玉米穗三葉葉長和葉面積的QTL定位

王新濤，楊 青，李保葉，代資舉，郝俊杰

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 芝麻研究中心，河南 鄭州 450002；3.河南省作物分子育種研究院，河南 鄭州 450002)

玉米(ZeamaysL.)是我國種植面積最大、總產(chǎn)量最多的糧、經(jīng)、飼兼用作物，對保障國家糧食安全和國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的戰(zhàn)略意義[1]。玉米葉片是進(jìn)行光合作用的重要器官，通過感知溫度、光照和水分等外界信息調(diào)控一系列體內(nèi)信號通路，通過調(diào)節(jié)葉片相關(guān)性狀的變化進(jìn)而影響干物質(zhì)的積累以及產(chǎn)量的形成[2]。研究表明，玉米穗三葉(穗上葉、穗位葉和穗下葉)葉面積與單株穗質(zhì)量存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，可作為育種工作者早期判斷雜交組合優(yōu)劣的依據(jù)[3]。因此，深入挖掘控制玉米穗三葉葉長和葉面積的QTL位點(diǎn)，對于解析玉米葉片發(fā)育的分子機(jī)制和開展理想株型育種具有重要的意義。

近年來隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，對玉米葉片相關(guān)性狀的QTL定位研究也取得了重要進(jìn)展，促進(jìn)了復(fù)雜數(shù)量性狀的遺傳解析和分子標(biāo)記輔助育種應(yīng)用。Agrama等[4]首次利用214個F2：3家系在2種氮肥條件下定位到7個穗位葉葉面積QTL。劉建超等[5]以葉面積差異顯著的親本478×武312構(gòu)建重組自交系群體，2 a共定位到7個穗三葉葉面積QTL，其中在第2染色體的umc1542～umc1518標(biāo)記區(qū)間發(fā)現(xiàn)一個主效QTL位點(diǎn)。Ku等[6]利用256個F2：3家系，在玉米的第1，2，3，5，7，8號染色體上定位到10個葉寬和葉長QTL。Zheng等[7]利用玉米重組自交系在高氮條件下定位到9個穗位葉相關(guān)性狀(葉長、葉寬和葉面積)QTL，能夠解釋5.4%～14.8%的表型變異；低氮條件下定位到7個穗位葉相關(guān)性狀的QTL，可以解釋5.5%～20.5%的表型變異。安允權(quán)等[8]利用259個單株的F2群體，在玉米第1，2，3，5號染色體上共定位到36個葉面積QTL，且發(fā)現(xiàn)不同葉位葉面積的QTL存在集中分布現(xiàn)象。羅巧玲等[9]通過自交系鄭58和B73構(gòu)建F2群體，在第1，2，3，4，5，6號染色體上檢測到11個控制葉長的QTL，單個QTL的表型貢獻(xiàn)率為3.69%～25.53%。白明興等[10]則通過253份玉米自交系對穗三葉性狀(葉長、葉寬及葉面積)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，檢測到21個顯著的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)。從上述定位結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，葉部尤其是穗位葉相關(guān)性狀屬于典型的數(shù)量性狀，不同遺傳背景下定位獲得的QTL不盡一致，并且受環(huán)境影響較大，限制了其在育種中的利用效率。

為了加快育種進(jìn)程，我國中低緯度地區(qū)的育種單位在當(dāng)?shù)匾话銜N植春播和夏播兩季玉米，播期不同造成玉米生長發(fā)育過程中的溫度、水分、光照等生態(tài)因子發(fā)生改變，影響葉片生長速率、大小以及光合速率，最終對產(chǎn)量產(chǎn)生影響[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，春播環(huán)境下，穗三葉葉面積以多基因遺傳為主；夏播環(huán)境下，穗三葉葉面積則以主基因遺傳為主[13]?，F(xiàn)有關(guān)于玉米葉片性狀的QTL研究多集中于不同地點(diǎn)和不同年份，而對于春播和夏播不同播期下的定位研究很少。因此，在不同的播期條件下，挖掘穩(wěn)定表達(dá)或者新的控制玉米葉片相關(guān)性狀QTL，對于進(jìn)一步解析玉米葉片的遺傳組成十分必要。

本研究利用玉米葉片大小存在顯著差異的自交系鄭58和D863F構(gòu)建重組自交系群體，在2 a的春播、夏播不同環(huán)境條件下，對穗三葉葉長和葉面積進(jìn)行QTL定位，旨在為解析玉米葉片相關(guān)性狀的遺傳基礎(chǔ)和開展玉米理想株型分子育種工作提供有益參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為自交系鄭58和D863F及其組配構(gòu)建的含241個家系的RIL群體[14]。其中，鄭58具有配合力高、耐密植、抗逆性強(qiáng)等綜合優(yōu)良性狀，是我國核心骨干玉米自交系；D863F對多種玉米病害如粗縮病、南方銹病和彎孢葉斑病等都具有較好的抗性，是優(yōu)良的抗性育種材料。

1.2 田間試驗和性狀調(diào)查

將RIL群體及其親本分別于2018年(4月18日春播、6月10日夏播)和2019年(4月19日春播、6月12日夏播)種植于河南原陽(35°05′N，113°96′E)河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗示范基地，行長2 m，行距0.60 m，株距0.25 m，3次重復(fù)，常規(guī)大田管理。

玉米散粉吐絲7 d后，從每個株系的第3株開始選擇長勢整齊一致的植株，分別測量穗三葉的葉長(Leaf length，LL)和葉寬(Leaf width，LW)，利用測量的葉長和葉寬值計算其葉面積(Leaf area，LA)，穗下葉、穗位葉和穗上葉葉長/面積分別命名為FirLL/LA、SecLL/LA和ThiLL/LA。其中，葉長用尺子從葉耳至葉尖進(jìn)行測量，葉寬測量葉片的最大寬度，對應(yīng)的葉面積計算方法：LA=LL×LW×0.75[15]。

1.3 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL定位

利用篩選出來的215對具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記對RIL群體進(jìn)行基因型分析，應(yīng)用JoinMap 4.0軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，該遺傳連鎖圖譜全長1 832.35 cM，標(biāo)記間的平均距離為8.52 cM[16]。采用IciMapping v4.0對2 a不同環(huán)境下的穗三葉葉長和葉面積進(jìn)行QTL定位分析，軟件參數(shù)LOD閾值為2.5，步長為1 cM，PIN值為0.01，進(jìn)行1 000次模擬運(yùn)算檢測。

檢測到的QTL命名方式：q+性狀+染色體位置，相同染色體不同區(qū)間若存在多個QTL位點(diǎn)，則在其后加數(shù)字1，2，3等進(jìn)行區(qū)分。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本和RIL群體穗三葉葉長和葉面積表型分析

在春播和夏播不同環(huán)境條件下，玉米雙親和RIL群體的葉長和葉面積表現(xiàn)出一定的差異(表1、圖1—4)。夏播條件下雙親及RIL群體的葉長和葉面積均大于春播條件下的性狀值。相同環(huán)境條件下鄭58的穗三葉葉長(58.67～78.03 cm)等于或略高于D863F(57.00～77.28 cm)，鄭58的穗三葉葉面積(267.39～424.55 cm2)低于D863F(358.65～566.72 cm2)。RIL群體中不同株系的穗三葉葉長和葉面積均表現(xiàn)出較大的變異，其峰度和偏度的絕對值均小于1，基本符合正態(tài)分布，這些結(jié)果表明穗三葉葉長和葉面積屬于受多基因控制的數(shù)量性狀，該群體適合做進(jìn)一步深入分析和QTL定位研究。

表1 不同環(huán)境下玉米親本及RIL群體葉片相關(guān)性狀分析Tab.1 Phenotypic value statistics of leaf related traits in parents and RIL population under different environments

2.2 不同播期條件下RIL群體穗三葉各表型性狀相關(guān)分析及遺傳力分析

對2 a不同播期環(huán)境下RIL群體的穗三葉葉長和葉面積進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明(表2)，玉米RIL群體穗下葉、穗位葉、穗上葉的葉長和葉面積兩兩之間呈極顯著正相關(guān)。春播環(huán)境下，穗下葉和穗位葉葉面積的相關(guān)系數(shù)最大，2018，2019年分別為0.93和0.91；穗下葉葉長和穗上葉葉面積的相關(guān)系數(shù)最小，分別為0.71和0.67。夏播環(huán)境下，穗下葉和穗位葉葉長的相關(guān)系數(shù)最大，2018，2019年分別為0.95和0.94；穗上葉葉長和穗下葉葉面積的相關(guān)系數(shù)最小，分別為0.63和0.47。

圖1 2018年春播玉米RIL群體葉長和葉面積的頻率分布Fig.1 Frequency distribution of leaf length and leaf area of maize RIL population in spring sowing environment of 2018

圖2 2018年夏播玉米RIL群體葉長和葉面積的頻率分布Fig.2 Frequency distribution of leaf length and leaf area of maize RIL population in summer sowing environment of 2018

對2 a不同播期環(huán)境下RIL群體的穗三葉葉長和葉面積進(jìn)行方差分析(表3)，發(fā)現(xiàn)穗下葉、穗位葉和穗上葉的葉長和葉面積在基因型、環(huán)境以及基因型×環(huán)境互作下的差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，且廣義遺傳力較高，分別為88.04%，88.45%，87.86%，85.04%，85.27%和85.73%。

2.3 玉米穗三葉葉長和葉面積的QTL定位

在不同播期環(huán)境下，共檢測到23個與玉米穗三葉葉長和葉面積性狀有關(guān)的QTL，其中穗三葉葉長14個，葉面積9個(表4)。其中，在2 a春播環(huán)境下檢測到5個葉長QTL和4個葉面積QTL，2 a夏播環(huán)境下檢測到12個葉長QTL和7個葉面積QTL，2個QTL在3個環(huán)境下被同時檢測到，10個QTL在2個環(huán)境下被重復(fù)檢測到，其余11個QTL僅能在單一環(huán)境下被檢測到。這些QTL分布于玉米的第1，2，4，5，6，8號染色體上，單個QTL可以解釋5.84%～17.81%的表型變異。

圖3 2019年春播玉米RIL群體葉長和葉面積的頻率分布Fig.3 Frequency distribution of leaf length and leaf area of maize RIL population in spring sowing environment of 2019

圖4 2019年夏播玉米RIL群體葉長和葉面積的頻率分布Fig.4 Frequency distribution of leaf length and leaf area of maize RIL population in summer sowing environment of 2019

表2 玉米RIL群體葉片性狀的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis among traits related with leaf in maize RIL population

表3 不同環(huán)境下玉米RIL群體葉片相關(guān)性狀的方差分析Tab.3 Variance analysis on traits related with leaf in maize RIL population under different environments

穗下葉葉長：檢測到6個控制穗下葉葉長的QTL，分布于第1，2，4，5，8號染色體上(表4)。春播和夏播環(huán)境下分別檢測到3，5個相關(guān)的QTL，其中qFirLL5-1在3個環(huán)境下被檢測到，qFirLL1-1、qFirLL1-2、qFirLL4-1和qFirLL8-1在2個環(huán)境下被重復(fù)檢測到，qFirLL2-1只在1個環(huán)境下被檢測到。qFirLL1-1、qFirLL2-1和qFirLL5-1的貢獻(xiàn)率分別達(dá)到10.49%(2018夏播)、11.70%(2019夏播)和10.82%(2018夏播)。

穗位葉葉長：檢測到5個控制穗位葉葉長的QTL，分布于第1，2，4，5號染色體上(表4)。春播和夏播環(huán)境下分別檢測到1，5個相關(guān)的QTL，其中qSecLL1-1和qSecLL1-2在2個環(huán)境下被重復(fù)檢測到，qSecLL2-1、qSecLL4-1和qSecLL5-1只在1個環(huán)境下被檢測到。qSecLL1-2和qSecLL2-1的貢獻(xiàn)率分別達(dá)到10.87%(2018春播)和13.47%(2019夏播)。

穗上葉葉長：檢測到3個控制穗上葉葉長的QTL，分布于第2，4，5號染色體上(表4)。春播和夏播環(huán)境下分別檢測到1，2個相關(guān)的QTL，其中qThiLL2-1和qThiLL5-1在2個環(huán)境下被重復(fù)檢測到，qThiLL4-1只在1個環(huán)境下被檢測到。qThiLL2-1貢獻(xiàn)率分別達(dá)到11.87%(2018夏播)和11.83%(2019夏播)，qThiLL4-1的貢獻(xiàn)率達(dá)到11.49%(2019夏播)。

穗下葉葉面積：檢測到4個控制穗下葉葉面積的QTL，分布于第1，2，5，6號染色體上(表4)。春播和夏播環(huán)境下分別檢測到2，3個相關(guān)的QTL，其中qFirLA2-1在3個環(huán)境下被檢測到，qFirLA1-1、qFirLA5-1和qFirLA6-1只在1個環(huán)境下被檢測到。qFirLA2-1的貢獻(xiàn)率分別達(dá)到17.81%(2019春播)和10.97%(2019夏播)，qFirLA5-1的貢獻(xiàn)率達(dá)到11.42%(2018夏播)。

穗位葉葉面積：檢測到3個控制穗位葉葉面積的QTL，分布于第1，2，5號染色體上(表4)。春播和夏播環(huán)境下分別各檢測到2個相關(guān)的QTL，其中qSecLA1-1和qSecLA2-1在2個環(huán)境下被重復(fù)檢測到，qSecLA5-1只在1個環(huán)境下被檢測到。qSecLA2-1的貢獻(xiàn)率分別達(dá)到11.54%(2019春播)和14.08%(2019夏播)，qSecLA5-1的貢獻(xiàn)率達(dá)到10.10%(2018夏播)。

穗上葉葉面積：檢測到2個控制穗上葉葉面積的QTL，分布于第2，5號染色體上(表4)。只在夏播環(huán)境下檢測到2個相關(guān)的QTL，且qThiLA2-1和qThiLA5-1只在1個環(huán)境下被檢測到，其中qThiLA2-1的貢獻(xiàn)率達(dá)到10.80%(2019夏播)。

穗三葉葉長和葉面積共定位：2 a不同環(huán)境條件下，在第2號染色體bnlg1316～bnlg1141區(qū)間內(nèi)同時檢測到影響穗下葉葉長、穗位葉葉長、穗上葉葉長、穗下葉葉面積、穗位葉葉面積和穗上葉葉面積的QTLqFirLL2-1、qSecLL2-1、qThiLL2-1、qFirLA2-1、qSecLA2-1和qThiLA2-1，貢獻(xiàn)率為10.05%～17.81%，增效等位基因來源于D863F，為主效QTL位點(diǎn)。在第5號染色體umc1591～umc2298區(qū)間內(nèi)也同時檢測到控制這6個性狀的QTLqFirLL5-1、qSecLL5-1、qThiLL5-1、qFirLA5-1、qSecLA5-1和qThiLA5-1，貢獻(xiàn)率為6.42%～11.42%，增效等位基因也來自D863F。

表4 玉米RIL群體葉片性狀相關(guān)的QTLTab.4 QTLs related with leaf traits in maize RIL population

表4(續(xù))

3 結(jié)論與討論

由于玉米穗三葉對產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率接近70%，因此在玉米育種進(jìn)程中，葉片特別是穗位葉相關(guān)性狀是重要的株型選擇指標(biāo)之一[17]。白明興等[10]研究表明，玉米穗三葉的葉長、葉寬和葉面積等性狀緊密聯(lián)系又相互促進(jìn)，呈現(xiàn)顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系；鐘源等[18]通過對187份玉米自交系穗三葉表型測定，發(fā)現(xiàn)葉長與葉面積間呈極顯著正相關(guān)。這些結(jié)論與本研究的結(jié)果相似，由此可見，在對葉片相關(guān)性狀進(jìn)行改良時，可以對容易考察的性狀指標(biāo)如葉長進(jìn)行選擇，從而達(dá)到和葉面積性狀協(xié)同改良的效果。

葉片相關(guān)性狀屬于多基因控制的數(shù)量性狀，其遺傳機(jī)制復(fù)雜且容易受環(huán)境影響[19]。本研究利用重組自交系群體對穗三葉的葉長和葉面積進(jìn)行QTL定位，檢測到調(diào)控穗三葉葉長的QTL 14個，葉面積有關(guān)的QTL 9個。其中，在第2號染色體bnlg1316～bnlg1141區(qū)間內(nèi)同時檢測到影響穗下葉葉長、穗位葉葉長、穗上葉葉長、穗下葉葉面積、穗位葉葉面積和穗上葉葉面積的QTL，貢獻(xiàn)率均大于10%，與Cai等[20]定位的葉面積、葉長QTLqLA2和qLL2-2以及Wang等[21]定位的葉長QTLqLLa2-1區(qū)間一致。在第5號染色體umc1591～umc2298區(qū)間內(nèi)也同時檢測到控制這6個性狀的QTL，與Ku等[6]定位的葉長QTLqLL5-2一致。通過MetaQTL分析發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)存在1個控制玉米葉形性狀的“一因多效”QTL，候選基因為GRMZM2G171349，其主要參與植物激素的合成與代謝，進(jìn)而調(diào)控葉片的發(fā)育[22-23]。由此推測，以上2個QTL可靠性較高，是控制葉片相關(guān)性狀表型變異的重要位點(diǎn)，該區(qū)段進(jìn)一步的精細(xì)定位和基因克隆對解析玉米葉片性狀的遺傳基礎(chǔ)和株型育種改良具有重要意義。

春播和夏播環(huán)境下，玉米葉面積受主基因和多基因調(diào)控的表現(xiàn)差異明顯，即受基因控制的遺傳表現(xiàn)并非一致[13]。本研究同時在春、夏播環(huán)境下檢測到葉長QTL有 3個(qFirLL1-2、qFirLL5-1和qSecLL1-2)，葉面積QTL有2個(qFirLA2-1和qSecLA2-1)，其余位點(diǎn)只能單獨(dú)在春播或夏播環(huán)境下被檢測到。因此，在不同的播期環(huán)境下，挖掘穩(wěn)定表達(dá)的控制玉米葉片相關(guān)性狀QTL，并根據(jù)不同的育種環(huán)境制定相應(yīng)的育種策略，對定向提高葉片相關(guān)性狀的育種效率具有重要意義。