離子液體液-液微萃取雞肉四環(huán)素HPLC 法的檢測(cè)

林志鑾，張傳海，馬春華，張靜，詹寶珍

（1.武夷學(xué)院 福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 武夷山 354300；2.武夷學(xué)院 茶與食品學(xué)院，福建 武夷山 354300；3.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

土霉素(OTC)、四環(huán)素(TC)、金霉素(CTC)、多西環(huán)素(DCC)屬四環(huán)素類(lèi)(TCs)抗生素，由于價(jià)格便宜和廣譜抗菌性被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)[1]。為此，GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[2]和GB 2763—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥殘留最大限量》[3]中對(duì)四環(huán)素的含量都有嚴(yán)格的規(guī)定。為此建立一種快速、準(zhǔn)確的分離、提取和檢測(cè)四環(huán)素方法顯得十分重要。

實(shí)驗(yàn)室中對(duì)四環(huán)素的主要提取方法有:固相微萃取發(fā)[4]、超聲萃取[5-6]、微波輔助萃取[7]、離子液體富集[8]等方法。離子液體（ionic liquid）具有萃取和分離弱極性、非極性、極性物質(zhì)的能力，廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物提取[9]。對(duì)均相萃取、異相分離的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作、易于放大等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用與對(duì)抗生素、農(nóng)殘、獸殘的富集、提取[10-11]。

論文建立離子液體液-液微萃取超聲波輔助提取法從雞肉中提取4 種四環(huán)素類(lèi)抗生素，并用高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography,HPLC)測(cè)定。探討離子液體種類(lèi)、用量，分散劑種類(lèi)、用量，超聲波時(shí)間對(duì)雞肉中的四環(huán)素萃取的影響，通過(guò)HPLC法測(cè)定雞肉中四環(huán)素的含量，以期為雞肉中痕量/超痕量四環(huán)素類(lèi)抗生素的分離富集提供一種新方法。

1 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

雞肉:散裝雞肉購(gòu)于武夷山某超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

四環(huán)素(TC)，土霉素(OTC)，北京百靈威科技公司，純度98%；多西環(huán)素(DCC)，金霉素(CTC)，美國(guó)Aladdin 公司，純度90%；甲酸，乙腈，國(guó)藥集團(tuán)，色譜純；甲醇,乙醇,丙酮，國(guó)藥集團(tuán)，1-丁基吡啶四氟硼酸鹽（[Bupy][BF4]）、溴化1-辛基-3-甲基咪唑（[OMIM]Br）、1-丁基-3 甲基咪唑六氟磷酸鹽([OMIn][PF6])，美國(guó)Aladdin 公司，分析純。實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

1.3 主要儀器設(shè)備

1260 高效液相色譜系統(tǒng)；C18色譜柱（TC，4.6 mm×150 mm，5 μm），美國(guó)安捷倫科技有限公司；TGL-21M，高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)責(zé)任公司；DHG-9071A，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ME55/05，分析天平，上海梅特勒-托利多儀器公司；S6H，超聲波清洗機(jī)，廈門(mén)致微儀器公司。

1.4 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)液的配置: 準(zhǔn)確稱取DCC、CTC、TC、OTC 標(biāo)準(zhǔn)品各0.01 g，溶解后轉(zhuǎn)移到10.00 mL 的容量瓶中定容，即為10.00 mg/mL。實(shí)驗(yàn)中所需的標(biāo)準(zhǔn)溶液均由該標(biāo)準(zhǔn)母液適當(dāng)稀釋后配制。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 色譜條件

流動(dòng)相:A 為0.20%甲酸水溶液，B 為水。洗脫程序流速:1.00 mL/min；柱溫:26 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng):350 nm，進(jìn)樣體積:10 μL。

表1 洗脫程序Table 1 Elution procedure

1.5.2 工作曲線測(cè)定

準(zhǔn)確配制DCC、CTC、TC、OTC 混合母液的濃度:0.50～50 μg/mL，按照1.5.1 色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣。以DCC、CTC、TC、OTC 峰面積為縱坐標(biāo)，DCC、CTC、TC、OTC 濃度為橫坐標(biāo)建立方程，并獲得相關(guān)系數(shù)R。

1.5.3 樣品前處理

雞肉經(jīng)過(guò)攪碎均質(zhì)處理后，準(zhǔn)確稱取10.00 g 雞肉樣品，加入20.00 mL 0.20%甲酸水溶液，在功率為100 W條件下超聲輔助提取30 min 后，粗提液減壓抽濾，轉(zhuǎn)移到50 mL 容量瓶中定容。準(zhǔn)確移取9.00 mL 粗提液于離心管中，加入450 μL 3.00%的離子液體與720 μL丙酮，使用超聲輔助提取，提取時(shí)間15 min，功率100 W。以4 000 r/min，4 ℃放入冷凍離心機(jī)中離心8 min。取底部溶液1.00 mL，過(guò)0.45 μm 濾膜，待測(cè)。

1.5.4 萃取劑的選擇

按照1.5.2 實(shí)驗(yàn)步驟，討論加入不同的離子液體（[OMIn][PF6]、[OMIM]Br、[Bupy][BF4]）及不同的分散劑（甲醇、丙酮、乙腈、乙醇）進(jìn)行微萃取對(duì)4 種四環(huán)素萃取的影響。

1.5.5 單因素實(shí)驗(yàn)

按照1.5.2 實(shí)驗(yàn)步驟，討論加入不同的離子液體體積分?jǐn)?shù)（1%、2%、3%、4%、5%），不同的分散劑用量（480、600、720、840、960 μL）、不同的微萃取時(shí)間（5、10、15、20、25 min）、不同的超聲功率（50、75、100、125、150 W）對(duì)4 種四環(huán)素萃取進(jìn)行考察和分析，重復(fù)3 次取其平均值，確定適宜的提取條件。

1.5.6 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn):取雞肉6 份，向其中5 份加入濃度為50 μg/mL，10 mL 的混標(biāo)準(zhǔn)，按照1.5.2 實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行提取，按照1.5.2 實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品加標(biāo)回收率。穩(wěn)定性試驗(yàn):按照1.5.2 實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)雞肉中四環(huán)素進(jìn)行提取，按照1.5.1 實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算其RSD%。重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn):按照1.5.2 實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，對(duì)雞肉中的四環(huán)素進(jìn)行平行提取6 次，并按照1.5.1 洗脫條件下進(jìn)行測(cè)定。最小檢測(cè)限試驗(yàn):在最低檢出濃度下測(cè)定6 次，根據(jù)3 倍的信號(hào)/噪聲來(lái)計(jì)算4 種四環(huán)素的最小檢出限。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 四環(huán)素分離及標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

2.1.1 4 種四環(huán)素分離效果

按照1.5.1 實(shí)驗(yàn)步驟，在此色譜洗脫的程序下，土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素這4 種四環(huán)素得到比較好的分離效果。其中4 種四環(huán)素在12 min 都出峰完畢，且全部基線分離。

圖1 4 種四環(huán)素分離效果圖Fig.1 Four kinds of tetracycline separation diagram

2.1.2 工作曲線的測(cè)定

在1.5.1 實(shí)驗(yàn)步驟下測(cè)定DCC、CTC、TC 和OTC 線性方程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在12 min 內(nèi)能分別洗脫DCC、CTC、TC 和OTC。其線性范圍為0.50～50 μg/mL，R≥0.995 2。其中DCC 的線性方程為Y=14.678X+8.632 1，R=0.998 7；CTC 的線性方程為Y=22.423X+27.087，R=0.995 2；TC 的線性方程為Y=11.303X+14.53，R=0.995 4；OTC 的線性方程為Y=1.3293X+1.851，R=0.995 3。

2.2 不同離子液體對(duì)4 種四環(huán)素萃取的影響

考察3種離子液體（[OMIn][PF6]、[OMIM]Br、[Bupy][BF4]）對(duì)DCC、CTC、TC、OTC 的萃取效果影響。結(jié)果如圖2 顯示，CTC、TC、OTC 和DCC 的經(jīng)過(guò)3 種離子液體進(jìn)行微萃取后，[OMIn][PF6]對(duì)四環(huán)素(TC)，多西環(huán)素(DCC)，金霉素(CTC)這3 種四環(huán)素的萃取效果最好，分別是0.20、0.58、0.49 μg/mL，但對(duì)土霉素(OTC)的萃取并不是最佳，綜合以上萃取數(shù)據(jù)，采用分[OMIn][PF6]作為萃取劑。

圖2 不同離子液體對(duì)4 種四環(huán)素萃取影響Fig.2 Effect of different ionic liquids on extraction of four tetracyclines

2.3 分散劑種類(lèi)對(duì)4 種四環(huán)素萃取的影響

考察4 種分散溶劑（甲醇、丙酮、乙腈、乙醇）對(duì)土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素的萃取效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 顯示，選擇丙酮作為分散劑，離子液體的萃取效率最高，此時(shí)4 種四環(huán)素的檢出量分別為0.54、0.61、0.26、0.26 μg/mL。因此，選擇丙酮作為最佳分散提取劑。這個(gè)可能的原因是甲醇、乙醇、乙腈的極性比較大，丙酮的極性相對(duì)以上3 種分散劑來(lái)的小，4種四環(huán)素分散在丙酮中的效果比較好。

圖3 分散劑種類(lèi)對(duì)4 種四環(huán)素萃取影響Fig.3 Effect of dispersants on extraction of four tetracyclines

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 離子液體濃度的優(yōu)化

考察不同的[OMIn][PF6]離子體積分?jǐn)?shù)（1%，2%，3%，4%，5%）對(duì)土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素的萃取效果。結(jié)果如圖4 顯示，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)逐漸增加到3%，萃取效率會(huì)達(dá)到最高值。此時(shí)，4 種四環(huán)素的含量為0.48、0.73、5.23、3.35 μg/mL。因此[OMIn][PF6]離子體積分?jǐn)?shù)最佳萃取濃度為3%為優(yōu)。

圖4 離子液體體積分?jǐn)?shù)對(duì)4 種四環(huán)素萃取影響Fig.4 Effect of ionic liquid concentration on extraction of four tetracyclines

2.4.2 分散劑用量的選擇

考察不同的丙酮分散劑用量（480、600、720、840、960 μL）對(duì)土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素的萃取效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5 顯示，當(dāng)分散劑用量為720 μL 時(shí)，萃取效果最好，4 種四環(huán)素的檢出量都達(dá)到最大，分別為0.59、0.47、15.46、9.29 μg/mL。因此分散劑丙酮用量是720 μL 為佳。

圖5 分散劑用量對(duì)4 種四環(huán)素萃取影響Fig.5 Effect of dispersant dosage on extraction of four tetracyclines

2.4.3 萃取時(shí)間的優(yōu)化

考察不同的萃取時(shí)間（5、10、15、20、25 min）對(duì)土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素的萃取效果的影響。結(jié)果如圖6 顯示，當(dāng)萃取時(shí)間為15 min 時(shí)，萃取效率最好，這個(gè)時(shí)候的四種四環(huán)素的檢出量都達(dá)到最大，分別為0.50、0.56、0.66、1.39 μg/mL。但當(dāng)時(shí)間超過(guò)15 min 時(shí)，萃取效率反而降低，這個(gè)可能是雞肉中的4 種四環(huán)素經(jīng)過(guò)超聲輔助提取后慢慢溶解出來(lái)，當(dāng)超聲波時(shí)間為15 min 溶解達(dá)到最大，超過(guò)15 min 后，由于超聲時(shí)間太久導(dǎo)致四環(huán)素被超聲破壞，雞肉中四環(huán)素含量降低。所以萃取時(shí)間為15 min 為優(yōu)。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)4 種四環(huán)素萃取影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on extraction of four tetracyclines

2.5 方法學(xué)試驗(yàn)

樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn):取雞肉6 份，向其中5 份加入濃度為50 μg/mL，10 mL 的混標(biāo)準(zhǔn)，按照1.5.2 實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行提取和測(cè)定，計(jì)算樣品加標(biāo)回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:4 種四環(huán)素的樣品加標(biāo)回收率在80.70%～112.10%時(shí)間。

穩(wěn)定性試驗(yàn): 按照1.5.2 實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)雞肉中四環(huán)素進(jìn)行提取，按照1.5.1 實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算其RSD 值為3.78%。重現(xiàn)性試驗(yàn):按照1.5.2實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，對(duì)雞肉中的四環(huán)素進(jìn)行平行提取6次，并按照1.5.1 洗脫條件下進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算其RSD值為1.32%。最小檢測(cè)限試驗(yàn):在最低檢出濃度下測(cè)定6 次，根據(jù)3 倍的信號(hào)/噪聲來(lái)計(jì)算4 種DCC、CTC、TC、OTC 的檢出限分別在0.50、0.10、0.10、0.10 μg/mL。

表2 四種四環(huán)素的樣品加標(biāo)回收率（n=5）Table 2 The recoveries of four tetracycline samples were determined (n=5)

3 結(jié)論

利用[OMIN][PF6]離子液體和超聲波輔助提取法從雞肉中提取4 種四環(huán)素類(lèi)抗生素（土霉素(OTC)、四環(huán)素(TC)、金霉素(CTC)、多西環(huán)素(DCC)），并采用高效液相色譜法測(cè)定DCC、CTC、TC 和OTC。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:以濃度為3%萃取體積為450 μL [OMIN][PF6]提取劑，720 μL 丙酮為分散劑，超聲提取時(shí)間為15 min。在最優(yōu)的萃取條件下，用高效液相色譜法測(cè)定雞肉4種四環(huán)素，發(fā)現(xiàn)DCC、CTC、TC 和OTC 未檢出；在12 min 內(nèi)分別洗脫DCC、CTC、TC 和OTC。DCC、CTC、TC和OTC 的檢出限分別為0.50、0.10、0.10 和0.10 μg/mL。DCC 的線性范圍為0.50～50 μg/mL，r≥0.995 2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:用高效液相色譜法能滿足快速檢測(cè)雞肉中的DCC、CTC、TC 和OTC。