腦膜淋巴管在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中作用和機制的研究進展*

莫 瀾， 孟 波， 袁 檜， 劉榮君， 王瑞春， 陳駿萍，△， 盧 波△

（1寧波大學醫(yī)學院，浙江 寧波 315211；2中國科學院大學寧波華美醫(yī)院，浙江 寧波 315000）

淋巴系統(tǒng)承擔著將來自全身組織的體液回收入心臟，輔佐激素、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)入血以及免疫監(jiān)視從而控制感染擴散的角色，對維持體液平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關重要。淋巴管是淋巴系統(tǒng)中不可或缺的組成部分之一，人體絕大多數(shù)器官通過淋巴管清除來自細胞產(chǎn)生的代謝廢物。過去人們普遍認為，由于大腦缺乏淋巴管體系，故其為一個特殊的免疫豁免器官，大腦如何清除腦代謝廢物也一直是個未解之謎，直至2015年在小鼠腦被膜的最外層，即硬腦膜中發(fā)現(xiàn)了腦膜淋巴管（meningeal lymphatic ves?sels，MLVs）這一結構，并證實這些管路能直接將腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）引流至外周的頸深淋巴結（deep cervical lymph nodes，DCLNs）處［1-2］，這一顛覆性的發(fā)現(xiàn)隨即引發(fā)了關于這一過程潛在機制的探討。隨后Absinta等［3］于2017年使用磁共振成像技術（magnetic resonance imaging，MRI）觀察到人類和靈長類動物同樣存在MLVs。自此有越來越多的國內(nèi)外學者開展一系列針對該結構與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病之間聯(lián)系的研究。本文圍繞MLVs 的解剖和功能展開，進一步探討MLVs與CSF 引流及膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)（glymphatic system）的關系，總結了近年來MLVs與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關研究成果，并闡述了目前已知的MLVs調(diào)控這些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用機制。

1 MLVs的解剖和功能

淋巴管是由淋巴內(nèi)皮細胞（lymphatic endothelia vessels，LECs）構成的單向流動管路。LECs特異性表達prospero相關同源異形盒1（prospero-related homeo?box-1，PROX-1）、淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體1（lym?phatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1，LYVE-1）和血管內(nèi)皮生長因子受體3（vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3），調(diào)控淋巴管的生長發(fā)育。2015年Louveau等［1］和Aspelund等［2］相繼獨立報道了淋巴管存在于小鼠的硬腦膜竇血管周圍?；贚ECs 的特性，Louveau 等［1］對小鼠硬腦膜進行LYVE-1 免疫染色標記，發(fā)現(xiàn)硬腦膜竇血管周圍存在LYVE-1+的管路，并觀察到內(nèi)部含有CD3e+的T 細胞，證實了腦膜中存在淋巴管網(wǎng)絡；接著向小鼠的枕池中注射Evans blue 行CSF 染色，觀察到淋巴管和DCLNs逐一被染色，而切除DCLNs會造成腦膜中的T細胞數(shù)增多，進一步證明這些管路具備引流CSF和免疫細胞至外周淋巴結的功能。Aspelund 等［2］通過類似的免疫標記方法不僅僅在小鼠的上矢狀竇旁檢測到淋巴管，還在篩板、乙狀竇、橫竇、鼻嘴靜脈、腦膜中動脈和翼腭動脈等周圍均顯示出淋巴管的存在，并證實它們能從蛛網(wǎng)膜下腔吸收腦內(nèi)的腦間質(zhì)液（interstitial flu?id，ISF）和CSF，轉運至下游DCLNs。因這些淋巴管獨特的解剖結構，故稱之為MLVs。

MLVs 由完全分化的低LECs 排列而成，相比外周淋巴管而言更加細小，而且缺乏防止淋巴倒流的瓣膜結構［1-2］。根據(jù)顱腦解剖特點可將MLVs 劃分為沿上矢狀竇及橫竇走行的顱背側MLVs 和沿巖竇及乙狀竇走行的顱底側MLVs，后者較前者的管路更為豐富并且含有清晰的淋巴管瓣膜，在CSF 引流中發(fā)揮主要作用［4-5］，前者則具備更強的介導炎癥因子、T細胞、樹突狀細胞進入外周系統(tǒng)的免疫功能［6-7］。

Antila 等［8］對不同時期小鼠的硬腦膜進行免疫熒光標記，觀察到與胚胎時期就開始發(fā)育的外周淋巴系統(tǒng)不同，MLVs 是在出生后發(fā)育形成的，它們首先出現(xiàn)在顱骨和椎管底部的孔周，然后沿著動靜脈、腦神經(jīng)和脊神經(jīng)延至腦膜的各個區(qū)域。此外，基于血管內(nèi)皮生長因子受體C（vascular endothelial growth factor receptor-C，VEGFR-C）主要表達于血管平滑肌細胞以及VEGFR-3 作為VEGF 的酪氨酸激酶受體主要表達于淋巴管內(nèi)皮細胞的特性，該團隊在成年小鼠身上進行了相關研究，發(fā)現(xiàn)VEGF-C或VEGFR3缺失會使MLVs 消退，從而損害其引流CSF 的功能，而過量的VEGF-C 能誘導MLVs 生成［8］。這些證據(jù)表明，MLVs 具備一定的可塑性和再生能力，或許能通過MLVs塑型來調(diào)控某些CNS疾病的病理生理過程。

2 MLV、CSF引流及glymphatic系統(tǒng)三者的關系

在發(fā)現(xiàn)MLVs 之前就已經(jīng)有研究報道能在DCLNs 中檢測到注入CSF 或腦實質(zhì)中的熒光標記物［9-10］。 近年來實時成像技術顯示MLVs 能吸收CSF［6］，而剝奪VEGF-C 或化學消融消除MLVs 會大大減少DCLNs 中的熒光標記物［5，8］。這些證據(jù)均說明MLVs具備引流CSF 至外周淋巴結的功能，提示我們MLVs 結構和功能的改變可能是CNS 疾病的進展機制之一。但缺失MLVs 的小鼠與正常小鼠的CSF壓力無明顯差異［2，6］，所以MLVs 在被破壞后，其引流CSF的功能也許會被其他CSF引流途徑所代償。

2012年，Iliff等［11］向小鼠枕池中注射熒光標記物標記CSF，然后使用雙光子顯微鏡觀察這些熒光標記物的走向表明：CSF能穿過動脈周圍的血管旁間隙進入腦實質(zhì)，與腦ISF對流交換后一并從靜脈旁的血管周圍間隙流出，起到清除包括淀粉樣蛋白在內(nèi)的腦代謝廢物的作用，由于這一途徑與外周淋巴系統(tǒng)在功能上相似，且受星形膠質(zhì)細胞終板上的水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）極化的正向調(diào)控，故將其命名為glymphatic 系統(tǒng)。血管旁間隙由星形膠質(zhì)細胞的終板圍繞血管構成，AQP4 高度表達于終板上，敲除小鼠AQP4基因會導致從蛛網(wǎng)膜下腔流入腦實質(zhì)內(nèi)的CSF 及從腦實質(zhì)流出的ISF減少，也陸續(xù)有研究報道該系統(tǒng)還受晝夜節(jié)律、年齡、睡眠、呼吸、脈搏、體位及MLVs 等影響［11-17］。盡管破壞小鼠MLVs 后并不影響其顱內(nèi)CSF 含量，但敲除AQP4基因的小鼠腦部含水量增加［12］，提示由glymphatic 系統(tǒng)通過AQP4介導調(diào)節(jié)CSF-ISF對流參與維持顱內(nèi)液體穩(wěn)態(tài)。

總之，glymphatic系統(tǒng)在腦ISF和CSF的溶質(zhì)交換中起著關鍵作用，有助于腦代謝廢物通過CSF排泄出大腦，MLVs能夠將CSF引流至外周的DCLNs，故從理論上推斷，glymphatic 系統(tǒng)、MLVs及DCLNs共同構成了一條新的顱內(nèi)至外周的引流途徑，參與CSF循環(huán)和腦代謝廢物運輸，見圖1。然而，該條途徑是否真實存在及其對CSF引流的影響程度目前仍有待考究。

3 MLVs與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病

盡管研究人員一直在努力探索中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理機制，但仍存在諸多未解之謎。近年來，MLVs 的發(fā)現(xiàn)為探尋中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展及預后的本質(zhì)原理打開了一扇全新的大門。

Figure 1.Diagram of cerebral waste excretion through the glym?phatic system-meningeal lymphatic vessels（MLVs）-deep cervical lymph nodes（DCLNs）pathway.圖1 腦代謝廢物經(jīng)glymphatic 系統(tǒng)-MLVs-DCLNs 途徑排泄示意圖

3.1 MLVs 對神經(jīng)退行性疾病的影響既往研究表明，老齡小鼠顱內(nèi)CSF 從MLVs的流出量較年輕小鼠明顯減少［5］，提示MLVs 可能參與年齡相關神經(jīng)退行性疾病的病理生理過程。阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是目前全球范圍內(nèi)最常見的認知功能障礙疾病，β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）大量沉積在神經(jīng)元周圍和Tau 蛋白在神經(jīng)元內(nèi)部聚集是其主要的病理標志［18］。值得關注的是，后者能從完整的神經(jīng)元中通過囊泡釋放和胞吐釋放等方式進入CSF 中［19］，即二者均可在一定程度上跟隨腦脊液流動。向因衰老導致覆蓋面積減少和內(nèi)徑縮小的MLVs 局部注入重組VEGF-C 可改善MLVs 引流CSF的能力，從而使得MLVs 對包括Aβ 和Tau 蛋白在內(nèi)的大分子物質(zhì)的清除能力增強，進一步減緩年齡相關認知障礙的發(fā)生［20-21］。新近研究顯示，上調(diào)唐氏綜合征關鍵區(qū)域1（Down syndrome critical region 1，DSCR1）能擴張MLVs從而增強其引流Aβ的能力，該機制主要與DSCR1 抑制鈣調(diào)磷酸酶/NFAT 信號通路從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞生長發(fā)育和存活相關［22］。此外，研究人員選用缺乏MLVs 的K14-VEGFR3-Ig 轉基因小鼠作為實驗小鼠，向其腦實質(zhì)中注射熒光素標記的tau 蛋白，于48 h 和72 h 觀察實驗組小鼠的腦實質(zhì)中Tau 蛋白含量遠高于對照組小鼠，且血漿中的tau蛋白含量較低，所以維持MLVs的正常解剖學形態(tài)有助于清除神經(jīng)元周圍的tau蛋白［23］。

帕金森?。≒arkinson disease，PD）也是一種常見的年齡相關的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-Syn）過度蓄積是PD 發(fā)生及進展的中心環(huán)節(jié)［24］。通過結扎小鼠DCLNs 間接阻斷MLVs的引流，可增加顱內(nèi)α-Syn 的蓄積以及膠質(zhì)細胞活化，從而加重了小鼠帕金森樣癥狀［25］。另一團隊則使用動態(tài)對比增強MRI檢測出，特發(fā)性PD 患者流經(jīng)乙狀竇和上矢狀竇旁MLVs中的流量比非典型PD 患者的顯著減少，并且也在動物研究中證實了MLVs障礙可增加α-Syn蓄積，加速PD進展［26］。

上述研究表明，MLVs 功能異常導致顱內(nèi)Aβ、Tau 及α-Syn 清除障礙，促進Aβ、Tau 及α-Syn 異常病理蛋白沉積對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用，進而加速了神經(jīng)退行性疾病的病程進展，未來通過調(diào)控MLVs引流功能有望成為因顱內(nèi)大分子代謝廢物堆積所致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療策略。

3.2 MLVs對顱腦損傷的影響B(tài)olte等［27］在輕度創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）小鼠模型上的研究指出，先前存在的MLVs 障礙會加重TBI 所致中樞炎癥和認知障礙，并且TBI 可誘導原本正常小鼠的MLVs 引流功能受損，其機制可能與TBI 引起腦組織水腫、顱內(nèi)壓升高壓迫MLVs 有關；利用激光毀損MLVs后可觀察到小膠質(zhì)細胞活化增加，而通過腺病毒轉染VEGF-C 增大MLVs內(nèi)徑可逆轉TBI誘導的小膠質(zhì)細胞活化表達。

硬膜下血腫（subdural hematoma，SDH）的清除機制尚不清楚?；贛LVs獨特的引流特性，研究人員通過向鼠的硬膜下腔注射FITC-500D、A488-纖維蛋白原和自體血來建立SDH 動物模型，證明SDH 中的紅細胞和纖維蛋白原經(jīng)MLVs引流至DCLNs中，阻斷MLVs 引流途徑將抑制血腫吸收；同時SDH 可引發(fā)MLVs 生成相關蛋白LYVE1、FOXC2 和VEGF-C 表達下調(diào)進而抑制MLVs 的功能，不過被抑制的MLVs 功能后期也會隨著血腫的吸收而逐漸恢復［28］。由此可見，顱腦損傷與MLVs引流功能相互影響，預防及改善MLVs損傷將有希望成為治療顱腦損傷的新手段。

3.3 MLVs 對腦卒中（stroke）預后的影響腦卒中分為由動脈破裂引發(fā)的出血性腦卒中和動脈阻塞引起的缺血性腦卒中兩類，針對出血性腦卒中，目前已有研究證實MLVs 參與引流蛛網(wǎng)膜下腔出血（sub?arachnoid hemorrhage，SAH）后CSF 中的紅細胞至外周組織，從而減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血對大腦的損害，除此之外，毀損MLVs 可檢測到全腦CD16/32+（M1 型）CD206?（M2 型）小膠質(zhì)細胞百分率顯著升高，加重SAH 后中樞炎癥對神經(jīng)系統(tǒng)的損害［29］。 故擴張MLVs管徑和修復因衰老等原因受損的MLVs是改善蛛網(wǎng)膜下腔出血預后的新的研究方向。

針對缺血性腦卒中的研究顯示，對年輕雄性C57BL/J6小鼠使用光栓（photothrombosis，PT）法建立腦缺血模型可導致小鼠的MLVs生成，而使用短暫性大腦中動脈閉塞法（transient middle cerebral artery oc?clusion，TMCAO）建立的小鼠模型的MLVs 的直徑增加但覆蓋率無明顯變化［30］，這可能是由于前者在利用激光照射造模過程中引起腦膜中小血管閉塞所致。有意思的是，在VEGFR3信號能夠促進淋巴管的生長發(fā)育和VEGFR3突變可使得MLVs 退化的基礎上，建立針對這兩種不同模型的VEGFR3突變小鼠，卻只加重TMCAO模型的腦卒中嚴重程度。以上兩種現(xiàn)象揭示了缺血性腦卒中和MLVs會相互影響，但也提示將來研究MLVs在缺血性腦卒中病理生理過程中的機制時，模型的選擇需要相應研究人員更多的考慮。

3.4 MLVs 對腦腫瘤的影響研究人員對人體顱腦標本進行免疫組織化學染色顯示：來自顱內(nèi)的淋巴管穿過頸靜脈孔周圍的硬腦膜與頸內(nèi)靜脈周圍的頸深淋巴管網(wǎng)相連通［31］，以此推測這可能是人體腫瘤發(fā)生腦轉移以及腦腫瘤擴散至身體其它部位的可能途徑。在此之前，Hu 等［7］在小鼠硬腦膜下或紋狀體中注射GL261 或B16 細胞建立小鼠腦瘤模型觀察到腦膠質(zhì)瘤或轉移性黑色素瘤可引起小鼠顱背側MLVs 廣泛重塑和新生成；使用特異性藥物Visudyne對顱背側MLVs化學消融后，可阻止腦腫瘤中的樹突狀細胞轉移至DCLNs，降低抗PD-1/CTLA-4 聯(lián)合免疫療法的療效。為進一步探尋MLVs 對腦腫瘤影響的內(nèi)在機制，該團隊還通過對患腦腫瘤小鼠過表達VEGF-C 觀察到其對抗PD-1/CTLA-4 聯(lián)合免疫療法的反應性增強，并且在阻斷CCL21/CCR7的條件下所抑制，說明顱背側MLVs 可通過VEGF-C-CCL21/CCR7 信號通路介導樹突狀細胞從腦腫瘤中轉移到DCLNs。這一研究提示MLVs 或許是人體大腦和其他部位的腫瘤在進展期發(fā)生相互轉移的途徑之一，可能成為腦腫瘤免疫治療的新目標。

3.5 MLVs 對多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）的影響MS 是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病，T 細胞在其免疫損害機制中扮演著重要的角色。生理狀態(tài)下，腦膜中存在豐富的免疫細胞，其中T 細胞可進入MLVs 中，鑒于T 細胞在淋巴管中的運輸主要依賴于CCR7-CCL21 途徑，對比CCR7基因敲除小鼠的DCLNs 中T 細胞數(shù)量顯著少于野生型小鼠，證實了CCR7 在腦膜T 細胞運輸中的作用［32］。值得關注的是，在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental au?toimmune encephalomyelitis，EAE）即MS 小鼠模型中，消融MLVs 可導致腦源性特異性T 細胞產(chǎn)生受損及T 細胞進入脊髓受阻，同時小鼠的癱瘓程度明顯減輕［1，6］。盡管目前關于中樞炎癥與MLVs 的具體機制仍不清楚，但EAE 小鼠試驗向我們展示了阻斷MLVs可能防止抗原和APC 進入頸部淋巴結，從而限制外周通過CD4+T細胞獲取致病原。

3.6 MLVs 對肝性腦?。╤epatic encephalopathy，HE）的影響HE 是肝硬化患者的嚴重神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。結扎4 周齡大鼠膽管建立肝硬化合并HE 模型，檢測其中樞炎癥、運動功能、MLVs形態(tài)及功能變化，表明肝硬化大鼠運動功能減退的同時伴有大腦皮層中炎癥因子IL-1β、IFN-γ、TNF-α和IBA1表達水平顯著升高，通過誘導MLVs 生成、促進MLVs 引流可提高上述炎癥因子的清除率，可改善HE的相關癥狀［33］。該研究結果對今后制定肝性腦病的臨床治療策略具有一定指導意義。

4 總結與展望

綜上所述，腦膜中存在表達LECs 經(jīng)典淋巴標志物的MLVs，該結構獨特的解剖學特性溝通了大腦和外周淋巴組織，在CSF 引流、腦代謝以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫中起著至關重要的作用。MLVs 受到年齡、VEGF-C 和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多因素的影響，具備一定的可塑性及再生能力，改善其功能有望成為多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在預防及治療靶點。但目前關于MLVs功能的相關的研究多局限于動物實驗，缺乏臨床試驗數(shù)據(jù)，對于MLVs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用和機制探索也尚處起步階段，仍需大量的工作對其進行深入的探索和研究。

此外，盡管MLVs 目前被稱為“腦膜淋巴管”，有時也稱之為“腦淋巴管”，并常直接歸類于腦淋巴管系統(tǒng)的一部分，但從解剖學及生理學層面來說，硬腦膜位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血腦屏障之外，這些術語可能會導致一定的誤解。隨著探索的不斷深入，未來應對這些淋巴管路的解剖及病理生理功能做出更為詳盡的描述和更準確的定義。