骨骼肌circRNA 在死亡時間推斷中的初步篩選及驗證研究

董婷婷，肖作潤，劉增甲，王業(yè)全，張國安，崔 文

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067）

死亡時間或死后間隔時間（postmortem interval，PMI）是指尸體被發(fā)現(xiàn)時距離死亡時的時間間隔。死亡時間的準(zhǔn)確推斷在可疑死亡案件中，對于排查和確定犯罪嫌疑人至關(guān)重要。 因此，死亡時間的推斷研究一直是法醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，也是目前研究的難點(diǎn)。 傳統(tǒng)的法醫(yī)病理是通過尸斑、尸僵、尸溫等尸體現(xiàn)象的變化推斷死亡時間，但因其易受外界環(huán)境因素的影響，造成死亡時間的推斷誤差較大。 因此，尋找準(zhǔn)確推斷死亡時間的方法對于法醫(yī)實踐中的應(yīng)用至關(guān)重要。

近年來，利用RNA 的降解程度來推斷死亡時間已逐漸成為法醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)。 LI W 等發(fā)現(xiàn)在大鼠的心肌組織中，線性RNA 在死后的96 h 內(nèi)呈現(xiàn)平穩(wěn)增高的趨勢，適合用于PMI 推斷。 但是國內(nèi)學(xué)者呂葉輝等研究發(fā)現(xiàn)大鼠心肌內(nèi)多種線性RNA 的表達(dá)受死亡原因的影響，且RNA 易降解，增加了其提取和檢測的困難，并不適合進(jìn)行推廣應(yīng)用。

環(huán)狀 RNA（circular RNA，circRNA）是一類以共價鍵形成的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA 分子，不具有5' 端帽子結(jié)構(gòu)和3' 端poly A 尾。 RNase R 可以識別線性RNA 游離的3' 端，從而對其進(jìn)行降解，而circRNA 由于其環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并不能被RNase R 所識別，故與傳統(tǒng)線性RNA 相比，其具有更高的穩(wěn)定性。 本實驗利用其穩(wěn)定性這一特點(diǎn)，以期篩選出與死亡時間具有相關(guān)性的circRNA，用于法醫(yī)實踐中對死亡時間的推斷。

1 材料與方法

1.1 樣本

從濟(jì)寧市公安局和濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院司法鑒定中心收集18 例死亡時間在24 h 以內(nèi)的個體并提取其肋間肌。 選入標(biāo)準(zhǔn)：（1）死亡時間在 24 h 以內(nèi)，直至尸體被剖驗時為常溫保存；（2）排除遺傳性疾病及其他免疫性疾病和惡性腫瘤，以防影響circRNA 表達(dá)量檢測的準(zhǔn)確性；（3）尸體均為交通意外或刑事案件受傷后死亡，取材部位無損傷（表1）。 每例均詳細(xì)記錄其死亡時間、死因、年齡、性別等資料。 然后放置在人工氣候箱內(nèi)，模擬外界環(huán)境（溫度18 ℃，濕度60%），首先從濟(jì)寧市公安局的刑事案件中心收集芯片實驗選取2 例，皆因外傷死亡，已知死亡時間在 24 h 以內(nèi)，分別于尸檢即刻（12 h 以內(nèi)）、3、5、7、10 d 各取 50 g 肋間肌進(jìn)行實驗，用于制作circRNA 表達(dá)譜。 后期收集的18 例分別在尸檢即刻（12 h 以內(nèi)）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d 等時間點(diǎn)定點(diǎn)取樣，并立即置于液氮中凍存，最后統(tǒng)一進(jìn)行總RNA 提取，并進(jìn)行后續(xù)實驗。 收集到的上述樣本經(jīng)濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院倫理委員會審查批準(zhǔn)， 且符合相關(guān)規(guī)定。

表1 樣本個體詳細(xì)信息表

續(xù)表1

1.2 方法

1.2.1 基因芯片實驗

本實驗由上?？党缮镉邢薰緟f(xié)作完成，主要實驗步驟包括：

（1）樣本 RNA 抽提：采用 Tri20L 進(jìn)行 RNA 提?。╥nvitrogen）；（2）RNA 質(zhì)量檢測：測 OD 值計算濃度并評估純度（OD260/280 在 1.8～2.0 之間），瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 純度及完整性；（完整性比較好的總RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖呈現(xiàn)3 條帶，且3 條帶清晰無嚴(yán)重拖尾）；（3）使用 RNase R（Ribonuclease R，核糖核酸外切酶）（吉賽生物，R0301）消化線性RNA 分子；（4）使用逆轉(zhuǎn)錄試劑將去除線性 RNA 的RNA 反轉(zhuǎn)錄為帶有T7prometer 的 cDNA 序列，然后再將cDNA 轉(zhuǎn)錄成帶有熒光標(biāo)記的 cRNA 序列；（5）標(biāo)記效率質(zhì)量檢測：使用Nanodrop 檢測熒光標(biāo)記效率；（6）芯片雜交：在標(biāo)準(zhǔn)條件下將標(biāo)記好的探針和高密度基因組芯片進(jìn)行雜交；（7）圖像采集和數(shù)據(jù)分析：使用GenePix 4000B 芯片掃描儀掃描芯片的熒光強(qiáng)度，并將實驗結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)型數(shù)據(jù)保存。

1.2.2 具有顯著差異表達(dá)的circRNAs 的篩選

采用 P 值小于 0.05（P＜0.05）、差異表達(dá)倍數(shù)絕對值大于等于2（|logFoldChange|≥2）篩選出具有顯著差異的circRNA； 將差異circRNA 進(jìn)行STEM 分析，進(jìn)一步篩選出整體為下降趨勢的circRNA； 將上述篩選的circRNA 進(jìn)行熱圖分析，最終篩選出隨死亡時間的增加，相對表達(dá)量具有顯著差異的circRNAs。

1.2.3 引物設(shè)計

通過 cirbase 數(shù)據(jù)庫（http://www.circbase.org/）獲得circRNA 的序列，若序列太長則取首尾各150 bp進(jìn)行拼接，末尾150 bp 作為拼接后的首序列，將該300 bp 序列用primer-blast 進(jìn)行引物設(shè)計，具體參數(shù)根據(jù)引物設(shè)計原則進(jìn)行設(shè)置，然后選擇引物（circRNA PCR 產(chǎn)物必須包含首位拼接位點(diǎn)）。若有已報道circRNA 引物，則采用文獻(xiàn)中引物。

1.2.4 內(nèi)參基因選擇

在樣品處理過程中，RNA 水平的輕微變化都可以導(dǎo)致靶基因相對表達(dá)量的趨勢改變，而降解組織中又不存在合適且穩(wěn)定的參考基因。 大量數(shù)據(jù)表明miRNA 在死后組織中較為穩(wěn)定，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)mir-133a 作為參考標(biāo)志物為最佳。 因此，本研究對常用 GAPDH、β-Actin、mir133a-3p 的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，以篩選出最佳參考基因。

1.2.5 實時熒光定量RCR

本研究中Ct 值范圍在15～35 之間，每個樣本做 3 個復(fù)孔，復(fù)孔間 Ct 值 STD＜0.2。

（1）取備檢組織樣本采用 trizol（Invitrogen 公司）法提取總RNA，按說明書操作。 然后進(jìn)行電泳檢測其降解程度。 用NanoDrop2000c 紫外可見分光光度計檢測其純度及濃度。 采用mRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA 公司），將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 第一鏈，然后放置在-80℃下備用。（2）將上述的cDNA 樣本，應(yīng)用 TB Green Premix Ex Taq II （TAKARA 公司），在QuantStudio 7 Flex 實時熒光定量PCR 儀系統(tǒng)上進(jìn)行檢測，反應(yīng)總體系20μL；反應(yīng)程序參數(shù)：預(yù)變性 95 ℃ 30 s 后，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s 共 40 個循環(huán)。溶解曲線步驟：95 ℃ 5 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；冷卻溫度 50 ℃ 30 s。

1.3 統(tǒng)計分析

以△Ct 等于目的基因的CT 值減去內(nèi)參基因的CT 值，△△Ct 為不同死亡時間的△Ct 減去死亡當(dāng)天（12 h 以內(nèi)）的△Ct 所得，以 2代表目標(biāo)circRNA 在不同時間點(diǎn)相對死亡當(dāng)天（12 h 以內(nèi)）的差異表達(dá)倍數(shù)。 應(yīng)用SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗結(jié)果以x±s 進(jìn)行描述。 兩個時間點(diǎn)之間的結(jié)果進(jìn)行比較，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芯片實驗結(jié)果

火山圖（圖 1）由 log（FC）及-lg（P 值）所組成，水平線代表P 值，垂直線代表相對表達(dá)量上調(diào)或下調(diào)2 倍。圖中的紅點(diǎn)代表具有顯著差異的circRNAs。將第3、5、7、10d 的結(jié)果與死亡當(dāng)天（12h 以內(nèi)）相比，第 3 天具有差異表達(dá)的circRNAs 數(shù)目最多。

圖1 火山圖

2.2 基因芯片篩選結(jié)果

STEM 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分circRNAs 相對表達(dá)量表現(xiàn)為先上升、后下降的趨勢（圖2），部分circRNA 則一直呈下降趨勢（圖3）。

圖2 芯片結(jié)果中具有隨死亡時間的進(jìn)行，其相對表達(dá)量先升高再降低的基因簇

圖3 芯片結(jié)果中具有隨死亡時間的進(jìn)行，其相對表達(dá)量降低的基因簇

2.3 熱圖聚類分析

熱圖分析結(jié)果顯示為四個部分：熱圖、橫軸和縱軸、色鍵。 橫軸為樣本，縱軸為基因名稱，熱圖中每一個小格代表一個基因，顏色則表示為該基因的表達(dá)量。 色鍵即用于查看基因表達(dá)量的對比鍵，紅色代表高表達(dá)量，綠色代表低表達(dá)量。 實驗結(jié)果展示了表達(dá)量具有顯著差異的circRNAs（圖4）。

圖4 具有差異表達(dá)的circRNA 聚類圖

2.4 差異表達(dá)基因的篩選

對熱圖分析篩選出的具有相同變化趨勢的circRNAs 進(jìn)行進(jìn)一步分析，隨死亡時間推移，在10 d內(nèi)整體呈下降趨勢的circRNAs 有hsa_circ_0000284、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001727、hsa_circ_000 5251、hsa_circ_0001871、hsa_circ_0001946、hsa_circ_0001971 7 個，具體信息如表2。

表2 隨死亡時間表達(dá)下調(diào)的circRNAs

2.5 結(jié)果

2.5.1 引物序列信息

根據(jù)設(shè)計及查找所得序列如表3。

表3 引物序列

2.5.2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

根據(jù)引物序列進(jìn)行PCR 實驗后，電泳結(jié)果顯示每對引物特異性良好，均表現(xiàn)出單一條帶，且無二聚體產(chǎn)生，引物可用于后續(xù)實驗（圖5）。

圖5 電泳圖

2.6 內(nèi)參基因的選擇

根據(jù)NormFinder 軟件篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mir133a-3p 為在骨骼肌中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因（n=18，mir133a-3p vs GAPDH、mir133a-3p vs β-Actin，***P0.001）（圖 6）。

圖6 不同內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析結(jié)果

2.7 各目的基因的相對表達(dá)量隨死亡時間的變化

根據(jù)所篩選基因進(jìn)行Q-PCR 實驗， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)與死亡當(dāng)天（12 h 以內(nèi)）相比，在10 d 內(nèi)整體呈下降趨勢的基因有5 個，分別為hsa_circ_0000284、hsa_circ_000 5251、hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001871（n =18，* P＜ 0.05，**P＜ 0.01，***P＜ 0.001）（圖7）。

圖7 各目的基因的相對表達(dá)量隨死亡時間的變化

3 討論

因circRNA 具有組織特異性及高度穩(wěn)定性，目前在腫瘤、衰老、炎癥等方面研究較多，成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。 MENCZAK 等研究證實 circRNA 具有一定的組織、時序和疾病特異性，且對RNase R 具有較強(qiáng)的耐受性，不易受其降解。 FU 等研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005986 可以與 miR-129-5p 結(jié)合，起到miR-129-5p 海綿作用，從而抑制肝癌的發(fā)生，成為肝癌新的生物標(biāo)志物。DU 等發(fā)現(xiàn)circ-Foxo3 可通過抑制蛋白的抗衰老作用，使心肌細(xì)胞快速衰老。

circRNA 雖在多個領(lǐng)域的研究獲得突破，但其在法醫(yī)學(xué)方面進(jìn)行應(yīng)用研究的報道極為少見，尤其是利用其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、序列保守性及細(xì)胞或組織特異性表達(dá)等進(jìn)行的相關(guān)研究。 趙禾苗等根據(jù)circRNA 表達(dá)的組織特異性，選取了兩個circRNAs 進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)其在唾液、陰道分泌物、精液中廣泛存在，但具體的組織特異性circRNA 分子，仍在進(jìn)一步的探索中。 死亡時間推斷一直以來是法醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。 截至目前，雖已有多種死亡時間的推斷方法，但均易受外界環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致推斷結(jié)果出現(xiàn)較大誤差，嚴(yán)重影響案件的開展。 故此，法醫(yī)實踐工作中急需尋找一種準(zhǔn)確推斷死亡時間的方法。 本研究利用circRNA 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、序列保守性及細(xì)胞或組織特異性表達(dá)等特點(diǎn)，查找表達(dá)量高，穩(wěn)定性強(qiáng)，表達(dá)量與死亡時間的變化呈一定規(guī)律的circRNA，為在法醫(yī)實踐中準(zhǔn)確推斷死亡時間提供重要的參考依據(jù)。

肌肉組織是人體中最豐富的組織，在被皮膚較好保護(hù)的同時又容易提取。與內(nèi)臟和神經(jīng)組織相比，骨骼肌在死后變化方面有較大的延遲，但其分解速度仍比軟骨和骨骼要快。 因此，肌肉組織宜于在法醫(yī)實驗室進(jìn)行常規(guī)分析，是推斷中晚期死亡時間的一個常見候選組織。 本研究選用了分布范圍較廣，有肋骨保護(hù)，且與機(jī)體內(nèi)外充分接觸的肋間肌作為研究對象進(jìn)行死亡時間推斷研究。 結(jié)果表明肌肉組織可用于中晚期死亡時間推斷研究。

本實驗應(yīng)用了實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測circRNA 含量，因其靈敏度高、設(shè)備使用范圍廣、分析方法商業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是檢測RNA 的一種良好方法。此外，實時熒光定量PCR 結(jié)果的準(zhǔn)確性很大程度上取決于內(nèi)參指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化，選取穩(wěn)定的內(nèi)參指標(biāo)可以排除個體差異帶來的誤差，使統(tǒng)計結(jié)果更加客觀、準(zhǔn)確。 對于人體樣本，找到合適的內(nèi)參指標(biāo)用于RNA 表達(dá)水平的準(zhǔn)確定量至關(guān)重要。

已有報道稱在小鼠骨骼肌組織中miR-133a 和circAFF1 較為穩(wěn)定。通過查找小鼠mir-133a 序列，發(fā)現(xiàn)人miR-133a-3p 為其同源序列。 通過研究發(fā)現(xiàn)在降解的肌肉組織中，miR133a-3p 與常用的GAPDH、β-Action 相比，較為穩(wěn)定，適合作為該類實驗內(nèi)參基因。

基因芯片技術(shù)作為一種先進(jìn)的、大規(guī)模、高通量檢測技術(shù)，具有以下幾個方面的特點(diǎn)：一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性；二是快速簡便；三是可同時檢測多種基因。 每一個circRNA 對應(yīng)一個剪接點(diǎn)探針，能準(zhǔn)確可靠地檢測單一circRNA，即便在對應(yīng)線性RNA 存在的情況下也具有高特異性。circRNA 芯片目前涵蓋了人和小鼠的circRNA 位點(diǎn)。 本研究通過circRNA 芯片篩選得到了較多的circRNA，更有利于對circRNA 差異表達(dá)譜進(jìn)行全面、準(zhǔn)確的分析。 通過篩選最終發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000284、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001727 等 7 個與死亡時間具有負(fù)相關(guān)性的circRNAs。但在后續(xù)的驗證實驗中發(fā)現(xiàn)只有其中五個circRNAs 相對表達(dá)量隨死亡時間變化具有顯著差異，分別為hsa_circ_0000284、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001727、hsa_circ_0005251、hsa_circ_0001871，但hsa_circ_0001871 表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，提示只有部分的circRNA 降解具有穩(wěn)定的規(guī)律性變化，可根據(jù)其降解速度進(jìn)行死亡時間的推斷。

目前，circRNAs 相對表達(dá)量上升或下降的機(jī)理并不明確。 在正常生理情況下， JECK 等將circRNA的形成機(jī)制總結(jié)為“套索驅(qū)動環(huán)化”模型，及“內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化”模型，circRNA 來源于外顯子跳躍（exonskipping）事件，其會產(chǎn)生一個包含外顯子的套索結(jié)構(gòu)（exon-containing lariat），然后再經(jīng)過內(nèi)部拼接成一個由外顯子組成的circRNA。由此可見，任何外顯子跳躍事件都具有形成circRNA 的潛能，同時長側(cè)翼（long flanking introns）及豐富的ALU 重復(fù)序列都會增加其環(huán)化的能力。 LASDA 等研究認(rèn)為，circRNA 的降解機(jī)制或許和胞外囊泡共沉淀有關(guān)，circRNA 通過囊泡作用運(yùn)輸?shù)桨?，然后胞外囊泡被其他?xì)胞吸收，從而使得circRNA 被降解。 但也有研究發(fā)現(xiàn)，作為RNA 編輯因子（RNA-editing factor）的ADAR1 對有外顯子環(huán)化來源的 circRNA 具有抑制作用，敲除其所在位置的基因發(fā)現(xiàn)，部分circRNA 的表達(dá)量有所上升。 部分 circRNA 也可作為內(nèi)源競爭性RNA 在體內(nèi)被小干擾RNA（Small interfering RNA;siRNA）所降解。 最新的研究表明m6A 可以識別蛋白 YTHDF2 結(jié)合靶分子，募集HRSP12，進(jìn)而介導(dǎo)RNA 內(nèi)切核酸酶RNase P/MRP復(fù)合物切割靶分子，而這一過程可以作用于mRNA和 circRNA。 由此可見，對于 circRNA 的降解機(jī)制，目前仍沒有統(tǒng)一明確的解釋，仍需進(jìn)一步研究探討。

本實驗中也同時發(fā)現(xiàn)，部分circRNA 分子表達(dá)量的變化與死亡時間無相關(guān)性，如hsa_circ_ 0001946、hsa_circ_0001971，考慮或許是其受外界其他環(huán)境因素的影響所致，后續(xù)將繼續(xù)增加樣本數(shù)量，設(shè)置更多變量，尋找更加穩(wěn)定的circRNA 分子，以建立更加科學(xué)的數(shù)學(xué)模型，達(dá)到準(zhǔn)確推斷死亡時間的最終目的，從而為死亡時間的推斷開辟一條新的路徑。

本實驗篩選出了5 個隨死亡時間延長呈穩(wěn)定下降趨勢的circRNAs，可用于死亡時間的推斷研究。 circRNA 的穩(wěn)定性使其在陳舊、腐敗降解檢材的檢測中具有巨大優(yōu)勢，可以作為新興的法醫(yī)鑒定分子標(biāo)記使用。