其原理是，將3 種酶（重組酶、鏈置換DNA 聚合酶、單鏈DNA 結(jié)合蛋白酶）混合，加入熒光探針和特異性引物，在37～42 ℃進(jìn)行反應(yīng)，使目標(biāo)基因在30 min 內(nèi)得到指數(shù)級增長，能夠被專用熒光檢測儀識別。費媛媛等[38]2018 年根據(jù)動物衣原體的envB基因設(shè)計引物和探針，建立了動物衣原體RPA 方法，在20 min 內(nèi)，37～39 ℃恒溫擴(kuò)增下，靈敏度達(dá)到10 copies/μL。應(yīng)用該方法進(jìn)行臨床樣品檢測，結(jié)果與常規(guī)PCR 方法一致，證明RPA 方法具有特異、靈敏、操作簡便、反應(yīng)時間短等優(yōu)點，適合于衣原體的現(xiàn)場快速檢測，在基層中具有很好的應(yīng)用前景。目前，RPA 方法已被逐漸應(yīng)用于動物疫病檢測，在禽衣原體檢測方面也有較成熟的試劑盒上市，檢測成本較低，不需要昂貴的儀器設(shè)備，通過與其他方法結(jié)合，可衍生多種衣原體檢測方法。但該方法無法控制反應(yīng)的終點，因而無法定量，且在試驗操作中容易發(fā)生污染而導(dǎo)致假陽性。

3.4 DNA 微陣列檢測技術(shù)

DNA 微陣列技術(shù)是WOAH 診斷試驗手冊中推薦的禽衣原體檢測方法之一。其原理是，將芯片上固定設(shè)計好的核酸探針，加入DNA 模板后，核酸探針與DNA 模板進(jìn)行結(jié)合雜交，然后通過儀器設(shè)備識別每個探針的信號從而獲得樣品DNA 序列。Ehricht 等[39]2005 年建立了衣原體DNA 微陣列檢測方法，通過靈敏度試驗和基因測序表明，單次PCR 擴(kuò)增的目標(biāo)拷貝足以完成特異性結(jié)合，從而首次驗證了DNA 微陣列技術(shù)適合于臨床樣本的衣原體常規(guī)檢測。Sachse 等[40]2008 年建立了衣原體Array Tube（AT）標(biāo)記微陣列DNA 檢測方法，根據(jù)ompA基因，不但可以區(qū)分已建立的基因型，還能識別未分型的衣原體株。研究根據(jù)ompA基因可變結(jié)構(gòu)域2 和4 設(shè)計了35 個平行雜交探針，從而實現(xiàn)了單核苷酸多態(tài)性檢測。傳統(tǒng)的基因分型系統(tǒng)不能充分反映禽衣原體ompA序列種內(nèi)差異程度，而DNA 微陣列技術(shù)可以在流行病學(xué)調(diào)查中根據(jù)這種差異，進(jìn)一步探索某基因型的傳播，從而識別出禽衣原體的非典型株。Borel 等[41]利用建立的AT標(biāo)記DNA 微陣列方法，對多類型樣品進(jìn)行了衣原體檢測，包括鼻拭子、結(jié)膜拭子、福爾馬林固定組織、石蠟包埋組織、新鮮器官組織、牛奶、糞便以及細(xì)胞培養(yǎng)物等，進(jìn)一步驗證了DNA 微陣列方法可應(yīng)用于雜樣本的混合感染檢測。

目前，衣原體的DNA 微陣列檢測方法已經(jīng)有成熟的商品化試劑。DNA 微陣列已成為普遍的mRNA 表達(dá)監(jiān)測工具，但其在細(xì)菌和病毒病原體快速檢測中的應(yīng)用才剛開始。衣原體DNA 微陣列方法的靈敏度與傳統(tǒng)的16S PCR 相當(dāng)，但略低于熒光PCR 和套式PCR 檢測，靈敏度不足和成本高一直是阻礙微陣列平臺廣泛應(yīng)用于臨床樣本檢測的主要限制因素。

4 小結(jié)與展望

病原學(xué)診斷技術(shù)是禽衣原體病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法需要在相應(yīng)生物安全級別的實驗室才能操作，且耗時較長，操作繁瑣，已不再是禽衣原體病實驗室診斷的主流方法。目前，禽衣原體病的血清學(xué)檢測方法主要是CFT 和ELISA 方法。CFT 方法需要在較高級別實驗室才能操作，ELISA 方法在流行病學(xué)調(diào)查和大規(guī)模監(jiān)測中起到了很重要的作用，但其假陽性問題尚未完全解決。

分子生物學(xué)方法近年來得到很大發(fā)展，其中熒光PCR 方法成為禽衣原體核酸檢測的主流方法；與傳統(tǒng)的病原分離培養(yǎng)方法相比，熒光PCR 方法在實驗室生物安全防護(hù)級別、檢測耗時、檢測通量、檢測敏感性等方面都有很大優(yōu)勢。盡管分子生物學(xué)檢測具有更高的特異性并能夠快速識別病原，但主流分子生物學(xué)檢測方法僅在感染的急性期才能發(fā)揮最佳效果。隨著新一代分子生物學(xué)方法微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)的逐漸成熟，對禽衣原體的最佳檢測期有望不再限制于感染的急性期[42]，其特異性高、敏感、通量大，具有很好的應(yīng)用前景，對于禽衣原體病的檢疫、診斷和流行病學(xué)調(diào)查都具有很重要作用，是未來禽衣原體病實驗室診斷的發(fā)展趨勢。