SMILE來源的角膜基質(zhì)透鏡研究進(jìn)展

劉雪珂，李 霞，劉 毅

0引言

自2011年以來，飛秒激光小切口角膜基質(zhì)透鏡取出術(shù)(small incision lenticule extraction,SMILE)得到了廣泛的開展[1]。SMILE是利用飛秒激光精準(zhǔn)聚焦定位的立體切割技術(shù)，在角膜基質(zhì)層內(nèi)進(jìn)行兩次不同深度的掃描，切割出具有一定大小和厚度的片狀角膜組織，這片被取出的角膜組織即角膜基質(zhì)透鏡。由于角膜基質(zhì)透鏡來源于活體，取材方便，近年來一些學(xué)者開始探索和利用它們。隨著研究的深入，角膜基質(zhì)透鏡得到廣泛的應(yīng)用，本文就角膜基質(zhì)透鏡的結(jié)構(gòu)特點、保存方法及其在眼科中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1角膜基質(zhì)透鏡的特點

角膜基質(zhì)透鏡是角膜基質(zhì)層中央?yún)^(qū)的前層組織，由有序排列的膠原纖維構(gòu)成，其間無血管及淋巴組織，其正常的解剖結(jié)構(gòu)和生理功能對維持角膜透明度及生物具有重要意義。根據(jù)預(yù)計矯正的屈光度數(shù)的不同，角膜基質(zhì)透鏡中央厚、周邊薄，直徑6.0～6.5mm，厚度60～130μm。Yin等[2]描述了SMILE過程中提取的新鮮角膜基質(zhì)透鏡組織學(xué)和形態(tài)學(xué)特征，在光學(xué)顯微鏡下，角膜基質(zhì)透鏡橫切面邊緣可見部分毛刺和膠原纖維斷裂，腫脹的角膜基質(zhì)纖維呈不規(guī)則分布。在電子顯微鏡下，可看到用飛秒激光消融的透鏡表面并不完全光滑，前表面稍比后表面光滑，表面可見膠原纖維壞死、溶解，可見使用飛秒激光切割的角膜基質(zhì)透鏡的表面質(zhì)量并不是最佳的。Bandeira等[3]發(fā)現(xiàn)角膜基質(zhì)透鏡中神經(jīng)突密度與其厚度呈負(fù)相關(guān)，而角膜基質(zhì)中軸突總長度與厚度的關(guān)系不明顯。興奮性鈣反應(yīng)試驗是評估角膜基質(zhì)透鏡中神經(jīng)突的功能，經(jīng)4℃和液氮保存后興奮性鈣反應(yīng)明顯減少，這可能是由于冷凍和解凍期間的低溫效應(yīng)影響神經(jīng)突的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣運動停止，因此進(jìn)一步研究冷凍保存條件(包括冷凍保存介質(zhì)的類型、冷凍和解凍時間，以及逐步的溫度變化)可能會提供關(guān)于保存神經(jīng)突活性的信息。透射電鏡下可見施萬細(xì)胞(Schwann cells,SCs)與神經(jīng)突關(guān)系密切。在SCs和興奮性鈣反應(yīng)的存在下，這些殘留的神經(jīng)突可以保留最低的功能，這可能是角膜基質(zhì)透鏡植入的潛在優(yōu)勢，可能會影響植入后的神經(jīng)再支配。

2角膜基質(zhì)透鏡保存方法

從SMILE術(shù)中取出的新鮮角膜基質(zhì)透鏡最大程度保留了原有的組織和結(jié)構(gòu)，但因受時間、地點的限制，可能不能立即投入使用，我們可以先將其儲存起來，以便以后需要時重新取出。不同的保存方法對角膜基質(zhì)透鏡的厚度、透明度、機(jī)械性能等改變也是不同的，因此無論是將角膜基質(zhì)透鏡用于基礎(chǔ)實驗還是臨床研究，選擇合理的儲存方式顯得尤為重要。

在SMILE開展之前，一些學(xué)者已經(jīng)對角膜的保存進(jìn)行研究[4]。Mohamed-Noriega等[5]對保存在Optisol培養(yǎng)基的人體角膜行飛秒激光角膜基質(zhì)透鏡切除術(shù)，將提取的角膜基質(zhì)透鏡分為新鮮組和冷凍保存組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組均可看到死亡的細(xì)胞，但冷凍保存組中有足夠的活性角膜基質(zhì)細(xì)胞，可以在保存1mo后分離和增殖。這種冷凍保存方式除了膠原纖維密度降低外，仍保持了角膜基質(zhì)細(xì)胞的活性和整體膠原結(jié)構(gòu)的完整性。Ganesh等[6]對Mohamed-Noriega等[5]的技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，即用人組織培養(yǎng)液代替牛血清白蛋白，這是為了消除人畜共患病傳播和牛血清引起不良反應(yīng)的風(fēng)險。

雖然已開發(fā)的冷凍保存方法可保存角膜基質(zhì)透鏡，但因技術(shù)復(fù)雜和成本較高，限制了應(yīng)用。早在1954年，Mcnair等[7]首次報道了用95%的甘油在真空下保持角膜脫水狀態(tài)。范軍華等[8]對傳統(tǒng)甘油保存方法進(jìn)行改良，通過電鏡觀察到這種方法保存的角膜結(jié)構(gòu)完整。另外無水氯化鈣法同甘油一樣也屬于干燥脫水法，通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)在角膜透明度方面，無水氯化鈣法優(yōu)于甘油保存法[9]，透射電鏡和組織切片可見經(jīng)無水氯化鈣保存后的角膜組織結(jié)構(gòu)與新鮮的無明顯差異，角膜基質(zhì)層膠原纖維排列均勻[10]。

為了探究溫度和輔助脫水劑對長期保存在甘油中的人角膜組織的作用，Tripathi等[11]發(fā)現(xiàn)與-20℃或4℃相比，甘油保存的人角膜組織在-80℃具有更好的無菌性、厚度、光學(xué)透明度、機(jī)械強(qiáng)度和超微結(jié)構(gòu)特征，且抗原性小。Romano等[12]將刮除上皮和內(nèi)皮的角膜基質(zhì)放入硅膠中，在室溫下保存2wk后復(fù)水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人體角膜基質(zhì)可在脫水狀態(tài)下保存2wk，脫水和復(fù)水過程對基質(zhì)的厚度、透明度和生物力學(xué)性能沒有明顯的影響。

Liu等[13]發(fā)現(xiàn)保存于磷酸鹽緩沖溶液、DMEM、Optisol GS和100%無水甘油的角膜基質(zhì)透鏡均能保持其透明度和完整的結(jié)構(gòu)，同時具有較低的免疫原性。Liang等[14]比較了99%無水甘油、變色硅膠和Optisol培養(yǎng)基的保存效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)這三種方法保存后水腫程度和膠原纖維密度隨著時間的推移逐漸惡化，無水甘油中較為明顯。在角膜透明度方面，Optisol組最好，硅膠組次之。在Optisol組中細(xì)胞活性和膠原纖維結(jié)構(gòu)的完整性在保存前后保持不變。Xia等[15]進(jìn)行了類似的研究，兩者[14-15]除保存時間不同外，均發(fā)現(xiàn)甘油保存的角膜基質(zhì)透鏡比其他組有更嚴(yán)重的水腫和更低的膠原纖維密度。Shang等[16]研究發(fā)現(xiàn)-78℃無水甘油保存不僅可以達(dá)到0.1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)降低抗原的效果，而且可以避免其對正常膠原纖維結(jié)構(gòu)和角膜基質(zhì)的光學(xué)和力學(xué)性能的破壞，是獲得高質(zhì)量移植物較為理想的方法。

甘油是一種無味、無色的黏性液體，具有優(yōu)異的脫水和抗菌性能，并且可以維持角膜的結(jié)構(gòu)，其用途已得到廣泛證實。硅膠是一種非活性防腐保存技術(shù)，通過去除角膜組織中的水分，防止細(xì)胞酶失活，抑制組織細(xì)胞自溶，從而保持組織細(xì)胞的完整性。無水氯化鈣是一種吸水性很強(qiáng)的干燥劑，能迅速吸收角膜中的水分，完整地保存具有一定活性的角膜組織，是眼庫長期保存角膜的方法之一。Optisol是目前國際上最常用的中期保存液，可安全有效保存角膜組織。但Optisol成本高，與Optisol相比，甘油大大降低了成本，而且甘油可以很明顯地降低角膜組織中的細(xì)胞密度和抗原性，最大限度地減少免疫排斥反應(yīng)，加上操作簡單易行，在我國許多基層醫(yī)院仍為實用性較強(qiáng)的保存方法。

3角膜基質(zhì)透鏡的應(yīng)用

3.1矯正遠(yuǎn)視及散光已有報道證實使用SMILE來源的自體或同種異體角膜基質(zhì)透鏡植入術(shù)均可以矯正遠(yuǎn)視[17-18]。雖然發(fā)現(xiàn)同種異體角膜基質(zhì)透鏡植入術(shù)出現(xiàn)過少數(shù)排斥反應(yīng)，但其手術(shù)的可預(yù)測性和穩(wěn)定性優(yōu)于傳統(tǒng)的準(zhǔn)分子激光原位角膜磨鑲術(shù)(laserinsitukeratomileusis, LASIK)，為中高度遠(yuǎn)視患者提供了一個更安全、有效的手術(shù)方式。Liu等[19]第一次對SMILE、LASIK、自體角膜基質(zhì)透鏡植入術(shù)三種遠(yuǎn)視矯正方式進(jìn)行比較評估，發(fā)現(xiàn)在低度遠(yuǎn)視治療中，角膜基質(zhì)透鏡植入術(shù)在高階像差方面有良好的發(fā)展趨勢。

在前期研究的基礎(chǔ)上，Zhang等[20]首次報道了使用SMILE聯(lián)合角膜基質(zhì)透鏡植入術(shù)治療遠(yuǎn)視合并散光的患者。該手術(shù)最關(guān)鍵的一步是保證術(shù)中中心對齊，術(shù)中用核黃素溶液進(jìn)行等心定位。隨訪1a后所有角膜均保持透明，術(shù)中、術(shù)后未出現(xiàn)并發(fā)癥。凌玲等[21]提出一種角膜基質(zhì)透鏡散光標(biāo)記盤，用于透鏡的盛載檢查、標(biāo)記和定型。該方法可有效矯正散光，部分患者術(shù)后仍存在散光，可能與角膜愈合的不確定性及散光軸向的手工定位及標(biāo)記等因素有關(guān)，盡管如此，散光標(biāo)記器還是為遠(yuǎn)視伴散光患者提供了新的、有效的手術(shù)方式。

3.2角膜病角膜病是我國的第二大致盲眼病,目前角膜盲最難解決的瓶頸問題是角膜供體嚴(yán)重不足。面對日益增長的需求與角膜供體材料短缺之間的矛盾，尋找新的角膜材料來源是目前解決這一問題的重要手段。SMILE來源的角膜基質(zhì)透鏡在一定條件下可以替代角膜植片，用于一些角膜相關(guān)疾病的治療。

3.2.1圓錐角膜Ganesh等[22]首次采用飛秒激光輔助角膜基質(zhì)透鏡植入聯(lián)合加速膠原交聯(lián)術(shù)(collagen crosslinking,CXL)，研究其在進(jìn)展性圓錐角膜(keratoconus,KC)和角膜塑形鏡不耐受患者中的扁平化效果、屈光狀態(tài)和安全性結(jié)果，術(shù)后所有患者均未出現(xiàn)排斥反應(yīng)，裸眼遠(yuǎn)視力、矯正遠(yuǎn)視力和等效球鏡均改善，角膜厚度均增加，只有1眼角膜曲率未下降，可能因其是晚期KC。Doroodgar等[23]報道了一種治療晚期KC的新方法，即定制角膜基質(zhì)透鏡植入術(shù)，將定制的復(fù)合型(項鏈型+120°戒指型)或項鏈形狀的透鏡植入晚期KC，術(shù)后6mo最佳矯正視力均提高，角膜總屈光度下降，角膜厚度增加?？傊?，角膜基質(zhì)透鏡植入術(shù)是矯正KC患者的屈光度、增加角膜厚度、調(diào)節(jié)角膜曲率的一種可行的治療方案，但是否需要聯(lián)合CXL以及術(shù)后屈光結(jié)果的準(zhǔn)確性和可預(yù)測性仍然需要進(jìn)一步研究[24]。

3.2.2角膜穿孔Wu等[25]第一個成功將-80℃保存的角膜基質(zhì)透鏡用于治療疑難、緊急角膜穿孔患者，該研究認(rèn)為角膜基質(zhì)透鏡可能是立即閉合角膜穿孔損傷的最佳選擇。Jiang等[26]也得出同樣結(jié)論。由于單個透鏡厚度較薄且韌性有限，不利于術(shù)中辨識和操作，幾個透鏡聯(lián)合移植操作困難且耗時，疊加對位不準(zhǔn)確或比較松散時，有可能導(dǎo)致植片結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，延遲角膜上皮愈合。姚濤等[27]使用吲哚菁綠染色劑將基質(zhì)透鏡染色后再置于-40℃保存，并將其用于治療角膜穿孔患者，術(shù)中應(yīng)用纖維蛋白膠黏合多層角膜基質(zhì)透鏡后，再用10-0尼龍線間斷縫合固定。所有患者術(shù)中操作順利，術(shù)后發(fā)現(xiàn)染色劑可被迅速代謝，對角膜上皮愈合無影響。所有患者均在1wk內(nèi)完全上皮化，未出現(xiàn)移植物融解等并發(fā)癥。聯(lián)合應(yīng)用纖維蛋白膠和吲哚菁綠染色，可方便手術(shù)操作，提高手術(shù)成功率。王曙亮等[28]的實驗研究中再次證明用纖維蛋白膠構(gòu)建的角膜基質(zhì)植片能安全、可靠且有效地修復(fù)前部受損角膜，為角膜穿孔的治療提供了新途徑。

3.2.3Mooren潰瘍和翼狀胬肉共存He等[29]報道了第一例使用角膜基質(zhì)透鏡治療Mooren潰瘍與翼狀胬肉共存的病例。1例61歲女性患者在接受了近3mo的局部免疫抑制和抗感染治療后，眼部癥狀和體征并沒有明顯改善。在保守治療失敗后，使用低溫保存的SMILE來源的角膜基質(zhì)透鏡行板層角移，并行翼狀胬肉切除聯(lián)合自體結(jié)膜移植術(shù)。該手術(shù)是為了維持角膜結(jié)構(gòu)、防止疾病進(jìn)展。手術(shù)的成功表明，如果保守治療失敗，聯(lián)合手術(shù)可能是治療Mooren潰瘍和翼狀胬肉共存的有效方法。

3.2.4角膜皮樣瘤李世洋等[30]采用SMILE術(shù)獲得的角膜基質(zhì)透鏡作為板層角膜移植材料，并聯(lián)合羊膜移植治療角膜皮樣瘤，取得滿意效果。在前人的基礎(chǔ)上，蘇紅等[31]進(jìn)一步嘗試在不使用羊膜移植的情況下，也取得了滿意的效果。為了美觀，Jacob等[32]切除病變組織后，用染料在預(yù)定的角膜緣染色，再使用纖維蛋白膠黏貼角膜基質(zhì)透鏡和結(jié)膜，術(shù)后患者對外觀和屈光效果均較滿意。角膜染色被認(rèn)為是一種安全有效的技術(shù)，但也報道過各種并發(fā)癥，如嚴(yán)重的毒性反應(yīng)、角膜融化、肉芽腫性角膜炎、持續(xù)性上皮缺損等。Pant等[33]使用10-0尼龍縫線替代纖維蛋白膠最大限度地降低了移植物復(fù)發(fā)、角膜上皮糜爛和肉芽腫性角膜炎等風(fēng)險，這些在使用纖維蛋白膠時常見。Wan等[34]也使用10-0尼龍縫線間斷縫合角膜基質(zhì)透鏡，盡管這會增加手術(shù)時間，導(dǎo)致不規(guī)則散光，但它比纖維蛋白膠更加固定，隨訪期間所有患者的視力和散光均有改善的趨勢。

3.2.5準(zhǔn)分子激光角膜原位磨鑲術(shù)后角膜擴(kuò)張已有研究表明角膜基質(zhì)透鏡用于治療LASIK術(shù)后角膜擴(kuò)張癥是一種安全有效的手術(shù)方法。Li等[35]第一個從細(xì)胞水平表征LASIK術(shù)后角膜擴(kuò)張的同種異體基質(zhì)內(nèi)透鏡植入后傷口愈合的過程。研究結(jié)果顯示，在受體角膜與植入基質(zhì)透鏡的交界處，角膜基質(zhì)細(xì)胞的密度和形態(tài)在初期減少和變形后又逐漸恢復(fù)，還發(fā)現(xiàn)供體的角膜基質(zhì)透鏡神經(jīng)纖維再生。

3.3角膜基質(zhì)透鏡在青光眼小梁切除術(shù)中的應(yīng)用Yin等[36]將來源于SMILE新鮮的角膜基質(zhì)透鏡用氯化鈉和核酸酶脫細(xì)胞后，置于-80℃平衡鹽溶液中保存?zhèn)溆茫瑢ν眯行×呵谐g(shù)，將脫細(xì)胞的角膜基質(zhì)透鏡固定于結(jié)膜下間隙。術(shù)后觀察到脫細(xì)胞角膜基質(zhì)透鏡可顯著增加濾過泡存在時間，降低眼壓，且無不良反應(yīng)。組織病理學(xué)結(jié)果顯示脫細(xì)胞組結(jié)膜下間隙較大，結(jié)膜下纖維化較輕。本研究首次證實了脫細(xì)胞的角膜基質(zhì)透鏡可預(yù)防兔眼小梁切除術(shù)術(shù)后結(jié)膜-鞏膜黏連和纖維化，這可能是小梁切除術(shù)中一種新的抗纖維化方法，但其安全性和有效性仍需進(jìn)行更大樣本量和更長隨訪時間的研究。

4總結(jié)與展望

角膜基質(zhì)透鏡具有生物相容性好、易操作、成本低等優(yōu)點，在當(dāng)前角膜組織供源遠(yuǎn)遠(yuǎn)供不應(yīng)求的狀況下，選擇SMILE來源的角膜基質(zhì)透鏡在某些情況下作為替代品也是一種不錯的選擇。雖然角膜基質(zhì)透鏡在治療遠(yuǎn)視、散光、角膜穿孔和圓錐角膜等眼科疾病中有著不錯的應(yīng)用效果，但角膜基質(zhì)透鏡矯正遠(yuǎn)視及散光、圓錐角膜術(shù)后視力的可預(yù)測性仍有待提高，對于遠(yuǎn)視合并散光患者術(shù)中角膜基質(zhì)透鏡的定位是較為關(guān)鍵的步驟，目前仍有待進(jìn)一步研究。角膜基質(zhì)透鏡的表面質(zhì)量也有待改善，一旦角膜基質(zhì)透鏡具有更完美的表面質(zhì)量，更多角膜材料將用于治療角膜疾病。角膜基質(zhì)透鏡的保存方法各有其特點，選擇合適的保存方法才能更好地用于臨床。隨著我們深入的研究，角膜基質(zhì)透鏡有望能夠在更多方面應(yīng)用。