TLR7 激動(dòng)劑經(jīng)lnc-DC/STAT3 而非lnc-THRIL 途徑刺激腎癌患者PBMCs增強(qiáng)抗腫瘤作用①

吳 波 陳 林 何平林 葉 鑫 吳建軍 陳 果 刁建軍 張漢超 陳 亮

（成都醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院·成都市郫都區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科，成都 611730）

近些年，免疫治療應(yīng)用于晚期腎癌患者，免疫檢查點(diǎn)抑制劑獲批可作為晚期腎癌的二線治療，對(duì)于晚期腎癌治療方案不再單獨(dú)局限于靶向藥物治療［1］。細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTLs）具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞和分泌抑癌細(xì)胞因子的能力，在腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要作用。腎腫瘤特異性CTL 反應(yīng)需要激活抗原提呈細(xì)胞（APC），包括樹突狀細(xì)胞（DC）和巨噬細(xì)胞，在腎癌的免疫反應(yīng)中起重要作用［2］。酪氨酸酶抑制劑（TKI）具有抑制腎腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，而不具有直接的細(xì)胞毒性作用。因此，對(duì)于腎癌晚期患者的免疫治療研究具有非常重要的臨床意義。Toll 樣受體的激動(dòng)劑（Toll-like receptor 7，TLR7）是一類免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。TLR7 的激活劑可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)MyD88/NF-B 信號(hào)級(jí)聯(lián)和強(qiáng)力的免疫反應(yīng)，同時(shí)具有抗病毒和抗腫瘤作用，起到協(xié)同免疫反應(yīng)的作用［3-4］。本課題組前期研究表明TLR7 激動(dòng)劑能夠有效增強(qiáng)腎癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞抗腫瘤活性，也證實(shí)IFN-γ、TNF-α 和 IL-2 對(duì)腫瘤細(xì)胞直接殺傷作用，同時(shí)對(duì)于細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑（cyclin dependent kinase inhibitors，CDKIs）的負(fù)性調(diào)節(jié)影響，從而影響腎腫瘤細(xì)胞增殖［5］。已有研究證實(shí)TLR7 激動(dòng)劑加強(qiáng)抗原DC 呈遞作用，并提高抗原特異性 T 細(xì)胞的表達(dá)量［6］。TLR7 激活可增強(qiáng)CTLs殺傷性，明顯抑制腫瘤細(xì)胞周期，抑制增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡［7］；但是LR7 激動(dòng)劑的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究擬探索lnc-DC 和lnc-THRIL 對(duì)腎癌患者PBMCs 的影響及作用機(jī)制，并進(jìn)一步探索影響腎癌細(xì)胞增殖和侵襲等生物學(xué)行為改變的信號(hào)通路，為腎癌的免疫治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料 病例：患者，男，58 歲，經(jīng)左腎癌根治性切除術(shù)后，病理診斷為腎透明細(xì)胞癌，確診時(shí)未發(fā)現(xiàn)感染炎癥及其他并發(fā)癥；研究方案通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批件號(hào)：倫委批字號(hào)2018D2。胎牛血清（Gibco）、RPMI1640培養(yǎng)基、電化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)型顯影劑購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；TLR7特異性激動(dòng)劑 gardiquimod 購(gòu)自 Enzo Life Sciences 公司；Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)BD 公司；熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)AB 公司；反轉(zhuǎn)錄制備cDNA 購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑購(gòu)自瑞士羅氏公司；GAPDH、P21、P27、STAT3 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；Bio-Rad 電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、PVDF 膜購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 PBMCs 的分離、培養(yǎng)及刺激 患者簽署知情同意書后，用乙二胺四乙酸抗凝管抽取該腎癌患者血液15 ml，置于水平離心機(jī)離心，1 500 r/min 離心10 min，離心半徑10 cm，將上層血漿1.5 ml 凍存于EP管備用。剩余血液用PBS緩沖液稀釋，淋巴細(xì)胞分離液混勻，梯度離心PBMCs，1 000 r/min 離心10 min，小心吸取離心管中血漿和淋巴細(xì)胞分離液界面的單個(gè)核細(xì)胞，用PBS洗滌2次，以含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)并計(jì)數(shù)。TLR7 特異性激動(dòng)劑gardiquimod按照操作說明書進(jìn)行溶解，以10 mg/L的終濃度加入PBMCs中。

1.2.2 腎癌細(xì)胞分離和培養(yǎng) 取該患者術(shù)后的腎腫瘤組織標(biāo)本，剪碎組織塊，采用混合酶消化法分離原代細(xì)胞。傳3～5 代腎癌細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后將2.5×106個(gè)/ml 細(xì)胞懸液加入稀釋的基質(zhì)膠放置在Transwell 頂室中，小室孔徑為0.4 μm，繼續(xù)加入10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基1ml，待腫瘤細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后換無(wú)血清培養(yǎng)基，加入gardiquimod 刺激4 h后的PBMCs 共同培養(yǎng)24 h。依據(jù)PBMCs 受shRNA（lnc-DC）、shRNA（lnc-THRIL）、shRNA（lnc-THRIL）不同處理，分為3組：對(duì)照組（gardiquimod刺激組+無(wú)shRNA組）、shRNA（lnc-DC）組和shRNA（lnc-THRIL），500 μl 10%FBS 的培養(yǎng)基加入含有趨化因子的基底外側(cè)室中，37℃溫育48 h 后，用棉簽除去未遷移腫瘤細(xì)胞，4%多聚甲醛固定3 min，用0.1%結(jié)晶紫染色，測(cè)量OD值。

1.2.3 RNA 提 取 和 Real-time-PCR Total RNA 使用 Trizol 提取，RNA 反轉(zhuǎn)錄制備 cDNA 采用 High Capacity RNA-to-cDNA 試劑盒（Thermo Fisher），配制Real-Time PCR 反應(yīng)體系，使用三步法程序進(jìn)行PCR 反應(yīng)，將反應(yīng)體系置于熒光定量PCR 儀中，運(yùn)行程序收集數(shù)據(jù)并分析結(jié)果。

1.2.4 Western blot 將待檢測(cè)細(xì)胞用PBS 清洗后加入Roche 蛋白酶抑制劑和RIPA 裂解液；冰上孵育30 min后，移入1.5 ml EP管，12 000 r/min離心15 min取上清液并測(cè)定蛋白濃度，加入loading buffer 煮沸5 min。根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量進(jìn)行10%SDSPAGE 電泳，然后PDVF 膜半干轉(zhuǎn)，并將膜放入由TBST 配制的5%BSA 中封閉1 h；然后孵育不同一抗（P21、P27、STAT3、pSTAT3、GAPDH）于4℃ 冰箱過夜。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)Western blot 結(jié)果進(jìn)行灰度值測(cè)定并統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 將腎癌細(xì)胞消化后，低速離心后去掉上清液，4℃PBS 清洗2 次；然后將細(xì)胞加入-20℃預(yù)冷的1.5 ml 70%乙醇EP 管中并在4℃冰箱孵育過夜。繼續(xù)離心去掉上清液，用PBS洗滌2 次。將500 μl RNA 酶加入細(xì)胞液中，常溫孵育1 h 充分降解RNA，離心去掉上清液后加入1 ml溴化乙啶和TritonX-100 避光孵育30 min。用流式細(xì)胞儀標(biāo)準(zhǔn)程序檢測(cè)腎癌細(xì)胞周期，結(jié)果用細(xì)胞周期軟件分析。

1.2.651Cr 釋放試驗(yàn)測(cè)定gardiquimod 刺激PBMCs的抗腫瘤活性變化 將對(duì)照組、TLR7 激動(dòng)劑后的lnc-DC 組和 lnc-THRIL 組 PBMCs 作為效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞用完全RPMI1640 培養(yǎng)液配制成1×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液備用。實(shí)驗(yàn)前24 h 傳代腎癌細(xì)胞作為靶細(xì)胞，取1×105個(gè)/ml靶細(xì)胞，設(shè)置為效靶比40∶1、20∶1 和10∶1，同時(shí)設(shè)立自然釋放孔和最大釋放孔。作用時(shí)間為4 h，用γ 計(jì)數(shù)儀測(cè)量cpm 值，按以下公式計(jì)算各組的殺傷率：細(xì)胞殺傷活性（%）=（實(shí)驗(yàn)cpm-自放射cpm）（/靶細(xì)胞最大cpm-靶細(xì)胞自放射cpm）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用GraphPadPrism 軟件對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均采用表示，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析和SNK 法比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLR7 激動(dòng)劑對(duì) PBMCs 中 lnc-DC 和 lnc-THRIL表達(dá)的影響 TLR7 激動(dòng)劑gardiquimod 加入PBMCs后，采用 RT-PCR 檢測(cè) lnc-DC 和 lnc-THRIL 的 mRNA水平變化，如圖 1 所示，TLR7 激動(dòng)劑組 lnc-DC 表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），TLR7激動(dòng)劑組lnc-THRIL表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。進(jìn)一步通過 shRNA 轉(zhuǎn) 染 PBMCs 并驗(yàn) 證 lnc-DC 和 lnc-THRIL的敲除率，如圖1 結(jié)果所示：shRNA lnc-DC 組的lnc-DC 表達(dá)量較對(duì)照組和TLR7 激動(dòng)劑組均明顯降低（P＜0.05），shRNA lnc-THRIL 組的 lnc-THRIL 較對(duì)照組明顯降低（P＜0.05），對(duì)應(yīng)的引物序列見表1。

表1 PCR引物列表Tab.1 PCR primers list

圖1 PBMCs 細(xì) 胞 lnc-DC 和 lnc-THRIL 的 mRNA 水 平表達(dá)量Fig.1 mRNA expression of lnc-DC and lnc-THRIL in PBMCs

2.2 TLR7 激動(dòng)劑對(duì)腎癌細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白P21/P27 的表達(dá)影響 用TLR7 激動(dòng)劑gardiquimod 刺激PBMCs 并分別轉(zhuǎn)染 shRNA lnc-THRIL 和 shRNA lnc-DC，并進(jìn)一步檢測(cè)腎癌細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)量，如圖 2 所示：Western blot 檢測(cè)到 P21 在 TLR7 激動(dòng)劑組和TLR7 激動(dòng)劑+shRNA lnc-DC 組中無(wú)明顯變化（P＞0.05），與對(duì)照組相比，P21 在 TLR7 激動(dòng)劑+shRNA lnc-THRIL 組中明顯降低（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，TLR7 激動(dòng)劑組中P27 表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與 TLR7 激動(dòng) 劑 組比 較，TLR7 激 動(dòng)劑 +shRNA lnc-DC 組和 TLR7 激動(dòng)劑+shRNA lnc-THRIL組的P27表達(dá)均降低（P＜0.05）。

圖2 腎癌細(xì)胞P27和P21的蛋白水平表達(dá)量Fig.2 Protein expressions of P21 and P27 in renal carcinoma cells

2.3 TLR7 激動(dòng)劑對(duì)lnc-DC/STAT3 表達(dá)的影響進(jìn)一步探究TLR7 激動(dòng)劑對(duì)lnc-DC 下游分子STAT3的影響，如圖3 所示：與TLR7 激動(dòng)劑組相比較，STAT3 在 TLR7 激動(dòng)劑+shRNA lnc-DC 組，TLR7 激動(dòng)劑+shRNA lnc-THRIL 組表達(dá)均無(wú)明顯差異（P＞0.05）；pSTAT3在TLR7激動(dòng)劑+shRNA lnc-DC 組表達(dá)明顯低于TLR7 激動(dòng)劑組和TLR7 激動(dòng)劑+shRNA lnc-THRIL組。

圖3 腎癌細(xì)胞STAT3和pSTAT3的蛋白水平表達(dá)量Fig.3 Protein expressions of STAT3 and pSTAT3 in renal carcinoma cells

2.4 TLR7 激動(dòng)劑和 lnc-DC 對(duì) PBMCs 殺傷活性的影響 TLR7 激動(dòng)劑可增強(qiáng)PBMCs 殺傷率，而通過shRNA 敲除 lnc-DC 和 lnc-THRIL 進(jìn)一步驗(yàn)證 lnc-DC和lnc-THRIL 是否參與調(diào)節(jié)PBMCs 的殺傷率，如圖4 所示：與TLR7 激動(dòng)劑組相比較，TLR7 激動(dòng)劑+shRNA lnc-DC 組的殺傷率明顯降低（P＜0.05），TLR7 激動(dòng)劑+shRNA lnc-THRIL 組無(wú)明顯改變（P＞0.05）；隨著效靶比增高，PBMCs對(duì)腎癌細(xì)胞靶細(xì)胞殺傷率逐漸增加（P＜0.05）。

圖4 在不同效靶比時(shí)PBMCs對(duì)腎癌細(xì)胞殺傷率的比較Fig.4 Cytotoxicity of PBMCs to renal carcinoma cells at different effector-target ratio

2.5 TLR7激動(dòng)劑和lnc-DC對(duì)細(xì)胞增殖的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)shRNA lnc-DC 和shRNA lnc-THRIL轉(zhuǎn)染后PBMCs 和共同培養(yǎng)的腎癌細(xì)胞增殖，如圖5所示：與對(duì)照組相比，TLR7 激動(dòng)劑組明顯抑制腎癌細(xì)胞增殖，以G1 期到S 期，腎癌細(xì)胞增殖指數(shù)下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腎癌細(xì)胞增殖指數(shù)在 TLR7 激動(dòng)劑+shRNA lnc-DC 組和 TLR7 激動(dòng)劑+shRNA lnc-THRIL組中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎癌細(xì)胞周期分布Fig.5 Flow cytometry to detect cycle distribution of renal carcionma cells

3 討論

腎癌是泌尿系最常見的惡性腫瘤之一，但其發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜［8］。近些年發(fā)現(xiàn)腎癌的發(fā)生發(fā)展與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，免疫治療在晚期腎癌的作用機(jī)制研究已取得突破性進(jìn)展，免疫檢查點(diǎn)抑制劑已獲批用于晚期腎癌的二線治療，這對(duì)于常規(guī)放化療及靶向治療無(wú)效的患者意義重大［9］。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）是通過篩選PBMC 而獲得特征性的多克隆T 淋巴細(xì)胞異質(zhì)群體，具有殺瘤活性強(qiáng)和殺瘤譜廣的特點(diǎn)［10］。本研究前期已證實(shí)TLR7 激動(dòng)劑可增強(qiáng)PBMCs 抗腫瘤活性，可能通過Skp2/P27通路抑 制 腎 腫 瘤 細(xì) 胞 增 殖［5］。 但 是 ，TLR7 激 動(dòng) 劑（gardiquimod）調(diào)節(jié)腎腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

lncRNA 在泌尿系腫瘤中不僅參與復(fù)雜的致癌機(jī)制，還影響治療耐藥。有研究表明lncRNA 可依賴HIF 或不依賴HIF 途徑調(diào)控腎癌的侵襲和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散［11］。其他研究證實(shí) lncRNAs 受 TLR7 調(diào)控，這些lncRNAs 的失調(diào)可顯著改變DC 的成熟、IFN-Ⅰ和炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生、抗原遞呈等，引起細(xì)胞免疫反應(yīng)［12］。本研究也證實(shí) lnc-DC STAT3 可影響樹突狀細(xì)胞的成熟和抗原呈遞，改變PBMCs 抗腫瘤作用。研究表明在腎癌患者血清中存在一種可調(diào)節(jié)DC 分化的lncRNA，也拓寬了lncRNA 在腎癌發(fā)病中的可能機(jī)制，為腎癌分子研究和發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志提供理論基礎(chǔ)。

有研究表明DC 和CIK 共培養(yǎng)可以提高細(xì)胞毒效應(yīng)，增強(qiáng)腫瘤的殺傷性和特異性，對(duì)于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)起重要作用，從而發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用［13］。

不同T 細(xì)胞群發(fā)揮免疫作用不同，為將來個(gè)體化免疫方案選擇提供依據(jù)。成熟的樹突狀細(xì)胞將抗原呈遞給細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞CD4+或CD8+T淋巴細(xì)胞，從而發(fā)揮更強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，達(dá)到抑制腫瘤的目的［14］。這與本研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除lnc-DC 可通過降低DC 刺激T 細(xì)胞活化能力，從而降低PBMCs 對(duì)腎癌細(xì)胞的殺傷作用。同時(shí)，本研究還通過敲除lnc-THRIL 檢測(cè)STAT3、增殖相關(guān)分子，結(jié)果表明lnc-THRIL 無(wú)直接增強(qiáng)PBMCs的抗腫瘤作用。lnc-THRIL在其他癌種中也被發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控 TNF-α 參與腫瘤發(fā)生發(fā)展［15］。lnc-THRIL可能會(huì)通過抑制P21 的表達(dá)促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生，減少患者的生存時(shí)間［16］。而本研究結(jié)果表明p21無(wú)明顯變化，也進(jìn)一步說明lnc-THRIL 未參與腎癌患者PBMCs抗腫瘤。

其他研究還表明DC 可顯著減少滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲，然而不是通過激活CD4+T細(xì)胞激發(fā)的炎癥反應(yīng)，而是通過成熟的DC 直接激活了p-STAT3 信號(hào)傳導(dǎo)和增加金屬蛋白酶-1（TIMP-1）和組織金屬蛋白酶2（TIMP-2）抑制劑的活性，最終降低腎癌細(xì)胞的侵襲力［17］。同理，lnc-DC/STAT3 可通過激活 p-STAT3 改變金屬酶活性，影響腎癌細(xì)胞侵襲能力，并且還可促進(jìn)IL-17 生成，增強(qiáng)抗腫瘤活性，這與我們所得結(jié)果一致。通過敲除lnc-DC 可降低人單核細(xì)胞向DC分化的能力，降低DC刺激T細(xì)胞活化的能力。本研究發(fā)現(xiàn)了一種調(diào)節(jié)DC 分化的lncRNA，同時(shí)也拓寬了lnc-DC在腎癌中的可能作用機(jī)制。