橄欖油與油茶籽油氧化過程中主要微量伴隨物的變化

李 琪，周 笙,，魏 冰，高 媛，于修燭*

1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西省“四主體一聯(lián)合”功能油脂工程技術校企聯(lián)合研究中心，陜西 楊凌 712100 2.中糧工科(西安)國際工程有限公司，陜西 西安 710082

橄欖油作為地中海飲食的主要油脂倍受關注，而油茶籽油作為“東方橄欖油”在市場上方興未艾。油酸、棕櫚酸、亞油酸和硬脂酸是2種油脂共有的脂肪酸，其中油酸和亞油酸含量相當[1]。它們均含有豐富的微量伴隨物，主要包括甾醇、角鯊烯、生育酚等。這些物質具有良好的抗氧化、抗炎及預防心血管疾病等多種功效[2-5]。油脂中微量伴隨物的含量與油脂的品質變化密切相關，然而，油脂在加工和儲存過程中，常因氧化造成損失，導致品質降低。

橄欖油中含有豐富的角鯊烯，其含量為1 100～8 390 mg/kg，是核桃油、玉米胚芽油、芝麻油等的10倍以上；油茶籽油中角鯊烯含量則遠低于橄欖油，約為160 mg/kg[6]。橄欖油中含有多種甾醇，含量較高的是菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇，歐盟規(guī)定初榨橄欖油中甾醇含量不能少于1 000 mg/kg[7]；油茶籽油中甾醇種類與橄欖油不同，主要為羊毛甾醇、羽扇豆醇、β-谷甾醇和香樹脂醇等，其中羊毛甾醇含量為934～1 654 mg/kg，羽扇豆醇含量為339～782 mg/kg，β-谷甾醇含量為189～820 mg/kg，香樹脂醇含量為360～913 mg/kg[8]。除含有香草酸、咖啡酸、阿魏酸、丁香酸、芹黃素、木樨草素、蕓香苷等酚類物質外，橄欖油中還有一種特有酚類物質——羥基酪醇，其在抗炎、抗腫瘤、減少骨質疏松以及防治心血管相關疾病等方面具有良好的作用[9-12]。油茶籽油中含有原兒茶酸、兒茶素、4-羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、表兒茶素沒食子酸酯和對香豆酸等多種酚類物質[13]。橄欖油與油茶籽油中的生育酚組成十分相似，主要為α-生育酚，同時含有少量的γ-生育酚和δ-生育酚。橄欖油中α-生育酚含量可高達300 mg/kg，油茶籽油中的生育酚含量240～270 mg/kg[8]。相關研究已經證明，氧化是導致油脂中微量伴隨物損失的主要原因之一[14]。

由于氧氣、光照、溫度等條件的影響，橄欖油微量伴隨物會在儲存過程中發(fā)生不同程度的降解，如光照可明顯降低其中生育酚和類胡蘿卜素的含量[15-16]。α-生育酚是橄欖油中重要的內源性抗氧化劑，在油品存儲過程中首先被氧化，顯著減緩不飽和脂肪酸的氧化進程，同時其對角鯊烯和鄰二酚也具有一定的保護作用[17]。油茶籽毛油儲藏過程中，酸值、過氧化值(PV)逐漸升高的同時，其中的生育酚、角鯊烯和多酚含量明顯下降，甾醇含量損失相對較小，約10%。其中，溫度和光照對油茶籽油中伴隨物的降解影響顯著[18]。在60 ℃加速氧化時，水劑法制備的油茶籽油中α-生育酚含量呈不斷下降的趨勢，氧化6 d后，相較于初始值，α-生育酚損失量高達52.49%[19]。橄欖油和油茶籽油中微量伴隨物對油脂氧化起到重要的保護作用，然而，氧化過程中伴隨物變化情況尚不夠明確，需進一步研究。

以橄欖油和油茶籽油為原料，通過氣相色譜質譜聯(lián)用儀(GC-MS)、高效液相色譜(HPLC)和超高效液相色譜(UPLC)等探究2種油脂在加速和室溫氧化過程中微量伴隨物的變化情況，以期為2種油脂在氧化過程中微量伴隨物與氧化關系研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

橄欖油：特級初榨，購于甘肅隴南田園油橄欖科技有限公司；油茶籽油：一級，購于湖南大三湘茶油股份有限公司。

標準品(純度≥ 98%)：膽甾烷醇、角鯊烯、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羽扇豆醇、羊毛甾醇、β-香樹脂醇、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、羥基酪醇。

試劑：氫氧化鉀、乙醇、硅烷化試劑，均為分析純；正己烷和異丙醇分別為分析純和色譜純。

其他材料：0.22 μm有機系濾膜、1 mL注射器、5 mL注射器等。

1.2 儀器與設備

1200L氣相色譜質譜聯(lián)用儀：美國瓦里安公司；1200高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；超高效液相色譜儀：沃特世科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

加速氧化：稱取1 kg橄欖油和1 kg油茶籽油置于60 ℃烘箱內加速氧化20 d，每2 d定期取樣，置于4 ℃冷藏保存用于后續(xù)分析。

室溫氧化：稱取1 kg橄欖油和1 kg油茶籽油置于室溫條件下氧化100 d，每10 d定期取樣，置于4 ℃冷藏保存用于后續(xù)分析。

1.3.2 甾醇和角鯊烯的測定

稱取油樣0.2～0.3 g(精確至0.001 g)于50 mL離心管中，加入0.1 mg/mL的內標(5α-膽甾烷醇)0.5 mL，加入2 mol/L KOH-乙醇溶液(5.6 g KOH溶于50 mL 95%乙醇，現(xiàn)用現(xiàn)配)5 mL，85 ℃水浴1 h。取出冷卻后加入5 mL水和5 mL 正己烷，渦旋后離心(3 500 r/min，3 min)，提取上層清液于另一個干凈離心管中，下層用5 mL正己烷再提取2次，合并有機液。加入5 mL水，振蕩后離心，提取上清液于10 mL離心管中，氮氣吹干(分次加液)，加入BSTFA+TMCS(99∶ 1)硅烷化試劑200 μL，放置于75 ℃水浴30 min。取出冷卻后，過0.22 μm 有機膜，等待進樣。

利用GC-MS進行甾醇分析。載氣：99.99%氦氣；進樣量：1 μL；升溫程序：180 ℃保持1 min，4 ℃/min 升溫至350 ℃，保持5 min，檢測器、進樣口溫度為280 ℃；分流比80∶ 1。通過標準品出峰時間與數(shù)據(jù)庫相似度對比確定不同類型甾醇和角鯊烯的對應峰，采用GC-MS實時分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.3 生育酚的測定

稱取1.0 g油樣，加入1 mL正己烷溶解，混勻，通過0.22 μm有機系濾膜過濾。

利用配置紫外檢測器的HPLC進行分析。色譜柱：硅膠柱；柱溫：25 ℃；流動相：正己烷-異丙醇(體積比98.5∶ 1.5)；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。通過測定峰面積，以外標法進行定量分析。建立生育酚標準物質的標準曲線(α-生育酚：y=24.091x-5.553 5，R2=0.999 2；β-生育酚：y=18.024x-0.540 6，R2=0.999 5；γ-生育酚：y=21.919x-4.557 8，R2=0.999 7；δ-生育酚：y=19.503x-0.860 5，R2=0.999 6。其中x為生育酚在295 nm處的吸收峰面積，y為生育酚標準品濃度)進行定量。

1.3.4 羥基酪醇的測定

稱取50 g油，加入150 mL 70%乙醇(溶解乙醇的水用甲酸酸化至pH值為 2.5)，然后加2 mL正己烷，將所得液體通過旋轉蒸發(fā)儀減壓干燥，旋蒸完全后復溶于2 mL的提取液中。

利用配置紫外檢測器的UPLC進行分析。色譜柱：反向C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈-水(體積比15∶ 85)；流速0.1 mL/min；進樣量1 μL。通過標準品出峰位置確定樣品中的物質，采用外標法定量分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每個樣品測定3次，最終結果表示為平均值±標準偏差。使用Excel 2016和SPSS軟件分析，通過Duncan極差法分析數(shù)據(jù)的顯著性差異(P<0.05)，使用Origin 2019繪圖。

2 結果與分析

2.1 橄欖油和油茶籽油加速氧化過程的主要微量伴隨物變化分析

2.1.1 加速氧化過程中2種油脂的甾醇和角鯊烯含量變化分析

甾醇和角鯊烯是橄欖油與油茶籽油中的重要微量活性物質，其在加速氧化條件下含量變化見表1和表2。

由表1可知，橄欖油中所含甾醇主要包括菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇，其中β-谷甾醇含量最高，是橄欖油中最主要的甾醇組分。在加速氧化20 d后，β-谷甾醇降低了34.97%，豆甾醇降低了34.44%，相比之下，菜油甾醇較為穩(wěn)定，含量僅降低了15.81%。橄欖油中角鯊烯含量較高，高于核桃油、菜籽油等常見油脂[20]，在加速氧化20 d后其含量降低了11.62%。由此可見，橄欖油中角鯊烯和甾醇含量均隨著氧化時間的延長而逐漸降低，角鯊烯與菜油甾醇較為穩(wěn)定，而豆甾醇和β-谷甾醇在60 ℃加速氧化時，會呈現(xiàn)較為明顯的下降趨勢。

表1 橄欖油在加速氧化過程中甾醇和角鯊烯含量的變化Table 1 Changes of phytosterols and squalene content in olive oil during accelerated oxidation process mg/kg

表2 油茶籽油在加速氧化過程中甾醇和角鯊烯含量的變化Table 2 Changes of phytosterols and squalene content in Camellia oleifera seed oil during accelerated oxidation mg/kg

由表2可知，油茶籽油所含甾醇主要為羊毛甾醇、羽扇豆醇、β-谷甾醇和β-香樹脂醇。加速氧化20 d后，羽扇豆醇和β-谷甾醇含量下降較為明顯，分別達到54.01%和48.95%，羊毛甾醇消耗了30.55%，β-香樹脂醇消耗了20.33%。李文基[21]從綠玉樹中分離得到羊毛甾醇和羽扇豆醇單體，并進行抗氧化活性測定，發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇的自由基清除率較高，具有較強的抗氧化性，能延緩氧化反應的發(fā)生。由4種甾醇的結構式可知，這4種甾醇分子中均含有一個雙鍵，而羊毛甾醇、β-谷甾醇和β-香樹脂醇中所含雙鍵均在苯環(huán)內部，而羽扇豆醇分子所含雙鍵在苯環(huán)所連接的基團上，暴露的雙鍵易使分子氧化，從而導致羽扇豆醇不穩(wěn)定、易氧化。油茶籽油中的角鯊烯含量遠低于橄欖油，僅為223.21 mg/kg，且在加速氧化20 d后降低了20.74%。角鯊烯分解后，可通過化學反應生成羊毛甾醇[22]。

橄欖油和油茶籽油中脂質伴隨物含量豐富，角鯊烯含量高于多種常見食用油，如大豆油、核桃油、芝麻油和亞麻油等[23]；所含甾醇為亞麻油的3倍以上，核桃油的10倍以上。2種油脂相比，橄欖油中含有較多的角鯊烯，其含量是油茶籽油的33倍。油茶籽油中甾醇總量高于橄欖油。橄欖油中的甾醇以β-谷甾醇為主，消耗速率較快。油茶籽油含量較高的甾醇為羊毛甾醇和β-香樹脂醇，而羽扇豆醇和β-谷甾醇消耗率較高。由此可見，β-谷甾醇在油脂氧化過程中易先被消耗，而橄欖油中β-谷甾醇含量約為油茶籽油的3.85倍，這是橄欖油氧化穩(wěn)定性較強的原因之一。

2.1.2 加速氧化過程中2種油脂的PV與生育酚含量變化分析

生育酚是一種脂溶性維生素，具有良好的抗氧化效果，常作為抗氧化劑添加到油脂中以增強油脂的氧化穩(wěn)定性。加速氧化條件下橄欖油和油茶籽油中的過氧化值和生育酚含量的變化如圖1所示。

圖1 橄欖油和油茶籽油加速氧化過程中PV與生育酚含量的變化Fig.1 Changes of PV and tocopherol content in olive oil and Camellia oleifera seed oil during accelerated oxidation process

由圖1(a)可知，隨著氧化時間的延長，橄欖油PV逐漸升高，α-生育酚含量始終呈現(xiàn)遞減趨勢，加速氧化20 d之后，整體降低了55.03%。其他2種生育酚含量變化程度較小，整體呈現(xiàn)波動下降的趨勢，其中γ-生育酚未發(fā)生明顯變化，只從25.66 mg/kg降到了23.65 mg/kg。這是由于在不同類型生育酚中α-生育酚抗氧化性最高，具體原因可能與它們的分子構型有關。α-生育酚分子的苯環(huán)鄰位和對位上均存在除羥基外的其他基團，而當苯環(huán)的臨位或者對位上含有基團時，易使苯環(huán)活化，使得分子結構的穩(wěn)定性降低[24]。γ-生育酚分子結構中，在苯環(huán)的臨位上存在基團，對位上沒有，其穩(wěn)定性高于α-生育酚。δ-生育酚中除羥基外只有一個基團，在臨位和對位上均沒有其他基團，其穩(wěn)定性高于γ-生育酚和α-生育酚。這樣的分子結構決定了α-生育酚最易被消耗，從而保護了其他2種生育酚。因此，隨著油脂氧化程度的增大，α-生育酚呈現(xiàn)遞減趨勢。

由圖1(b)可知，在油茶籽油的初始氧化階段，PV緩慢增加，α-生育酚顯著降低，其他生育酚含量處于波動狀態(tài)，加速氧化至第10天，α-生育酚消耗殆盡，剩下的2種生育酚，尤其是γ-生育酚開始迅速減少。這與生育酚分子結構決定抗氧化性強弱有關。此外，當α-生育酚接近消耗完全時，即加速氧化8～10 d時，PV的增加速率也明顯加快。可見，油脂加速氧化過程中，α-生育酚的損失對油茶籽油氧化速度影響顯著。

橄欖油和油茶籽油生育酚組成相似，總含量均高于核桃油[25]。隨著氧化程度的增加，油脂中的生育酚均以α-生育酚消耗最為迅速。2種油脂相比，油茶籽油中的α-生育酚下降速率較快，甚至在加速氧化10 d時消耗殆盡，而橄欖油中的α-生育酚相對而言較為穩(wěn)定。油茶籽油與橄欖油的油基質組成相近，生育酚種類與含量也相差不大。然而，值得注意的是，在相同的加速氧化條件下，油茶籽油PV的升高速率遠大于橄欖油。結合氧化過程中生育酚的變化趨勢，橄欖油中較為緩慢的α-生育酚下降趨勢對應較高的氧化穩(wěn)定性，油茶籽油則相反。α-生育酚消耗與2種油脂氧化程度關系密切。

2.2 橄欖油和油茶籽油室溫氧化過程的主要微量伴隨物變化分析

2.2.1 室溫氧化過程中2種油脂的甾醇和角鯊烯含量變化分析

在室溫氧化條件下，橄欖油和油茶籽油中甾醇和角鯊烯含量的變化如表3和表4所示。

由表3可知，在室溫氧化100 d過程中，橄欖油中角鯊烯含量降低了4.91%，甾醇類物質中豆甾醇和β-谷甾醇含量降低程度較大，分別為16.56%和11.93%。相比于加速氧化，在室溫氧化條件下，微量伴隨物的損失速率遠低于加速氧化。由此可見，橄欖油在常溫條件下保存時，微量伴隨物損失率較低。

由表4可知，室溫氧化條件下，油茶籽油中甾醇和角鯊烯的含量呈下降趨勢。與加速氧化結果相似，β-谷甾醇和羽扇豆醇是分解速率較高的2種甾醇。室溫氧化100 d后，β-谷甾醇降低約20.30%，羽扇豆醇降低約12.28%，羊毛甾醇和角鯊烯降低則不到10%。由此可見，在室溫氧化條件下，油茶籽油中各類甾醇發(fā)生分解，但整體上其含量下降速率遠低于加速氧化時的下降速率。這可能是由于在室溫氧化條件下，油茶籽油中油基質的分解速率低于加速氧化時的分解速率，產生的自由基等較少，甾醇和角鯊烯的消耗速率隨之降低。

在室溫氧化100 d過程中，橄欖油和油茶籽油中甾醇含量分別降低了11.95%和10.85%，兩者消耗程度相差不大；橄欖油和油茶籽油中角鯊烯降低程度分別為4.91%和2.85%，但是由于其在橄欖油中初始含量高，氧化一定時間時，橄欖油中的角鯊烯含量始終高于油茶籽油。這對于橄欖油較強的氧化穩(wěn)定性的形成是有一定作用的。

表3 橄欖油室溫氧化過程中甾醇和角鯊烯含量的變化Table 3 Changes of phytosterols and squalene content in olive oil during oxidation process at room temperature mg/kg

表4 油茶籽油室溫氧化過程中甾醇和角鯊烯含量的變化Table 4 Changes of phytosterols and squalene content in Camellia oleifera seed oil during oxidation process at room temperature mg/kg

2.2.2 室溫氧化過程中2種油脂的PV與生育酚含量變化分析

在室溫氧化條件下，橄欖油和油茶籽油中的PV和生育酚含量的變化如圖2所示。

圖2 橄欖油和油茶籽油室溫氧化過程中PV與生育酚含量的變化Fig.2 Changes of PV and tocopherol content in olive oil and Camellia oleifera seed oil during oxidation process at room temperature

由圖2(a)可知，與加速氧化類似，室溫狀態(tài)下橄欖油中α-生育酚含量隨氧化時間延長呈下降趨勢，在室溫氧化100 d后降低了45.48%，但仍保持較高含量，它的保護使得γ-生育酚和δ-生育酚在整個過程中下降十分緩慢。此外，當油脂中存在α-生育酚時，不僅保護了其他類型生育酚，也減緩了PV的增加速率，延緩了橄欖油的氧化，在室溫氧化100 d過程中PV始終未超過20 meq/kg，保證了橄欖油良好的品質。

由圖2(b)可知，與加速氧化類似，油茶籽油中生育酚含量整體呈下降趨勢，PV則在氧化過程中逐漸升高。然而，室溫條件下，α-生育酚含量的降低速率明顯低于加速氧化過程，室溫氧化100 d后其含量降低了31.98%，其他2種生育酚初始含量遠低于α-生育酚，下降程度分別為31.23%和54.82%。

綜上，2種油脂中主要生育酚類型均為α-生育酚，在室溫氧化100 d后降低程度超過40%，但是差別不明顯；而相比于油茶籽油，橄欖油中的γ-生育酚和δ-生育酚則明顯較為穩(wěn)定。相應地，在室溫條件下，橄欖油的PV增加較慢，氧化速率低于油茶籽油。

2.3 橄欖油中羥基酪醇含量變化分析

羥基酪醇是橄欖油中特有的微量伴隨物，主要存在于特級初榨橄欖油中。加速和室溫氧化過程中橄欖油中羥基酪醇含量的變化如圖3所示。

由圖3(a)可知，橄欖油中羥基酪醇初始含量為5.40 mg/kg，在加速氧化過程中含量持續(xù)下降，且在氧化6 d后下降較為顯著，加速氧化20 d期間整體含量降低了43.52%，相比橄欖油中甾醇和角鯊烯等活性物質，羥基酪醇在加速氧化時下降速率較高，穩(wěn)定性差。這可能是由于羥基酪醇分子結構中不僅同其他酚類物質一樣具有酚羥基，而且在連有苯環(huán)的乙醇鏈上還具有醇羥基，熔點低且吸濕性強，在加速氧化條件下易作為供氫體與活性較高的自由基發(fā)生反應，生成活性較低的多酚自由基，打斷自由基鏈式反應，降低油脂中自由基氧化速率，從而降低橄欖油的氧化速率。因此，在加速氧化條件下羥基酪醇消耗率高于其他伴隨物。

圖3 加速和室溫氧化條件下橄欖油中羥基酪醇含量的變化Fig.3 Changes of hydroxytyrosol content in olive oil during accelerated oxidation process and at room temperature

由圖3(b)可知，在室溫條件下，橄欖油中羥基酪醇含量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，相比于加速氧化時的快速下降，室溫氧化100 d后僅降低了12.96%?？梢娏u基酪醇在室溫氧化時的穩(wěn)定性遠高于加速氧化，分解速度緩慢，這可能是由于橄欖油在室溫條件下，甘油三酯降解速度低，油脂中的游離脂肪酸和自由基含量少，不需要消耗過多的羥基酪醇便可完成與高活性自由基的相互結合，從而打斷自由基鏈式反應，延緩了橄欖油的氧化，保護了更多羥基酪醇。因此，在室溫條件下，羥基酪醇分解速率低，含量下降緩慢，有助于橄欖油的長期高品質保存。

3 結論

通過甾醇、角鯊烯、生育酚和羥基酪醇等微量伴隨物的分析，考察了橄欖油和油茶籽油的氧化過程與微量伴隨物含量變化之間的關系。結果表明：它們在氧化期間均呈下降趨勢，且其降低速率隨氧化溫度的升高而增加。橄欖油中含有豐富的角鯊烯，其含量(7 368.61 mg/kg)是油茶籽油中角鯊烯含量(223.21 mg/kg)的33倍。在加速和室溫氧化過程中，橄欖油中的角鯊烯含量始終高于油茶籽油。對于不同類型的甾醇，β-谷甾醇在這2種油脂氧化過程中均先被消耗，而橄欖油中β-谷甾醇含量(1 157.34 mg/kg)約為油茶籽油(300.24 mg/kg)的3.85倍。橄欖油和油茶籽油中的生育酚均以α-生育酚為主，其中，橄欖油的生育酚總量和α-生育酚含量又高于油茶籽油，且氧化過程中橄欖油的α-生育酚含量始終高于油茶籽油。此外，羥基酪醇是橄欖油中特有的一種酚類物質，雖然初始含量(5.40 mg/kg)不高，但其在室溫氧化100 d過程中始終存在，未被完全消耗。因此，橄欖油的氧化速率明顯低于油茶籽油，主要是微量伴隨物組成和含量差異所致，尤其是其較高含量的角鯊烯、β-谷甾醇以及羥基酪醇等。