光譜法研究小麥蛋白與直鏈淀粉的相互作用

王岸娜，楚雯文，吳立根

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

蛋白和多糖是兩種生物大分子物質(zhì)，關(guān)于它們的相互作用在食品領(lǐng)域有著廣泛的研究[1-2]。淀粉是最常見(jiàn)的多糖，是食品中的重要成分，常與蛋白共存于食品體系中，兩者相互作用的研究對(duì)食品的質(zhì)構(gòu)、穩(wěn)定性和感官特性等具有指導(dǎo)意義[3]。

小麥蛋白是從小麥粉中提取的植物源蛋白質(zhì)[4]，具有高度聚合的狀態(tài)[5]，根據(jù)溶解性的不同，可分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。在食品加工中小麥蛋白與淀粉緊密結(jié)合[6]，研究發(fā)現(xiàn)小麥蛋白富含谷氨酰胺，谷氨酰胺的氨基和淀粉葡萄糖單元的第二或第三羥基之間會(huì)形成氫鍵[7]，在淀粉糊化和回生過(guò)程中，單體蛋白(清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白)與淀粉的氫鍵作用力更強(qiáng)[8]。它們的相互作用影響著食品的流變學(xué)特性[3,9]、糊化特性[10]和消化特性[11-12]，因此從分子層面上闡述兩者的相互作用具有重要意義。

盡管近年來(lái)對(duì)小麥蛋白與淀粉相互作用的研究越來(lái)越深入，但很少涉及具體成分之間的研究，直鏈淀粉作為淀粉的主要組成部分，與小麥蛋白的相互作用研究較少，結(jié)合位點(diǎn)和作用機(jī)制尚不明確。因此，作者通過(guò)紫外光譜、熒光光譜和同步熒光技術(shù)測(cè)定兩者相互作用的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)和熱力學(xué)參數(shù)，判斷直鏈淀粉與4種蛋白的相互作用以及結(jié)合機(jī)制，以期對(duì)淀粉基食品的設(shè)計(jì)提供新思路，對(duì)改善食品的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

谷朊粉：封丘縣華豐粉業(yè)有限公司；直鏈淀粉：卡邁舒生物科技有限公司；氯化鈉、乙醇、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南佰澤儀器有限公司；Cary Eclipase熒光分光光度計(jì)：美國(guó)VARIAN；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小麥蛋白的制備及含量測(cè)定

根據(jù)蛋白溶解性的不同，采用Osborne法[13]分級(jí)提取蛋白，以蒸餾水、3%氯化鈉溶液、75%乙醇溶液和0.2%氫氧化鈉溶液為溶劑，料液比為1∶ 10 g/mL，從谷朊粉中依次提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，離心后取上清液過(guò)濾備用。

谷朊粉總蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：參照GB 5009.5—2016，采用雙縮脲法[14]測(cè)定4種小麥蛋白含量。

1.3.2 小麥蛋白-直鏈淀粉復(fù)合體系的制備

小麥蛋白-直鏈淀粉復(fù)合體系的制備參照徐興鳳[15]使用的方法并加以修改。清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白用相應(yīng)試劑稀釋至質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，將不同質(zhì)量濃度(0、0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg/mL)的直鏈淀粉溶液[16]加入蛋白溶液中，等體積均勻混合反應(yīng)30 min。

1.3.3 紫外光譜的測(cè)定

室溫下，分別掃描4種蛋白與不同質(zhì)量濃度直鏈淀粉復(fù)合體系的紫外光譜，掃描范圍為200～400 nm。

1.3.4 熒光光譜的測(cè)定

1.3.4.1 熒光猝滅光譜及猝滅類型

在溫度298 K和310 K的條件下測(cè)定小麥蛋白-直鏈淀粉復(fù)合體系的內(nèi)源熒光，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～450 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5 nm和10 nm。

根據(jù)Stern-Volmer方程(1)可以確定直鏈淀粉和4種蛋白的熒光猝滅機(jī)制：

(1)

方程(1)中：F0為只存在蛋白時(shí)的熒光強(qiáng)度；F為添加直鏈淀粉之后的熒光強(qiáng)度；[Q]為直鏈淀粉的物質(zhì)的量濃度；KSV為相互作用的猝滅常數(shù)；Kq為相互作用的猝滅速率；τ0為熒光分子平均壽命，一般取10-8s。

1.3.4.2 結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合常數(shù)

直鏈淀粉和4種蛋白的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)雙對(duì)數(shù)方程(2)計(jì)算。

(2)

方程(2)中：Ka為相互作用的結(jié)合常數(shù)；n為相互作用的結(jié)合位點(diǎn)。

1.3.4.3 結(jié)合力類型

由Van’t Hoff方程(3)和熱力學(xué)方程(4)得到反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)ΔH(焓變)、ΔS(熵變)和ΔG(自由能)。

(3)

ΔG=ΔH-TΔS，

(4)

方程(3)和(4)中：K為與溫度T相對(duì)應(yīng)的結(jié)合常數(shù)；T為試驗(yàn)溫度(298 K和310 K)；R為氣體常數(shù)，8.314 J·mol-1·K-1。

根據(jù)參數(shù)的大小和正負(fù)可以判斷相互作用力類型：當(dāng)ΔH<0，ΔS<0時(shí)，作用力為氫鍵和范德華力；當(dāng)ΔH>0，ΔS>0時(shí)，作用力為疏水相互作用；當(dāng)ΔH<0，ΔS>0時(shí)，作用力為靜電相互作用。

1.3.5 同步熒光光譜的測(cè)定

在室溫下掃描復(fù)合體系Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步熒光光譜，掃描范圍200～350 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)含量

以牛血清蛋白的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=0.053 8x+0.006 1(R2=0.999 5)。

谷朊粉中總蛋白含量為60.68%，其中清蛋白占比為2.49%，球蛋白為3.38%，醇溶蛋白為40.41%，谷蛋白為32.07%。

2.2 紫外光譜

紫外吸收光譜是一種研究蛋白結(jié)構(gòu)變化的方法，也是確定猝滅機(jī)理的一種手段。在蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜中，280 nm左右的吸收峰主要是由于芳香族氨基酸殘基的苯雜環(huán)結(jié)構(gòu)的π→π*躍遷形成的B吸收帶，對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，僅影響了發(fā)色團(tuán)的激發(fā)態(tài)，紫外吸收光譜不發(fā)生變化，對(duì)于靜態(tài)猝滅，直鏈淀粉與蛋白形成復(fù)合物，吸收光譜發(fā)生變化。

如圖1所示，清蛋白在270 nm處有吸收峰，球蛋白在265 nm處有吸收峰，吸收谷均在245 nm處，隨著直鏈淀粉質(zhì)量濃度的升高，吸收峰和吸收谷消失，在吸收谷的位置出現(xiàn)了新的肩峰；醇溶蛋白的吸收峰在278 nm處，直鏈淀粉的加入使吸收峰紅移，250 nm處出現(xiàn)新的肩峰，這表明直鏈淀粉使醇溶蛋白肽鏈伸展，躍遷所需能量減少，吸收峰向長(zhǎng)波移動(dòng)；谷蛋白的吸收峰在280 nm處，隨著直鏈淀粉濃度的增加，峰形和吸收峰波長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)生變化，吸收峰的強(qiáng)度增加可能是由于發(fā)色團(tuán)的微環(huán)境發(fā)生了改變。紫外吸收光譜圖的改變表明4種蛋白和直鏈淀粉發(fā)生相互作用形成基態(tài)復(fù)合物，初步證實(shí)了直鏈淀粉對(duì)4種蛋白熒光猝滅的機(jī)制是靜態(tài)猝滅。

注：曲線a到h對(duì)應(yīng)的直鏈淀粉質(zhì)量濃度分別為0、0.025、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL。圖2、圖3同。圖1 直鏈淀粉與4種蛋白相互作用的紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectroscopy of interacting between amylose and four proteins

2.3 熒光光譜

2.3.1 熒光猝滅光譜及猝滅類型的確定

從圖2可以看出，在298 K時(shí)4種蛋白的熒光強(qiáng)度隨著直鏈淀粉質(zhì)量濃度的增加而降低，310 K時(shí)的熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)與298 K時(shí)相同(圖省略)，因此直鏈淀粉對(duì)4種蛋白均具有熒光猝滅作用。直鏈淀粉質(zhì)量濃度為0.30 mg/mL時(shí)，清蛋白的熒光猝滅率為52.7%，最大發(fā)射峰紅移9 nm，可能是由于清蛋白中含有較多的色氨酸[17]，因此直鏈淀粉對(duì)清蛋白的猝滅率較高。球蛋白的熒光猝滅率為60.8%，最大發(fā)射峰紅移2 nm。醇溶蛋白的熒光猝滅率為35.4%，發(fā)射峰紅移3 nm，且峰形有所變化，由于醇溶蛋白是單肽鏈，呈球狀，相互作用改變了其構(gòu)象，使肽鏈伸展程度增加。在天然蛋白質(zhì)分子中，色氨酸和酪氨酸多處于分子內(nèi)部，周圍微環(huán)境極性較弱，在加入直鏈淀粉后，蛋白質(zhì)肽鏈?zhǔn)嬲?，氨基酸?cè)鏈基團(tuán)暴露于溶液中，微環(huán)境極性增大，熒光基團(tuán)的疏水性減小，蛋白質(zhì)熒光發(fā)射峰紅移，表明直鏈淀粉的加入改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，二者發(fā)生了相互作用。谷蛋白的熒光猝滅率僅為22.8%，最大發(fā)射峰為353 nm，直鏈淀粉并未使谷蛋白最大發(fā)射峰發(fā)生改變，可能由于谷蛋白是線性高分子，因此直鏈淀粉對(duì)谷蛋白猝滅率較弱，微環(huán)境改變較小。

圖2 直鏈淀粉與4種蛋白相互作用的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of interaction between amylose and four proteins

不同溫度下直鏈淀粉猝滅4種蛋白的猝滅常數(shù)(KSV)和猝滅速率(Kq)如表1所示，在298 K和310 K時(shí)，擬合方程呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。4種蛋白的猝滅速率均大于2×1010L·mol-1·s-1，可以認(rèn)為猝滅方式不是動(dòng)態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光物質(zhì)分子之間形成了復(fù)合物，因此溫度升高會(huì)導(dǎo)致復(fù)合物穩(wěn)定性變差，猝滅常數(shù)減小。由表1可知，直鏈淀粉對(duì)4種蛋白的猝滅常數(shù)均隨著溫度的升高而降低?；谏鲜鼋Y(jié)果，可以判斷直鏈淀粉對(duì)4種蛋白的熒光猝滅是由于相互作用形成了復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅。

2.3.2 結(jié)合位點(diǎn)及結(jié)合常數(shù)的確定

不同溫度下直鏈淀粉與4種蛋白相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)如表2所示。結(jié)合常數(shù)表示直鏈淀粉與蛋白結(jié)合的強(qiáng)度，數(shù)值越大結(jié)合力越強(qiáng)。由表2可知，清蛋白、球蛋白與直鏈淀粉的結(jié)合力比醇溶蛋白和谷蛋白弱，這可能是由于清蛋白和球蛋白多為單體結(jié)構(gòu)。清蛋白和球蛋白的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)隨著溫度的升高而降低，表明結(jié)合過(guò)程是放熱的，結(jié)合位點(diǎn)小于1表明直鏈淀粉不易滲透到蛋白內(nèi)部的疏水腔；醇溶蛋白和谷蛋白的結(jié)合常數(shù)隨溫度的升高而升高，表明結(jié)合過(guò)程是吸熱的，結(jié)合位點(diǎn)均大于1表明這兩種蛋白與直鏈淀粉形成的復(fù)合物更加穩(wěn)定，結(jié)合力比較強(qiáng)。

2.3.3 熱力學(xué)參數(shù)及作用力的確定

不同溫度下，直鏈淀粉與4種蛋白相互作用的熱力學(xué)參數(shù)如表3所示。清蛋白-直鏈淀粉和球蛋白-直鏈淀粉體系的ΔH、ΔS和ΔG均為負(fù)值，表明這兩種體系的主要作用力類型為氫鍵和范德華力，并且結(jié)合過(guò)程是放熱、焓驅(qū)動(dòng)的自發(fā)過(guò)程，因此在溫度升高時(shí)，不利于這兩種體系的相互作用，導(dǎo)致結(jié)合常數(shù)下降。Lian等[18]發(fā)現(xiàn)清蛋白和球蛋白的賴氨酸殘基存在于蛋白肽的末端，賴氨酸殘基的—NH2可與淀粉葡萄糖殘基的親水性—OH通過(guò)氫鍵結(jié)合。醇溶蛋白-直鏈淀粉和谷蛋白-直鏈淀粉體系的ΔH和ΔS均為正值，ΔG為負(fù)值，表明這兩種體系的主要作用力為疏水相互作用，結(jié)合過(guò)程是吸熱、熵驅(qū)動(dòng)的自發(fā)過(guò)程，因此在溫度升高時(shí)，可促進(jìn)這兩種體系的相互作用，使結(jié)合常數(shù)上升。直鏈淀粉腔內(nèi)是疏水性的，可為非極性部分提供具有高親和力的結(jié)合位點(diǎn)[19]，醇溶蛋白和谷蛋白的α-螺旋存在于N端和C端結(jié)構(gòu)域中，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角存在于中央重復(fù)結(jié)構(gòu)域中[20]，這些含有脯氨酸和酪氨酸殘基的中心重復(fù)結(jié)構(gòu)域可以形成疏水相互作用[21]。醇溶蛋白和谷蛋白表面暴露著大量酪氨酸殘基，在與淀粉的相互作用中酚羥基既是氫鍵的供體又是受體，因此醇溶蛋白、谷蛋白與直鏈淀粉形成復(fù)合物主要的驅(qū)動(dòng)力為疏水作用力，也存在氫鍵。

表1 不同溫度下直鏈淀粉與4種蛋白相互作用的猝滅方程及猝滅常數(shù)Table 1 Quenching equations and quenching constants for the interactions between amylose and four proteins at different temperatures

表2 不同溫度下直鏈淀粉與4種蛋白相互作用的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)Table 2 Binding constants and binding sites of interaction between amylose and four proteins at different temperatures

表3 不同溫度下直鏈淀粉與4種蛋白相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of interaction between amylose and four proteins at different temperatures

2.4 同步熒光光譜

直鏈淀粉與4種蛋白在常溫下相互作用的同步熒光光譜如圖3所示。由圖3可以看出，色氨酸殘基比酪氨酸殘基具有更大的熒光強(qiáng)度。當(dāng)Δλ=15 nm時(shí)，清蛋白最大發(fā)射峰紅移了8 nm，球蛋白最大發(fā)射峰紅移了10 nm，醇溶蛋白隨著直鏈淀粉質(zhì)量濃度的增大最大發(fā)射峰趨于水平，因此直鏈淀粉使清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的酪氨酸殘基周圍微環(huán)境親水性增加；當(dāng)Δλ=60 nm時(shí)，清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的最大發(fā)射峰并未發(fā)生改變，說(shuō)明直鏈淀粉沒(méi)有對(duì)這3種蛋白的色氨酸殘基微環(huán)境的極性造成影響。而谷蛋白的最大熒光發(fā)射峰波長(zhǎng)均無(wú)顯著性變化，即酪氨酸殘基和色氨酸殘基周圍微環(huán)境變化不明顯，與紫外光譜結(jié)果一致。清蛋白酪氨酸殘基的熒光降低率為81.8%，色氨酸殘基的熒光降低率為57.3%；球蛋白酪氨酸殘基的熒光降低率為69.9%，色氨酸殘基的熒光降低率為61.5%；醇溶蛋白酪氨酸殘基的熒光降低率為70.0%，色氨酸殘基的熒光降低率為46.0%；谷蛋白酪氨酸殘基的降低率為20.1%，色氨酸殘基的降低率為23.3%。說(shuō)明4種蛋白的酪氨酸殘基與色氨酸殘基均參與了結(jié)合過(guò)程，清蛋白、球蛋白及醇溶蛋白與直鏈淀粉的結(jié)合位點(diǎn)更接近于酪氨酸殘基，而谷蛋白與直鏈淀粉的結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基。

圖3 直鏈淀粉與4種蛋白相互作用的同步熒光光譜Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of interaction between amylose and four proteins

3 結(jié)論

采用紫外光譜法、熒光光譜法及同步熒光法研究了清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白與直鏈淀粉的相互作用機(jī)制。通過(guò)靜態(tài)猝滅機(jī)制，直鏈淀粉可與4種蛋白生成復(fù)合物，能夠有效猝滅4種蛋白的內(nèi)源熒光。清蛋白和球蛋白與直鏈淀粉通過(guò)氫鍵和范德華力結(jié)合，結(jié)合力較弱，是放熱、焓驅(qū)動(dòng)的自發(fā)過(guò)程；醇溶蛋白和谷蛋白主要通過(guò)疏水相互作用結(jié)合，結(jié)合力較強(qiáng)，是吸熱、熵驅(qū)動(dòng)的自發(fā)過(guò)程。清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)更接近酪氨酸殘基，谷蛋白的結(jié)合位點(diǎn)更接近色氨酸殘基。