G蛋白偶聯(lián)受體75信號通路在20-羥二十烷四烯酸誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用*

劉嬌莉， 吉雨恬， 毛 凌， 郭立榮， 韓 勇

（遵義醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563000）

20-羥二十烷四烯酸（20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE）是由花生四烯酸經(jīng)細(xì)胞色素P450 酶途徑的CYP4A/4F 酶催化ω-羥基代謝生成的血管活性脂［1］。近年研究表明，20-HETE與多種心臟疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如冠心病、心肌梗死和心肌缺血再灌注損傷和心肌肥大等［2］，但20-HETE 引起心肌損傷的受體機(jī)制尚不清楚。

G 蛋白偶聯(lián)受體75（G-protein-coupled receptor 75，GPR75）是G 蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled re?ceptors，GPCRs）家族一員，發(fā)現(xiàn)以來一直被列為孤兒受體［3］。在人血管內(nèi)皮細(xì)胞及大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞中的研究中發(fā)現(xiàn)，20-HETE 與GPR75 具有高親和性，且20-HETE 通過綁定并激活GPR75 從而影響血管功能并引發(fā)高血壓［4］，提示GPR75 可能是20-HETE發(fā)揮心血管活動調(diào)節(jié)的作用受體。然而，在心肌細(xì)胞中是否同樣存在20-HETE-GPR75 配對機(jī)制，并介導(dǎo)20-HETE 的心肌損傷作用，尚鮮有研究。我們既往觀察到GPR75在大鼠H9c2心肌細(xì)胞中表達(dá)，且敲減GPR75后抑制了20-HETE 誘導(dǎo)的H9c2 心肌細(xì)胞凋亡［5］。在此研究基礎(chǔ)上，本文擬在原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞中，進(jìn)一步探索GPR75 及其介導(dǎo)的信號通路在20-HETE 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。

材料和方法

1 動物

SD 大鼠的新生1～3日齡乳鼠購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（湘）2019-0014。本實驗經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會同意，符合中國國家實驗動物倫理的相關(guān)規(guī)定。

2 主要試劑

20-HETE 購自Cayman Chemical；慢病毒包裝試劑盒購自GeneCopoeia；U73122、2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯（2-aminoethoxydiphenyl borate，2-APB）、GF109203X 和apocynin 購自MCE；兔抗GPR75 抗體和小鼠抗細(xì)胞色素C（cytochrome C，CytC）抗體購自CST；小鼠抗caspase-3 抗體購自Abcam；抗β-actin 抗體及辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的Ⅱ抗購自Proteintech；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光SYBR Green I 購自TaKaRa；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、鈣熒光探針Fluo-3/AM 和二氫乙啶（dihy?droethidine，DHE）熒光探針購自北京索萊寶生物科技有限公司；ELISA試劑盒購自江萊生物。

3 主要方法

3.1 心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)按照本實驗室前期建立的方法進(jìn)行原代SD 乳鼠心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)［6］。0.25%胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶在37 ℃磁力攪拌恒溫水浴鍋中重復(fù)消化SD 大鼠新生1～3 d 乳鼠心臟組織，200 ×g離心10 min 收集細(xì)胞沉淀，加入含15% 胎牛血清、青霉素和鏈霉素（1×105U/L，0.1 mg/L）的DMEM/F12 培養(yǎng)液于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)90 min，利用差速貼壁法將分離的心肌細(xì)胞懸液加入5?溴脫氧尿嘧啶核苷（100 μmol/L）置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.2 慢病毒重組載體轉(zhuǎn)染參考我們已報道的方法進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染［5］。GPR75shRNA（shGPR75）的靶向序列為：5'-CCCTATCCCTTCTGTTTAATA-3'。shControl 靶向序列為：5'-ACAGAAGCGATTGATC-3'。在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞融合度為60%～70% 時，將滴度為1×1011TU/L的慢病毒重組載體shGPR75和相應(yīng)空載體shControl 轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，RT-qPCR 和Western blot 檢測轉(zhuǎn)染效率。

3.3 實驗分組shControl轉(zhuǎn)染對照組（control組）與慢病毒轉(zhuǎn)染組（shGPR75 組）細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)24 h 后，開展后續(xù)實驗。培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞使用20-HETE（100 nmol/L）孵育處理24 h（20-HETE 組），其他組別細(xì)胞依據(jù)不同實驗?zāi)康?，?0-HETE 處理前1 h，參考相關(guān)文獻(xiàn)分別加入不同濃度的預(yù)處理藥物：U73122（1 μmol/L）、2-APB（100 μmol/L）、GF109203X（1 μmol/L）和apocynin（100 μmol/L）進(jìn)行藥物干預(yù)，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

3.4 RT-qPCR檢測GPR75 mRNA 表達(dá)水平Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 進(jìn)行實時熒光定量實驗，GPR75 的上游引物序列為5'-GCCA?CAAGCCTGGTCTACAAA-3'，下游引物序列為5'-GT?GCTCTGGTGCCTGCGATAC-3'；GAPDH 的上游引物序列為5'-TCTCTGCTCCTCCCTGTTC-3'，下游引物序列為5'-ACACCGACCTTCACCATCT-3'。反應(yīng)條件為：94 ℃30 s；94 ℃5 s，60 ℃30 s，共40個循環(huán)。實驗結(jié)果以GAPDH 作為內(nèi)參照，采用2?ΔΔCt進(jìn)行結(jié)果分析。

3.5 Western blot 檢測GPR75、CytC 和caspase-3 蛋白水平各分組細(xì)胞經(jīng)不同藥物處理后，RIPA 裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后封閉，分別加入兔抗GPR75 多克隆抗體（1∶300）、小鼠抗Cyt C抗體（1∶300）、小鼠抗caspase-3 抗體（1∶500）和小鼠抗β-actin 單克隆抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，再加入抗小鼠HRP-IgG（1∶5 000）及抗兔HRP-IgG（1∶5 000）Ⅱ抗，室溫孵育1 h，ECL 法顯影，采用ImageJ 1.48軟件分析目標(biāo)蛋白及內(nèi)參照的灰度計算蛋白表達(dá)相對含量。

3.6 ELISA 法檢測三磷酸肌醇（inositol triphos?phate，IP3）含量及蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和NADPH 氧化酶活性按照廠商提供的ELISA 試劑盒說明書操作，各組細(xì)胞取等量蛋白提取液，加入所對應(yīng)的HRP 標(biāo)記的檢測抗體，37 ℃孵育1 h 后洗板5 次，加底物顯色劑后避光孵育15 min，最后加入終止液停止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀450 nm 波長下測各孔吸光度（A）值。繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算細(xì)胞內(nèi)IP3含量以及PKC和NADPH氧化酶活性。

3.7 Fluo-3/AM 法檢測Ca2+含量將細(xì)胞接種于共聚焦皿，藥物處理后，加入5 %的Pluronic F?127 及Fluo?3/AM（5 μmol/L）熒光探針37 ℃避光孵育50 min，激光共聚焦顯微鏡觀察，激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm 下產(chǎn)生綠色熒光，ZEN 2.3 軟件分析平均綠色熒光強(qiáng)度。

3.8 DHE 熒光探針檢測活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）含量將細(xì)胞接種于共聚焦皿，藥物處理后，加入DHE 熒光探針37 ℃避光孵育40 min，激光共聚焦顯微鏡觀察，激發(fā)波長510 nm、發(fā)射波長580 nm 下產(chǎn)生紅色熒光，采用ZEN 2.3 軟件分析平均紅色熒光強(qiáng)度。

3.9 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡4% 多聚甲醛固定各分組細(xì)胞，TUNEL 工作液37 ℃避光孵育1 h，DAPI溶液避光復(fù)染細(xì)胞核，抗熒光衰減劑封片。熒光顯微鏡下隨機(jī)挑選5個200倍視野，統(tǒng)計每個視野中的凋亡細(xì)胞數(shù)目（綠色熒光）與總細(xì)胞數(shù)目（藍(lán)色熒光）的比值即為凋亡率。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD 法）。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 敲減GPR75 及20-HETE 對乳鼠心肌細(xì)胞GPR75表達(dá)影響

與control 組相比，慢病毒shGPR75 轉(zhuǎn)染組乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)GPR75 的mRNA 表達(dá)水平降低（P<0.05）；使用20-HETE（100 nmol/L）處理乳鼠心肌細(xì)胞24 h 后，GPR75 mRNA 水平較control 組升高（P<0.05）。與mRNA 表達(dá)一致，shGPR75 組GPR75 蛋白表達(dá)亦較control 組顯著降低（P<0.05）；經(jīng)20-HETE處理后，細(xì)胞內(nèi)GPR75 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），見圖1。

2 敲減GPR75 及磷脂酶C（phospholipase C，PLC）抑制劑U73122 對20-HETE 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)IP3生成的影響

ELISA 檢測結(jié)果顯示，與control 組相比，乳鼠心肌細(xì)胞使用20-HETE 處理后，細(xì)胞內(nèi)IP3含量升高（P<0.05）；與20-HETE 組相比，敲減GPR75或應(yīng)用PLC 抑制劑U73122 處理可顯著抑制20-HETE 誘導(dǎo)IP3生成的作用（P<0.05）；與control組相比，shGPR75組和U73122組IP3無顯著改變（P>0.05），見圖2。

3 敲減GPR75 及U73122、IP3 受體（IP3 receptor，IP3R）阻斷劑2-APB 對20-HETE 誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

Figure 1.Effects of GPR75 knockdown or 20-HETE administration on mRNA and protein expression of GPR75 in NRCMs.Mean ±SD. n = 4.*P < 0.05 vs control group；#P< 0.05 vs 20-HETE group.圖1 敲減GPR75及20-HETE對乳鼠心肌細(xì)胞GPR75表達(dá)的影響

Figure 2.Effects of GPR75 knockdown or PLC inhibitor U73122 administration on the 20-HETE-induced IP3 production in NRCMs.20 ? HETE-treated induced a significant increase in IP3 production.Knockdown of GPR75 or pre-treatment with U73122 blocked the ef?fects of 20-HETE-indeuced IP3 production.Mean±SD. n=4.*P< 0.05 vs control group；#P< 0.05 vs 20-HETE group.圖2 敲減GPR75 及U73122 對20-HETE 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)IP3生成的影響

激光共聚焦檢測結(jié)果顯示，與control 組相比，20-HETE 處理組乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度（［Ca2+］i）升高（P<0.05）；而敲減GPR75或應(yīng)用PLC 抑制劑U73122處理可顯著抑制20-HETE 誘導(dǎo)Ca2+濃度升高效應(yīng)（P<0.05）；此外，與20-HETE 組相比，IP3R 阻斷劑2-APB 預(yù)處理亦可減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度（P<0.05）；與control 組相比，單獨shGPR75 組、U73122組 以 及2-APB 組［Ca2+］i無顯著變化（P>0.05），見圖3。

4 敲 減GPR75 及PKC 抑制劑GF109203X、NADPH 氧化酶抑制劑apocynin 對20-HETE 誘導(dǎo)ROS生成的影響

DHE 熒光染色結(jié)果顯示，與control 組相比，20-HETE 處理組乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS 含量顯著升高（P<0.05）；而敲減GPR75或應(yīng)用PKC抑制劑GF109203X 處理可顯著抑制20-HETE 誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS 生成（P<0.05）；此外，與20-HETE 組相比，應(yīng)用NADPH 氧化酶抑制劑apocynin 后，細(xì)胞內(nèi)ROS 生成亦減少（P<0.05）；與control 組相比，單獨shGPR75組、GF109203X 組以及apocynin 組ROS 含量均無顯著改變（P>0.05），見圖4。

5 敲減GPR75 對20-HETE 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞PKC 及NADPH氧化酶活性的影響

ELISA 檢測結(jié)果顯示，與control 組相比，20-HETE處理組乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)PKC和NADPH氧化酶活性均顯著升高（P<0.05）；而敲減GPR75后，20-HETE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)PKC和NADPH氧化酶活性顯著降低（P<0.05）；shGPR75 組與control 組相比，PKC 和NADPH 氧化酶活性無顯著差異（P>0.05），見圖5。

Figure 3.Effects of knockdown of GPR75，pre-treatment with PLC inhibitor U73122 or IP3R inhibitor 2-APB on the 20-HETE-in?duced increase of ［Ca2+］i in NRCMs by Fluo-3/AM staining.Mean ± SD. n= 4.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs 20-HETE group.圖3 敲減GPR75及U73122、2-APB預(yù)處理對20-HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

6 敲減GPR75 及U73122、GF109203X 對20-HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL 檢測結(jié)果顯示，與control 組相比，20-HETE 處理組心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加（P<0.05）；同時，Western blot結(jié)果顯示，20-HETE 組心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白CytC 以及caspase-3 蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）；而敲減GPR75表達(dá)則顯著抑制了20-HETE的如上作用（P<0.05）；同時，使用U73122阻斷PLC 信號通路或者使用GF109203X 阻斷PKC 信號通路后，20-HETE 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和CytC、cas?pase-3 蛋白表達(dá)均被抑制（P<0.05）；與control 組相比，單獨shGPR75 組、U73122 組或GF109203X 組心肌細(xì)胞凋亡率、CytC 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平均無顯著改變（P>0.05），見圖6。

討 論

GPR75 受體自發(fā)現(xiàn)以來一直被列為孤兒受體［3］，在對其進(jìn)行去孤兒化的研究中，有學(xué)者［7-9］首先報道炎性趨化因子CCL5具有激活GPR75受體作用，并通過該受體參與神經(jīng)細(xì)胞功能保護(hù)以及胰島素分泌等作用，但如上研究并未提供CCL5與GPR75受體直接綁定的實驗證據(jù)。Garcia 等［4］報道在人內(nèi)皮細(xì)胞及大鼠平滑肌細(xì)胞中，20-HETE 可通過激活并綁定GPR75 受體影響血管功能并引發(fā)高血壓。隨后Cárdenas 等［10］和Gilani 等［11］分別在前列腺癌PC-3 細(xì)胞和3T3-1 分化的脂肪細(xì)胞中，同樣觀察到20-HETE-GPR75 受體配對機(jī)制，并在腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、胰島素的合成與分泌等方面發(fā)揮重要作用。在最新的一項研究中，Pascale 等［12］進(jìn)一步報道了20-HETE 是GPR75 受體的高親和力配體，而CCL5 則起到抑制20-HETE 激活GPR75 受體信號通路的作用。如上研究提示20-HETE可能是GPR75受體的天然配體，但尚需在多種組織器官中加以證實。心臟是20-HETE 發(fā)揮生理、病理調(diào)節(jié)作用的重要器官，但心肌組織中是否表達(dá)GPR75受體并介導(dǎo)20-HETE的生物作用，目前鮮有報道。

Figure 4.Effects of GPR75 knockdown，PKC inhibitor GF109203X or NADPH oxidase inhibitor apocynin on 20-HETE-induced ROS generation in NRCMs（DHE staining）.Mean±SD. n=4.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs 20-HETE group.圖4 敲減GPR75及GF109203X、apocynin對20-HETE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ROS生成的影響

Figure 5.Effects of GPR75 knockdown on activity of PKC and NADPH oxidase in NRCMs induced by 20-HETE.Mean±SD. n=4.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs 20-HETE group.圖5 敲減GPR75 對20-HETE 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)PKC 及NADPH氧化酶活性的影響

Figure 6.Effects of knockdown of GPR75，PLC inhibitor U73122 or PKC in hibitor GF109203X on 20-HETE-induced apoptosis in NRCMs.A：representative images of TUNEL staining；B：bar graph representing percentages of apoptotic cells；C：the pro?tein levels of Cyt C and caspase-3 detected by Western blot.Mean±SD. n=5.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs 20-HETE group.圖6 敲減GPR75及U73122、GF109203X對20-HETE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

我們既往及本研究觀察到，在大鼠H9c2 細(xì)胞和乳鼠心肌細(xì)胞中，GPR75 受體在mRNA 及蛋白水平表達(dá)，且20-HETE 孵育后可顯著促進(jìn)培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞中GPR75的表達(dá)。當(dāng)采用慢病毒轉(zhuǎn)染方法敲減GPR75表達(dá)后，顯著抑制了20-HETE 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。應(yīng)用慢病毒載體轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行干擾RNA基因表達(dá)，相比于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑法、電穿孔法和脂質(zhì)體法等轉(zhuǎn)染細(xì)胞，該方法具有感染廣泛、基因組整合穩(wěn)定、轉(zhuǎn)移基因可長期表達(dá)等特點［13］。有比較研究表明，對于心肌細(xì)胞采用病毒載體進(jìn)行基因干擾相比于其他方法更為高效和穩(wěn)定［14］。Consonni 等［15］在培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞中報道，采用慢病毒轉(zhuǎn)染干擾基因表達(dá)可防止心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及功能損傷。因此，本研究采用了慢病毒轉(zhuǎn)染降低乳鼠心肌細(xì)胞GPR75基因表達(dá)，觀察其對20-HETE 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡作用的影響。

GPR75被激活后可活化與其偶聯(lián)的Gαq蛋白，后者經(jīng)細(xì)胞膜PLC 水解磷脂酰肌醇4，5 二磷酸生成細(xì)胞內(nèi)重要第二信使—IP3，并最終激活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號通路［4，16］。因此，細(xì)胞內(nèi)IP3累積被認(rèn)為是GPCRs激活的重要標(biāo)志物。本研究觀察到20-HETE 具有促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)IP3生成的作用，且敲減GPR75表達(dá)或者使用U73122 抑制PLC 作用均可阻斷20-HETE 的該效應(yīng)，提示在心肌細(xì)胞中20-HETE 具有激活GPR75 德作用。但是，后續(xù)研究中需要深入觀察20-HETE 對GPR75受體的內(nèi)化激活、招募β-arrestin、下游信號激酶的磷酸化等方面的作用，以進(jìn)一步確定20-HETE與GPR75在心肌細(xì)胞中的配對機(jī)制。

IP3生成增加還可激活細(xì)胞內(nèi)IP3受體門控通道引起肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放，導(dǎo)致Ca2+調(diào)控紊亂從而誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣超載［17］。Ca2+在心肌細(xì)胞的功能與代謝活動中發(fā)揮關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，Ca2+調(diào)控的穩(wěn)態(tài)失衡不僅影響心肌細(xì)胞收縮、舒張功能，且由其引發(fā)的鈣超載是心肌損害的最終通路［18］。我們之前的研究曾報道，20-HETE 具有升高心肌細(xì)胞［Ca2+］i的作用，是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡繼而造成缺血性心肌損傷的重要機(jī)制［6，19］。在本研究中觀察到，敲減GPR75表達(dá)、阻斷PLC 信號通路或者抑制IP3R 受體作用后，20-HETE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i升高效應(yīng)均被顯著逆轉(zhuǎn)，提示20-HETE-GPR75 受體配對在造成心肌細(xì)胞鈣超載繼而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用，其機(jī)制與GPR75 受體激活后介導(dǎo)的PLC/IP3/Ca2+信號通路密切相關(guān)。

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）過量生成是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、加重心肌損傷的另一重要因素。ROS 的過量生成將引起細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多種亞細(xì)胞成分過氧化損傷，如降解膜磷脂，攻擊蛋白質(zhì)及損傷DNA，最終引起細(xì)胞凋亡，而且由于心肌組織中缺乏抗氧化酶，其對于ROS的敏感性要高于其他組織器官［20-21］。NADPH 氧化酶是促進(jìn)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS 生成的重要來源［22］，且我們前期研究觀察到，在大鼠離體心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）模 型中，20-HETE 可通過激活NADPH 氧化酶途徑誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS過量生成，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，最終加重再灌注后心肌梗死面積的發(fā)生［23］。另外一項研究表明，在培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞中，20-HETE 通過PKC 依賴機(jī)制激活NADPH 氧化酶從而誘導(dǎo)ROS生成［19］；此外，20-HETE 還可通過誘導(dǎo)ROS 生成參與血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［24］。與上述研究一致，在本實驗中觀察到，應(yīng)用PKC 抑制劑GF109203X 或者NADPH 氧化酶抑制劑apocynin 預(yù)處理均可減少20-HETE 誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS 生成。而敲減GPR75表達(dá)后，除細(xì)胞內(nèi)ROS 生成顯著減少外，20-HETE 誘導(dǎo)的PKC 以及NADPH 氧化酶活性亦顯著降低。如上結(jié)果提示，20-HETE 可通過GPR75 受體發(fā)揮促細(xì)胞內(nèi)ROS 生成作用，其機(jī)制與GPR75 受體介導(dǎo)的PKC/NADPH/ROS 信號通路有關(guān)。最后，本實驗還觀察到敲減GPR75表達(dá)、應(yīng)用PLC 抑制劑U73122 以及PKC抑制劑GF109203X處理可顯著抑制20-HETE誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡，同時顯著下調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cyt C和caspase-3蛋白的表達(dá)。

綜上所述，敲減GPR75可阻斷20-HETE 誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡，GPR75 介導(dǎo)的PLC/PKC 信號通路參與了20-HETE 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)程，提示敲減GPR75或者阻斷GPR75下游信號通路的作用可能是減少20-HETE 導(dǎo)致實驗動物心肌損傷的有效策略，后續(xù)實驗需在大鼠MIRI 或心肌梗死等模型中進(jìn)一步研究證實。