氟樂靈抗體的制備及其酶聯(lián)免疫分析方法的建立

黃惠威，劉鳳銀，曾思敏，曾羲，錢振杰，施迪燊，聶玉丹，江海超，袁學文，穆洪濤*

（1.廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣東廣州 510303）（2.廣州市食品檢驗所，廣東廣州 511400）

氟樂靈屬于二硝基苯胺類藥物[1]，廣泛應用于防除單子葉雜草[2]，也可以抗有絲分裂阻止染色體加倍獲得單倍體植株[3,4]，具有價格低廉、藥效明顯等特點[5,6]。然而氟樂靈會殘留在食品或環(huán)境中，對水生生物和環(huán)境造成危害，也會極大影響人體健康[7-9]，例如胎兒發(fā)育不正常、內(nèi)分泌功能失調(diào)和致癌等[10,11]。

氟樂靈的廣泛應用造成大量氟樂靈農(nóng)藥殘留量超標現(xiàn)象[12,13]，因此許多國家和組織對氟樂靈農(nóng)藥制定了嚴格的殘留限量[14-16]。例如，歐盟規(guī)定玉米、棉籽和花生仁中氟樂靈農(nóng)藥殘留限量為10 μg/kg[6]，日本規(guī)定油為15 μg/kg，澳大利亞規(guī)定油料為50 μg/kg[7]，中國規(guī)定大豆、花生、豆油、花生油、玉米、棉籽、花生仁為 50 μg/kg[7,16]。氟樂靈農(nóng)藥在土壤中留存持久，半衰期約為 3～12個月[17]，氟樂靈的廣泛應用和長期存在，對水生生物具有高毒[18]，也會影響農(nóng)作物的出苗率和生長[19]。2010年日本屢次檢出中國出口的水產(chǎn)品梭子蟹和鰻魚中的氟樂靈超標[20]，因此日本要求加強對中國梭子蟹和鰻魚中的氟樂靈農(nóng)藥的監(jiān)控檢查，造成中國水產(chǎn)品梭子蟹和鰻魚的出口難度加大。2019年《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763-2019）規(guī)定食用油中氟樂靈為必檢農(nóng)藥殘留項目，規(guī)定最大殘留限量為50 μg/kg[21]，因此建立農(nóng)（水）產(chǎn)品中高通量快速檢測氟樂靈殘留的方法很有必要。

目前，對于大豆、花生、豆油、花生油中的氟樂靈殘留量的檢測，我國規(guī)定氣相色譜法作為標準檢測方法[16]。近幾年國內(nèi)外主要采用色譜法[22,23]、電化學方法[24-26]、熒光法[27,28]檢測氟樂靈殘留，雖然這些方法可靠準確，但耗時較長且專業(yè)人員要求較高，檢測成本較高，不適用高通量現(xiàn)場快速篩查，而酶聯(lián)免疫分析方法具有高通量、靈敏度較高、特異性較好、耗時較短、成本較低、操作簡單且適合基層廣泛推廣應用等優(yōu)點，是當前快速檢測的主要方法[29-31]，但現(xiàn)階段國內(nèi)缺乏快速檢測氟樂靈農(nóng)藥的酶聯(lián)免疫分析方法。2000年Heged?s等[32]制備了氟樂靈多克隆抗體，采用酶聯(lián)免疫分析方法對地表水樣和蔬菜汁進行氟樂靈殘留檢測；2008年Kr?mer等[33]采用酶聯(lián)免疫分析方法對水和土壤中的氟樂靈殘留進行了檢測。以上研究主要針對水樣、土壤、蔬菜汁等進行氟樂靈殘留檢測，而本研究開發(fā)了針對大豆、大豆油、對蝦等農(nóng)（水）產(chǎn)品中的氟樂靈殘留快速檢測方法，為滿足現(xiàn)階段國內(nèi)對氟樂靈檢測的需求和提高食品安全水平具有重要意義。

本研究設計并合成了一種新型的氟樂靈完全抗原，通過免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗體，并對包被原和抗體的稀釋倍數(shù)、包被溫度、抗體和標準品稀釋液等條件進行系統(tǒng)優(yōu)化，進而建立一種檢測農(nóng)（水）產(chǎn)品中氟樂靈農(nóng)藥殘留的間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法（indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay，ic-ELISA），該方法具有靈敏度高、特異性好的特點，為進一步開發(fā)氟樂靈殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒或試紙條提供理論依據(jù)，也為農(nóng)（水）產(chǎn)品安全提供更有效的保障，從而保障人類的身體健康。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新西蘭大白兔廣東省醫(yī)學實驗動物中心；氟樂靈、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、二環(huán)己基碳化二亞胺（DCC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FICA）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）廣州齊云生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG沈陽萬類生物科技有限公司；聚苯乙烯酶標板廈門怡佳美實驗器材有限公司；氟樂靈20種結(jié)構(gòu)類似物荷蘭specs生物特殊化合物服務有限公司；包被液、磷酸鹽緩沖液（PBS）、含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）、Tris-HCl緩沖液（Tris-HCl）實驗室配制；其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純。洗滌液：Na2HPO4·12H2O 16 g，NaCl 40 g，吐溫-20 3 mL，用蒸餾水定容到500 mL；封閉液：硼酸3.22 g，四硼酸鈉3.26 g，蔗糖30 g，酪蛋白2 g，魚皮明膠4 g，氨基比林1 g，Proclin 300 0.5 mL；終止液：10%硫酸溶液；TMB顯色液：過氧化脲0.03 g，α液45 mL，TMB 0.03 g，DMSO 1.8 mL，β液36 mL，甘油4 mL。

DK-8AD電熱恒溫水熱槽，，上海一恒科學儀器有限公司；XP.5002電子天平，上海越平科學儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；MX-F震蕩儀、PHSI-5實驗室PH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；RT-3100全自動洗板機，深圳雷杜生命科學股份有限公司；SP-Max2300光吸收型全波長酶標儀，上海閃譜生物科技有限公司；Agilent 7890B氣相色譜（配 ECD）、色譜柱（DB-1701，30 m×0.25 mm×0.25 μm），美國安捷倫科技有限公司；料理機（L22-Y86），九陽股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 氟樂靈半抗原的合成與鑒定

氟樂靈半抗原2C合成路線如圖1所示。將2-吡咯烷酮（1000 mg，11 mmol）溶于10 mL DMF，加入13.2 mmol氫化鈉（60%）和正溴丙烷（1758.9 mg，14.3 mmol），在氮氣保護下，70 ℃油浴攪拌過夜。反應液中加入70 mL乙酸乙酯和50 mL飽和氯化銨溶液，進行萃取后合并有機相，用10 g無水硫酸鈉干燥20 min。40 ℃旋干（0.09 MPa），獲得含酯基的仲胺中間體。將其加入13 mL 4 mol/L NaOH溶液于100 ℃油浴攪拌過夜進行水解得到水解產(chǎn)物后，將 3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯溶解于6 mL四氫呋喃，加入到水解產(chǎn)物中，室溫攪拌1 h。然后用30 mL水進行稀釋，加1 mol/L鹽酸調(diào)pH至2～3，沉淀物出現(xiàn)。再用乙酸乙酯萃取兩次，沉淀溶解。之后用10 mL飽和食鹽水對有機相分別進行洗滌，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，40 ℃旋干，用層析液于硅膠板進行分離，獲得產(chǎn)物半抗原2C。半抗原2C分離純化后，經(jīng)薄層層析初步鑒定，再通過高分辨質(zhì)譜（MS）和核磁共振氫譜（NMR）等手段進行精細結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.2 人工完全抗原的制備和鑒定

本研究采用碳二亞胺法偶聯(lián)合成人工完全抗原，在偶聯(lián)過程中碳二亞胺能使半抗原的羧基與蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生縮合，生成酰胺和酯。免疫原采用了BSA為載體蛋白，包被原則采用了 OVA作為載體蛋白，抗原經(jīng)過透析純化后采用紫外吸收光譜進行鑒定。

1.2.2.1 活化半抗原2C

稱取22 mg半抗原2C置于10 mL棕色玻璃瓶內(nèi)，加入1 mL無水DMF和磁子，置于磁力攪拌器上攪拌5 min，溶解完全為α液；稱取24.05 mg DCC于1 mL離心管內(nèi)，加入96 μL無水DMF，振動使其完全溶解為β液；稱取13 mg NHS于1 mL離心管內(nèi)，加入25 μL無水DMF，振動使其完全溶解為γ液。取α液加入β、γ液置于4 ℃下磁力攪拌過夜，后將其轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，19000 r/min離心10 min，取上清液于新離心管中，為δ液。

1.2.2.2 2C-BSA/OVA的偶聯(lián)

稱取20 mg BSA/OVA置于10 mL棕色玻璃瓶中，加入4 mL PBS緩沖液和磁子于磁力攪拌器上持續(xù)攪拌后，向BSA/OVA溶解液中緩慢滴入582.4 μL/512.2 μL的δ液，4 ℃磁力攪拌12 h，8000 r/min離心20 min，取上清液。將上清液透析3 d，每日透析3次，透析結(jié)束后保留最后一次透析液進行濃度調(diào)整；波長設置為200～800 nm，對2C、2C-BSA、2C-OVA、BSA、OVA進行紫外吸收光譜鑒定；鑒定完成后分裝標記好后存于-20 ℃，以備后續(xù)試驗。

1.2.3 動物免疫與多克隆抗體的制備

將2C-BSA與等量的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑等量乳化，初次免疫使用弗氏完全佐劑，加強免疫則使用弗氏不完全佐劑，采用乳化器進行乳化直至溶液變成白色乳濁液且滴到水面上30 s內(nèi)不擴散后進行免疫。選取兩只潔凈、體重為1.5～2.0 kg新西蘭大白兔進行背部皮下4～5點注射，每兩周加強注射一次。首次免疫劑量為2 mL/只，后面每次免疫1 mL/只，每次免疫間隔時間為2周。共進行5次加強免疫，最后一次加強免疫后第 7 d從兔子心臟取全血，孵育 30 min，10000 r/min離心10 min，收集上清液并分裝儲存于-20 ℃。

1.2.4 ic-ELISA基本步驟

包被：用PBS稀釋液液稀釋包被抗原，37 ℃包被13 h；封閉：洗滌液洗板2次，加入120 μL封閉液，37 ℃封閉3 h；烘干：甩干孔中液體，37 ℃烘干1 h；加樣：加入氟樂靈標準品和兔抗溶液50 μL/孔，37 ℃孵育一段時間；加酶標二抗溶液：洗板5次，加入稀釋到最佳倍數(shù)的酶標二抗溶液100 μL/孔，孵育一定時間；顯色：洗板5次，加入TMB顯色液100 μL/孔，37 ℃水浴鍋反應10 min；終止反應：加入終止液50 μL/孔，用酶標儀在450 nm下測定OD值。

1.2.5 ic-ELISA方法的優(yōu)化

采用棋盤滴定法確定包被抗原及抗體的最適工作濃度，用包被原稀釋液將 1 μg/mL包被原分別按1:2000、1:4000、1:6000、1:8000、1:10000、1:12000、1:14000、1:16000稀釋，用PBST溶液將2.26 μg/mL抗體按 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000稀釋，按照ic-ELISA基本步驟操作，確定最佳包被稀釋倍數(shù)及抗體稀釋倍數(shù)。

將包被原和抗體稀釋至最佳工作濃度后，選取37 ℃和4 ℃兩種溫度包被13 h，按照1.2.4ic-ELISA基本步驟操作，選擇Amax在0.8～1.5之間，Amax/IC50（IC50為半數(shù)抑制濃度）最大，IC50最小時的條件為ic-ELISA的最佳工作條件；最適包被溫度確定后，選擇Tris-HCl、PBS和PBST稀釋液稀釋抗體和標準品，按照ic-ELISA基本步驟操作，得到抗體稀釋液與標準品稀釋液不同組合條件下的標準曲線，綜合考慮Amax值、IC50值和Amax/IC50值，確定最佳抗體稀釋液與標準品稀釋液的組合；確定好以上最佳工作條件后，設置20、30、40、50和60 min五個競爭反應時間梯度，按照ic-ELISA基本步驟操作，選擇Amax在0.8～1.5之間，靈敏度高的反應時間作為最佳條件；基于以上優(yōu)化好的工作條件，最后對酶標二抗稀釋液進行優(yōu)化，選擇選擇Tris-HCl、PBS和PBST三種稀釋液稀釋酶標二抗，按照ic-ELISA基本步驟操作，綜合考慮Amax值、IC50值和Amax/IC50值，確定最優(yōu)的酶標二抗稀釋液。

1.2.6 標準曲線的繪制

在上述優(yōu)化條件下，梯度稀釋標準品溶液濃度（0.000256、0.00128、0.0064、0.032、0.16、0.8、4.0 μg/mL）進行ic-ELISA方法測定，得到不同濃度氟樂靈標準品所對應的OD值。以氟樂靈標準品濃度的對數(shù)為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，并確定其靈敏度（IC50）和線性范圍（IC20～IC80），從而評價所建立方法的靈敏度和線性范圍。

1.2.7 交叉反應測定

在最優(yōu)的工作條件下，本研究選取與氟樂靈結(jié)構(gòu)或功能類似的20種藥物FCRL、G-031和IPPL等進行抗特異性測定，通過各種藥物的標準曲線分別得到其IC50值。交叉反應率越高，特異性越差，交叉反應率（CR）計算公式如下：

式中：IC50（氟樂靈）為引起 50%抑制的金剛烷胺濃度（ng/mL），IC50（結(jié)構(gòu)類似物）為引起50%抑制的結(jié)構(gòu)類似物濃度（ng/mL）。

1.2.8 樣品前處理方法、添加回收實驗與儀器確證

1.2.8.1 樣品前處理

取鰻魚、對蝦、大豆油、大豆作為檢測樣品。樣品去皮去殼并攪碎，取2.5 g加入10 mL乙腈，震蕩15 min，6000 r/min離心3 min。取5 mL上清液到凈化管中，渦旋1 min后振搖15 min，6000 r/min離心3 min，取2 mL上清液于15 mL離心管中，45 ℃下水浴氮吹近干，加入1 mL正己烷定容，渦旋過膜裝瓶上機。將凈化后的溶液用氮吹儀氮吹完全，然后根據(jù)所需濃度加入一定量的甲醇和 PBS緩沖溶液超聲提取這些溶液30 min。

1.2.8.2 添加回收實驗

按照方法1.2.7.1處理樣品，在超聲提取的溶液中添加一定量的標準工作液，使之含量分別為0.08 μg/g、0.5 μg/g、0.1 μg/g 的加標樣品。用建立的ic-ELISA 方法進行測定，每個樣品重復3次并計算出回收率和變異系數(shù)（變異系數(shù)（CV）=標準差/平均數(shù)）。

1.2.8.3 儀器方法確證

采用氣相色譜法（GC-ECD）（NY/T 761-2008）進行儀器確證。GC-ECD分析條件：DB-1701色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度250 ℃，進樣方式為不分流進樣，進樣量 1 μL，載氣為氮氣（99.999%），恒定流量1.0 mL/min，程序升溫：初溫為60 ℃，保持0.5 min后，以10 ℃/min升至200 ℃，然后以30 ℃/min升至270 ℃，保持5 min。在鰻魚、對蝦、大豆、大豆油的空白樣品中添加一定量的標準工作液，使之含量分別為0.08、0.5、0.1 μg/g的加標樣品，按照方法1.2.7.1處理樣品，采用氣相色譜法測定樣品的抗體濃度，每個樣品設3個重復，計算回收率和精密度。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel、origin 8.5對數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的合成鑒定

半抗原的合成采用2-吡咯烷酮與正溴丙烷70 ℃下油浴攪拌過夜后獲得黃色油狀物，堿性水解過夜，加入3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯，反應1 h，獲得半抗原2C（結(jié)構(gòu)見圖1）。將制備的半抗原2C分離純化，采用薄層分析法進行初步鑒定（Rf=0.8）之后，通過高分辨質(zhì)譜（MS）和核磁共振氫譜（NMR）進行精細結(jié)構(gòu)鑒定。1H-NMR 圖譜中（圖 2（a）），δ為 8.00×10-6的s峰是苯環(huán)上的兩個氫；δ為3.07×10-6～2.98×10-6的m峰歸屬于與氮相連的亞甲基上的氫；δ為2.94×10-6～2.86×10-6的 m 峰歸屬于二級碳上的氫；δ為 2.34×10-6的 t峰歸屬于與羥基鄰位的亞甲基上的氫，耦合常數(shù)為7.2 Hz；δ為1.89×10-6～1.79×10-6的m峰歸屬于與羥基間位的亞甲基上的氫；δ為1.55×10-6的dd峰歸屬于與甲基鄰位的亞甲基上的氫，耦合常數(shù)為7.5 Hz；δ為0.81×10-6的t峰歸屬于甲基上的氫，耦合常數(shù)為7.4 Hz。電子轟擊質(zhì)譜（EI-MS）圖譜中（圖 2（b））出現(xiàn)了一組預期的同位素分子離子峰，其高度是 380.1（m/z，M+）。根據(jù)其核磁共振氫譜與質(zhì)譜數(shù)據(jù)，證明半抗原2C制備成功。

2.2 完全抗原的合成鑒定

完全抗原的合成采用碳二亞胺法，通過紫外分光光度計檢測，檢測數(shù)據(jù)通過Origin 8.5作圖，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，2C、BSA、OVA在419 nm、280 nm、279 nm處具有特征吸收峰，2C-BSA和2C-OVA分別在279 nm和276 nm處有特征吸收峰，2C-BSA和2C-OVA相對BSA和OVA的最大吸收峰位置均向左發(fā)生偏移，因此初步判定完全抗原偶聯(lián)成功，后期產(chǎn)生的抗體和建立的檢測方法也充分證明完全抗原偶聯(lián)成功。

2.3 ic-ELISA方法的優(yōu)化

本研究對包被原和抗體稀釋倍數(shù)、包被溫度、抗體和標準品稀釋液、競爭時間、酶標二抗稀釋液這些工作條件進行優(yōu)化，IC50值越低，靈敏度越高，綜合考慮Amax、IC50和Amax/IC50和曲線擬合度，從而得出最優(yōu)的條件參數(shù)。包被原和抗體稀釋倍數(shù)對ic-ELISA影響明顯，濃度的過高或過低都會影響抗原抗體的結(jié)合，從而降低方法靈敏度，影響 Amax和曲線穩(wěn)定性。包被原和抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化結(jié)果如圖4a所示，選擇OD值為1.0～1.5的4對稀釋倍數(shù)組合（包被原稀釋倍數(shù)/抗體稀釋倍數(shù)：24000/1000、10000/3000、9000/9000、6000/12000）進行分析比較，包被原及抗體稀釋倍數(shù)均為9000倍的Amax值最大、IC50值較小和 Amax/IC50值最大，綜合考慮選擇（9000，9000）這個組合作為包被原和抗體的最佳稀釋倍數(shù)。

ic-ELISA是一種基于抗原與抗體的生物化學反應，故在合適的溫度下，可提高抗原與抗體的結(jié)合反應率。本研究比較了 37 ℃和 4 ℃兩種包被條件的Amax、Amax/IC50和 IC50，由圖 4b可知，Amax和Amax/IC50均相差不大，但37 ℃的IC50要比4 ℃的小，因此選其作為最佳包被溫度。

對抗體和標準品稀釋液進行優(yōu)化可以降低空白值，提高方法準確性。本研究將PBST、PBS、Tris-HCl三種稀釋液兩兩組合為9種搭配，如圖4（c1-c3）所示，抗體/標準品稀釋液是 Tris-HCl/PBS溶液的組合IC50較低，Amax、Amax/IC50較高，因此選其作為抗體和藥物的最優(yōu)稀釋液組合。

對抗原抗體反應時間進行優(yōu)化，可以提高方法的靈敏度及重復性，是實驗中的關鍵環(huán)節(jié)。本研究選取20、30、40、50和60 min五種競爭反應時間進行分析，結(jié)果如圖4d所示。由圖可知，在40 min時的IC50較小，Amax、Amax/IC50較大，因此選擇40 min作為抗原抗體的競爭時間。

在上述優(yōu)化的條件下，本研究對酶標二抗稀釋液進行優(yōu)化，可提高方法的穩(wěn)定性和靈敏度。本實驗分析了三種不同稀釋液（PBS，PBST和Tris-HCl）對實驗結(jié)果的影響，由圖4e可得，酶標二抗稀釋液為PBST溶液時的IC50值最低，Amax較高，Amax/IC50最高，因此選其作為最佳的酶標二抗稀釋液。

2.4 ic-ELISA標準曲線的建立

根據(jù)上述ic-ELISA條件優(yōu)化結(jié)果，得到PcAb-2C的包被原與抗體最佳稀釋倍數(shù)均為9000倍，包被溫度為37 ℃，最佳競爭反應時間為40 min，抗體稀釋液為Tris-HCl，標準品稀釋液為PBS，酶標二抗稀釋液為 PBST。在此最佳反應條件下繪制標準曲線，結(jié)果如圖5所示，得到PcAb-2C的靈敏度良好（IC50為54.07 ng/mL，最低檢測限為7.22 ng/mL），相關系數(shù)為0.99，曲線擬合度好，線性范圍為12.56～282.62 ng/mL，線性范圍廣。與 Heged?s等[32]測得的靈敏度相比略低（IC50為1.89～15.04 ng/mL），但也處于良好范圍內(nèi)。

2.5 特異性鑒定

表1 氟樂靈與20種結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應數(shù)據(jù)Table 1 Cross-reaction data of trifluralin with 20 structural analogues

續(xù)表1

表2 ic-ELISA和GC-ECD測定的回收率和變異系數(shù)Table 2 Recovery rate and coefficient of variation determined by ic-ELISA and GC-ECD

用所建立方法進行檢測，測定IC50值并計算交叉反應率，考察所制備抗體對氟樂靈結(jié)構(gòu)類似藥物的識別能力，交叉反應率越低，特異性越好。在20種與氟樂靈結(jié)構(gòu)或者功能相似的類似藥物檢測過程中（見表1），發(fā)現(xiàn)本研究所建立的檢測方法僅與FCRL和G-031有較高的交叉反應率（15%以上），與其它18種類似物均在10%以下，甚至一半沒有產(chǎn)生交叉反應，說明所建立方法特異性高。與Heged?s等[32]建立的酶聯(lián)免疫分析方法相比，本研究選取的結(jié)構(gòu)類似藥物范圍更廣（Heged?s等選取藥物17種），IPPL和PDTL的交叉反應率更低，特異性更好。選取3個具有較高交叉反應率的分子（氟樂靈、FCRL和G-031）進行分析，發(fā)現(xiàn)FCRL僅在N-丙基末端連接了-Cl（基團體積和電負性增大）和G-031僅將三氟甲基換成-COOH（基團體積增大但電負性降低），造成交叉反應率降低，由此推測 N-丙基和三氟甲基這兩個部位的基團體積和電負性改變很可能會影響抗原抗體的識別。

2.6 添加回收實驗與方法確證結(jié)果

本文以所建立的方法（ic-ELISA）為檢測手段，對鰻魚、對蝦、大豆、大豆油進行添加回收實驗，結(jié)果如表 2所示。由表可知，ic-ELISA方法測得的PcAb-2C的平均回收率為89.8%～106.4%，GC-ECD方法測得的平均回收率為89.0%～108.2%，兩種方法的變異系數(shù)均小于10%。對ic-ELISA方法和GC-ECD方法的測定結(jié)果進行線性回歸分析R2=0.99，相關性好，說明本研究建立的 ic-ELISA方法準確度能達到檢測要求，適用于實際樣品中氟樂靈的高通量免疫快速檢測。Heged?s等[32]運用所建立的酶聯(lián)免疫分析方法對胡蘿卜汁、南瓜汁和西紅柿汁進行檢測，添加回收率約為50%～333.3%，與之相比本研究準確度更高。

3 結(jié)論

本研究利用 3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯與仲胺側(cè)鏈氨基發(fā)生反應制備氟樂靈半抗原，通過碳二亞胺法偶聯(lián)合成完全抗原并免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗體PcAb-2C。基于上述研究，通過優(yōu)化包被原和抗體的稀釋倍數(shù)、包被溫度、抗體和標準品稀釋液等7個因素，建立了氟樂靈間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法。結(jié)果表明該方法的靈敏度良好（IC50為54.07 ng/mL，最低檢測限為7.22 ng/mL），曲線擬合度好（相關系數(shù)為0.99），線性范圍廣（IC20～IC80為 12.56～282.62 ng/mL），特異性高（20種氟樂靈結(jié)構(gòu)類似物中只有2種藥物的交叉反應率大于 15%）。利用本研究所建立方法對大豆、大豆油、對蝦和鰻魚進行實際樣品檢測，添加回收率為89.8%～106.4%，采用氣相色譜法（GC-ECD）進行驗證，添加回收率為 89%～108.2%，兩種方法的變異系數(shù)均小于 10%，兩種方法的一致性較高（R2=0.99）。以上數(shù)據(jù)表明本研究所建立方法具有靈敏度好、特異性好、準確度高等優(yōu)點，達到了國家標準檢測要求[24]（食用油中氟樂靈最大殘留限量為 50 μg/kg），適用于農(nóng)（水）產(chǎn)品中氟樂靈農(nóng)藥殘留的高通量快速檢測，為氟樂靈試劑盒或試紙條的開發(fā)提供了理論依據(jù)。