芎芷鎮(zhèn)痛方對偏頭痛大鼠行為學及三叉神經節(jié)TRPV1表達的影響

陳炯華 方 雪 白茹雪 白 羽 嚴展鵬 李壯壯 周 影

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院，江蘇南京210028；2.南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，江蘇南京210023；3.山東力明科技職業(yè)學院，山東泰安271099）

偏頭痛是一種由神經血管功能紊亂引起的頭痛，部位多位于單側，頭痛呈搏動樣，活動后頭痛可加重，可伴隨惡心、嘔吐、畏聲、畏光等癥狀[1]。我國流行病學調查發(fā)現，偏頭痛年患病率達9.3%，女性發(fā)病率是男性的3倍[2]。近年來，偏頭痛在兒童及青少年中的患病率呈逐年上升趨勢，已經變成影響兒童及青少年健康的主要問題之一[3]。西醫(yī)治療主要包括發(fā)作期用藥（非甾體抗炎藥、阿片類藥、麥角類藥、曲普坦類藥、CGRP受體拮抗劑）、預防性用藥（鈣離子阻滯劑、抗癲癇藥、β受體阻滯劑、抗抑郁藥等），僅能臨時緩解癥狀，且長期服用有神經系統損害、抑郁、嗜睡、認知異常、肝腎功能損害、高血壓或低血壓、胃腸道反應等副作用。中醫(yī)對偏頭痛的認識歷史悠久，治療方法多樣，臨床療效顯著。芎芷鎮(zhèn)痛方是江蘇省名老中醫(yī)符為民教授治療瘀血阻絡型偏頭痛的經驗方，具有祛風通絡、化瘀止痛之效，治療偏頭痛療效顯著，但其作用靶點及作用機制尚不明確。本實驗觀察了芎芷鎮(zhèn)痛方對偏頭痛模型大鼠撓頭次數及大腦三叉神經節(jié)瞬時感受器電位香草酸受體1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）表達的影響，從而探討芎芷鎮(zhèn)痛方治療偏頭痛的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SD大鼠，雄性，體重200～250 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物合格證號：SCXK（滬）2017-0005，自由飲水和進食，光照條件為明暗各12 h，SPF級飼養(yǎng)室溫度應保持在20～25 ℃。動物實驗的操作流程均符合動物倫理要求，由江蘇省中西醫(yī)結合醫(yī)院倫理辦公室審查，倫理批準編號：AEWC-20200519-108。

1.2 主要藥物 中藥材（川芎、白芷、當歸、僵蠶、全蝎、地龍）購自江蘇省中西結合醫(yī)院藥劑科；硝酸甘油注射液（批號：20200310），1 mL∶5 mg，北京益民藥業(yè)有限公司生產，國藥準字H11020289；鹽酸氟桂利嗪膠囊（批號：JLJORAU），西安楊森制藥有限公司生產，國藥準字H10930003。

1.3 主要試劑 兔抗鼠TRPV1抗體（批號：bs-23927R），購自北京博奧森生物技術有限公司；羊抗兔二抗-HRP（批號：KIT-9710）和DAB顯色試劑盒（批號：DAB-2032），購自福州邁新生物技術開發(fā)公司；二甲苯（批號：1604012）、乙醇（批號：10009257）、封片劑（批號：10004160），購自國藥集團；PBS磷酸鹽緩沖液（批號：ZLI-9062），購自北京中杉金橋公司；抗原修復液（批號：P0081）、封閉液（批號：P0260），購自上海碧云天生物技術有限公司。1.4 主要儀器 顯微照相系統（型號：CK31），購自日本Olymus公司；-80 ℃低溫冰箱（型號：HFU-486），購自美國thermo公司；脫水機（型號：CJ-12P1）、包埋機（型號：CB-8D），購自湖北定源醫(yī)療設備有限公司；切片機（型號：RM2245），購自德國leica公司。

2 實驗方法

2.1 芎芷鎮(zhèn)痛方制備 芎芷鎮(zhèn)痛方由川芎10 g、白芷10 g、當歸12 g、僵蠶10 g、全蝎5 g、地龍5 g共6味中藥組成，用水提的方法提取實驗用藥液，第1次加藥材10倍量的水提取2 h，過濾，藥渣加5倍量的水提取1.5 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮，得芎芷鎮(zhèn)痛方水提液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分組與給藥 SD大鼠60只，雄性，隨機分為6組：空白組、模型組、氟桂利嗪組（0.45 mg/kg）和芎芷鎮(zhèn)痛方低（4.69 g/kg）、中（9.38 g/kg）、高（18.76 g/kg）劑量組。各組均連續(xù)灌胃給藥或等體積生理鹽水7 d，均每日灌胃1次。

2.3 造模 除空白組外，其余各組大鼠末次灌胃0.5 h后，采用頸部皮下注射10 mg/kg硝酸甘油注射液的方法制備偏頭痛大鼠模型[4]。造模后，大鼠出現雙耳發(fā)紅、爬籠次數增加、前肢頻繁撓頭、往返運動等煩躁不安表現，表明造模成功[5]。

2.4 觀察指標

2.4.1 撓頭次數 從造模成功起，記 錄0～30 min、30～60 min、60～90 min、90～120 min 4個時間段大鼠撓頭次數。

2.4.2 三叉神經節(jié)TRPV1表達 造模成功4 h后，各組大鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，剪刀剪開顱頂，剔除顱骨及大腦組織，顯示三叉神經節(jié)，剝離三叉神經節(jié)表面的硬腦膜，分離出三叉神經節(jié)，再將三叉神經節(jié)放入甲醛固定液中保存。將固定的三叉神經節(jié)依次脫水、透明、浸蠟、包埋，切片、攤片，放入載玻片，再將切片放入60 ℃烘干機中烘干1 h。切片脫蠟，水化，抗原修復，用蒸餾水清洗切片3次，5 min/次，擦干切片，用免疫組化筆化圈，再滴入50 μL過氧化氫，孵育10 min；用蒸餾水清洗切片2次，5 min/次，PBST溶液清洗切片5 min；于每個切片上滴入400 μL封閉液，室溫下封閉1 h；清除封閉液，每個切片滴加一抗50 μL，4 ℃孵育過夜；拿出切片恢復至室溫，清除一抗，PBST溶液清洗切片3次，5 min；每個切片加入二抗50 μL，室溫下孵育1 h；PBST溶液清洗切片3次，5 min/次；每個切片加入100 μL DAB，顯色后沖洗，滴加蘇木精復染，蒸餾水沖洗3 min，分化，反藍，鏡檢，蒸餾水中清洗2次（5 min/次），脫水，蓋玻片、中性樹膠封片。光鏡下細胞質染色呈棕色即為有蛋白表達。在光鏡100倍視野下，用顯微鏡對每張切片的蛋白表達區(qū)域進行拍照，每張切片選3個視野。用Image-Pro Plus軟件計算出每張照片中TRPV1的平均光密度值，并作統計學處理。

2.5 統計學方法 所有數據采用SPSS 26.0軟件進行統計分析，計量資料用（x-±s）表示。多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較使用Tukey法。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠造模后各時間段撓頭次數比較 結果見表1。與空白組比較，模型組、氟桂利嗪組和芎芷鎮(zhèn)痛方各劑量組大鼠各時間段撓頭次數均顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，氟桂利嗪組和芎芷鎮(zhèn)痛方各劑量組大鼠各時間段撓頭次數均明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）；在30～60 min、60～90 min、90～120 min時間段，芎芷鎮(zhèn)痛方各劑量組大鼠撓頭次數均明顯低于氟桂利嗪組（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 各組大鼠造模后各時間段撓頭次數比較（x-±s） 單位：次

3.2 各組大鼠三叉神經節(jié)TRPV1表達比較 免疫組化染色結果見圖1?？瞻捉M大鼠三叉神經節(jié)少數細胞質染色呈淺棕色，大多數細胞質未染色。模型組大鼠三叉神經節(jié)細胞TRPV1表達明顯增強，大部分細胞質染色呈深棕色。氟桂利嗪組多數細胞質染色呈淺棕色；芎芷鎮(zhèn)痛方低劑量組可見少數細胞質染色呈深棕色；芎芷鎮(zhèn)痛方中劑量組可見部分細胞質染色呈淺棕色；芎芷鎮(zhèn)痛方高劑量組可見少數細胞質染色呈淺棕色。

與空白組比較，模型組、氟桂利嗪組、芎芷鎮(zhèn)痛方各劑量組大鼠TRPV1平均光密度值顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，氟桂利嗪組和芎芷鎮(zhèn)痛方各劑量組大鼠TRPV1平均光密度值明顯減少（P＜0.05）；與氟桂利嗪組和芎芷鎮(zhèn)痛方低、中劑量組比較，芎芷鎮(zhèn)痛方高劑量組TRPV1平均光密度值明顯減少（P＜0.05）；芎芷鎮(zhèn)痛方低、中劑量組大鼠TRPV1平均光密度值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

圖1 各組大鼠三叉神經節(jié)TRPV1免疫組化染色結果（×100）

表2 各組大鼠三叉神經節(jié)TRPV1平均光密度值比較（x-±s）

4 討論

偏頭痛是神經內科臨床常見疾病，其具體發(fā)病機制至今尚未清晰，但三叉神經血管學說是目前解釋偏頭痛發(fā)病機制的主流學說，近年來廣受重視。鹽酸氟桂利嗪膠囊能緩解血管痙攣，對血管收縮物質引起的持續(xù)性血管痙攣有持久的抑制作用，尤其對基底動脈和頸內動脈效果更為明顯，并有前庭抑制作用，能增加耳蝸小動脈血流量，改善前庭器官血液循環(huán)，從而緩解偏頭痛。

新近研究表明，TRPV1又稱為辣椒素受體，分布于傷害性感受器上，且TRPV1與疼痛密切相關。TRPV1是一種存在于細胞膜和細胞器膜上的非選擇性陽離子通道，對Ca2+具有高通透性[6]，屬于瞬時感受器電位通道（transient receptor potential channels，TRPs）家族成員亞型之一。內源性或外源性傷害性刺激通過興奮三叉神經感覺纖維上的TRPV1信號通路，引起Ca2+內流，進而導致三叉神經感覺纖維末梢釋放降鈣素基因相關肽（calcitonin generelated peptide，CGRP）、P物質（substance P，SP）、神經激肽A（neurokinin A，NKA）等神經遞質，引起無菌性神經源性炎癥，繼而產生偏頭痛。TRP通道最早在果蠅的視覺系統中發(fā)現，因突變體果蠅對持續(xù)的光刺激只產生瞬時鋒電位而命名[7]。在哺乳動物中，TRPs包括TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP、TRPML及TRPN七個亞家族[8]。上述7個亞家族又分別包括不同的亞型，其中TRPV家族成員包括6個亞型：TRPV1-V6[9]。目前研究發(fā)現，TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPA1、TRPM8表達于疼痛感受器中，與疼痛相關[10]。1997年，CATERINA M J等[11]首次在大鼠背根神經節(jié)中克隆出TRPV1。TRPV1主要表達于三叉神經節(jié)、背根神經節(jié)、淋巴結神經節(jié)的中、小型傷害感受器神經元中[12]。TRPV1在炎性痛、神經痛、癌性痛等疼痛疾病中發(fā)揮重要作用。TRPV1可被內源性或外源性刺激激活，內源性激活劑包括酸（pH＜5.9）、熱刺激（＞43 ℃）、一氧化氮（NO）、Ca2+、Mg2+、花生四烯酸及其代謝物等，外源性激活劑包括辣椒素及其類似物、大蒜素、大麻素樣物質、吳茱萸堿等。TRPV1被激活后，細胞外大量Ca2+流入胞內，伴有少量的K+、Na+、Mg2+等內流，導致動作電位產生并誘發(fā)信號傳導，繼而引發(fā)疼痛。YOSHIDA T等[13]研究發(fā)現，NO可通過S-硝基化半胱氨酸途徑進一步激活TRPV1。隨著對TRPV1的深入研究，研究者研發(fā)相關藥物以阻斷TRPV1離子通道為靶點，達到緩解疼痛的目的，TRPV1拮抗劑如氯丙嗪（chlorpromazine，CPZ）、釕紅（ruthenium red，RR）、碘化樹膠脂毒素（I-RTX）[14]，具有一定的臨床應用價值，但其多存在引起體溫過高等不良反應。

偏頭痛可歸屬于中醫(yī)學“頭痛”“首風”“頭風”“腦風”“厥逆頭痛”“偏頭風”等范疇。符為民教授認為，偏頭痛病理因素雖與風、火、痰、瘀、虛有關，但偏頭痛患者病程較長，纏綿難愈，久病入絡，久病必瘀，各種致病因素均可導致脈絡阻滯不通，產生瘀血，而瘀血的產生則進一步加重頭痛的程度。此外，許多偏頭痛患者合并有緊張、焦慮、抑郁等狀態(tài)，致使肝郁氣滯，久則導致氣血運行障礙，脈絡不通，產生瘀血。因此，符老指出瘀血阻絡是偏頭痛的主要病機，且貫穿于疾病始終，并自擬芎芷鎮(zhèn)痛方治療本病。方中川芎行氣解郁、祛風除濕、化瘀止痛；白芷祛風燥濕、消腫、止痛；當歸補血、活血、調經止痛；僵蠶化痰散結、息風止痙、祛風止痛；全蝎息風止痙、通絡止痛、散結攻毒；地龍清熱息風、活血通絡。臨床發(fā)現此方可降低偏頭痛發(fā)作頻率、持續(xù)時間，并可降低遠期復發(fā)率，療效顯著[15]?，F代藥理研究表明，川芎和當歸的主要成分阿魏酸，白芷的主要成分歐前胡素，均具有抗炎癥和抗氧化的作用[16-17]。草酸銨是僵蠶的主要成分，具有抗凝血的作用[18]。蝎毒是全蝎的毒性物質機制，主要包含透明質酸酶等，具有鎮(zhèn)痛和溶栓的作用[19]。地龍的主要成分有多肽和微量元素，地龍的醇提取物可以發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛的作用[20]。這些研究說明芎芷鎮(zhèn)痛方的藥效發(fā)揮與抑制機體炎癥發(fā)生密切相關。

本研究結果表明，模型組、氟桂利嗪組和芎芷鎮(zhèn)痛方各劑量組在造模成功后即出現前肢頻繁撓頭現象，說明硝酸甘油可引發(fā)偏頭痛，引起大鼠撓頭次數增加，且在30～60 min內撓頭次數達最高值，60 min后各組大鼠撓頭次數逐漸減少。鹽酸氟桂利嗪膠囊和芎芷鎮(zhèn)痛方各劑量對偏頭痛大鼠的行為學癥狀均有改善作用，其中芎芷鎮(zhèn)痛方各劑量的改善作用優(yōu)于鹽酸氟桂利嗪膠囊，且以芎芷鎮(zhèn)痛方高劑量改善作用最佳。

造模大鼠三叉神經節(jié)TRPV1表達均明顯高于空白組，說明硝酸甘油可增加TRPV1表達，產生偏頭痛。各給藥組大鼠TRPV1表達較模型組顯著減少，提示芎芷鎮(zhèn)痛方與鹽酸氟桂利嗪膠囊可通過抑制偏頭痛模型大鼠三叉神經節(jié)TRPV1的表達，從而治療偏頭痛，其中芎芷鎮(zhèn)痛方高劑量組TRPV1表達最低，提示芎芷鎮(zhèn)痛方高劑量抑制TRPV1表達的作用最優(yōu)。

綜上，芎芷鎮(zhèn)痛方能顯著減少偏頭痛模型大鼠撓頭次數，改善大鼠的行為學癥狀，降低大鼠三叉神經節(jié)TRPV1的表達，提示芎芷鎮(zhèn)痛方可能是通過抑制三叉神經節(jié)TRPV1的表達，從而治療偏頭痛。在后續(xù)的動物實驗中，可以從抗神經炎癥方面研究芎芷鎮(zhèn)痛方對偏頭痛模型動物客觀指標的改善作用，利用質譜組學技術研究芎芷鎮(zhèn)痛方的主要成分和物質基礎，深入探討并明確芎芷鎮(zhèn)痛方治療偏頭痛的作用機制，進而為芎芷鎮(zhèn)痛方的臨床推廣使用提供客觀的科學依據。