超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測定陽荷花苞中的化學(xué)成分

羅夢蘭，任廷遠(yuǎn)，殷明月，董令，鄭啟健，謝姣*

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州貴陽 550025）

（2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽 550025）

陽荷（Zingiber miogaRoscoe），又名野姜、山姜、猴姜等，屬姜科姜屬多年生草本植物，是一種藥食同源的膳食纖維蔬菜[1,2]。其中，陽荷食用部位花苞，是由陽荷地下根莖發(fā)育而長出地面，主要呈紫紅色松果狀[3]。近年來，隨著國民經(jīng)濟(jì)的增長以及人們對(duì)營養(yǎng)健康的認(rèn)識(shí)逐漸加深，成熟陽荷花苞不僅因其鮮艷的色澤及獨(dú)特的辛香氣味，還因這種抗逆性強(qiáng)、適用性廣且基本無病蟲害并含多種營養(yǎng)物質(zhì)如糖類、有機(jī)酸、氨基酸、脂類等代謝產(chǎn)物逐漸受到人們的關(guān)注[4-9]。

近年來，有關(guān)陽荷的研究主要以野生型為主，對(duì)陽荷花苞中化學(xué)成分的研究已見蛋白質(zhì)、氨基酸、粗脂肪、粗纖維、總糖、可滴定酸、黃酮化合物、多糖類、紅色素、皂苷類、生物堿、維生素C等營養(yǎng)成分的報(bào)道[4-14]；另外，galanal A、galanal B、miogadial已證實(shí)為陽荷特征成分[1,3,7]。陽荷花苞主要以鮮食為主[10]，而探索影響其鮮食風(fēng)味品質(zhì)的相關(guān)研究將為正確理解其鮮食風(fēng)味形成提供重要的理論依據(jù)，目前影響陽荷花苞鮮食風(fēng)味品質(zhì)的相關(guān)研究未見報(bào)道。據(jù)報(bào)道糖類和有機(jī)酸是影響陽荷鮮食口感的2種最重要的指標(biāo)，糖類可作為合成其他物質(zhì)過程的重要單體[11,12]，是合成氨基酸、有機(jī)酸、脂類等營養(yǎng)成分的基礎(chǔ)[13]。然而近年來對(duì)陽荷中糖類的研究主要集中在部分糖類如蔗糖、果糖、葡萄糖的定性與定量上[4,14,15]，并未對(duì)陽荷中存在的其他糖類進(jìn)行鑒定和分析。另外，近年來對(duì)陽荷中有機(jī)酸的研究主要關(guān)注在部分氨基酸如亮氨酸、異亮氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸等的鑒定上[5,14]，并未涉及其他有機(jī)酸種類。研究Li等[16]繪制的整體代謝網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)，三羧酸循環(huán)是部分氨基酸如谷氨酸、精氨酸和丙氨酸合成的上游物質(zhì)。此外，三羧酸循環(huán)作為重要的循環(huán)過程，可連接糖酵解、氨基酸及脂肪酸生物合成途徑[17,18]。因此，研究影響陽荷鮮食風(fēng)味的有機(jī)酸種類不僅僅局限于氨基酸，還應(yīng)包括三羧酸循環(huán)在內(nèi)的其他有機(jī)酸。此外，據(jù)報(bào)道氨基酸對(duì)風(fēng)味品質(zhì)的形成具有重要影響[16]，且氨基酸的代謝溝通脂肪酸的生物合成。而脂肪酸是構(gòu)成脂類的重要成分，由飽和脂肪酸和不飽和脂肪組成。目前，對(duì)陽荷中脂類的研究僅有粗脂肪的分析[15]，而對(duì)陽荷中脂肪酸種類的定性及定量研究還未見相關(guān)報(bào)道。

因此，本研究以陽荷花苞為研究對(duì)象，通過代謝產(chǎn)物常用檢測方法UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS（超高效液相色譜-電噴霧離子源-三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜，簡稱超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法）[19]，系統(tǒng)分析陽荷中化學(xué)成分糖類、有機(jī)酸、氨基酸和脂肪酸的種類和相對(duì)含量。而目前作為藥食兩用的蔬菜風(fēng)味品質(zhì)研究僅有植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)生姜氨基酸的變化研究[20]，故研究陽荷鮮食風(fēng)味品質(zhì)形成相關(guān)化合物即糖類、有機(jī)酸、氨基酸和脂肪酸種類和含量，不僅將為研究其他藥食兩用蔬菜的鮮食風(fēng)味品質(zhì)形成提供思路，同時(shí)也為陽荷作為鮮切蔬菜的質(zhì)量控制、開發(fā)與利用提供相應(yīng)化學(xué)成分層面基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)樣品為花期50 d左右的陽荷花苞，采自貴州省黔東南苗族侗族自治州從江縣，挑選無機(jī)械損傷、無病蟲害、大小均勻一致的健康花苞，于室溫下洗凈，晾干后立即液氮冷凍后，存于-80 ℃冰箱備用。

甲醇，色譜純，德國默克公司；乙腈，色譜純，德國默克公司；表2中化合物對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品，色譜純，BioBioPha/WAKO/Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-100F凍干機(jī)新芝生物有限公司；MM400，Retsch研磨儀德國萊馳公司；UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS（UPLC，SHIMADZU Nexera X2，日本島津公司；MS/MS，Applied Biosystems 4500 QTRAP，美國Applied Biosystems公司）。

1.3 方法

1.3.1 UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS樣品制備

樣品制備參考Chen等[21]方法并加以修改，經(jīng)凍干機(jī)真空冷凍干燥后的樣品于研磨儀（30 Hz，1.5 min）作用下研磨至粉末狀；稱取以上粉末狀樣品100 mg，溶于1.2 mL 70%甲醇提取液中，每30 min渦旋30 s，共6次，其后樣品置于4 ℃冰箱放置12 h；其后樣品于12000 r/min離心10 min后，用0.22 μm微孔濾膜過濾上清液，并保存于進(jìn)樣瓶中，供 UPLC-MS/MS分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS條件

使用UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS系統(tǒng)分析1.2.1所制備的樣品。分析條件如下：

1.3.2.1 UPLC條件

色譜柱為安捷倫SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速0.35 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為4 μL，其中流動(dòng)相A相，超純水（添0.1%甲酸）；流動(dòng)相B相，乙腈（添0.1%甲酸），樣品測量采用梯度洗脫。

表1 陽荷中化學(xué)成分的流動(dòng)相梯度Table 1 Flow phase gradient for chemical component in Zingiber mioga Roscoe

1.3.2.2 ESI-Q TRAP-MS/MS條件

AB4500QTRAP UPLC/MS/MS系統(tǒng)配置有LIT和三重四極（QQQ）掃描，該系統(tǒng)配備了ESI渦輪離子噴霧接口，由Analyst 1.6.3軟件（ABSciex）控制運(yùn)行正負(fù)2種離子模式，其中ESI源運(yùn)行參數(shù)為：電噴霧離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓（IS）5500 V（正離子模式）/-4500 V（負(fù)離子模式）；離子源氣體I（GSI），氣體II（GSII）和簾氣（CUR）分別設(shè)置為50、60和25.0 psi；碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在QQQ和LIT模式下，分別用10和100 μmol/L聚丙二醇溶液進(jìn)行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)。QQQ掃描使用MRM（多反應(yīng)檢測模式）模式，碰撞氣體（氮?dú)猓┰O(shè)置為中等。優(yōu)化DP（射入電壓）和CE（碰撞電壓），完成各個(gè)MRM離子對(duì)的DP和CE參數(shù)確定。通過每個(gè)時(shí)期洗脫的代謝物，檢測每個(gè)時(shí)期其中一組特定的MRM離子對(duì)。

1.3.3 陽荷花苞化學(xué)成分的定性

根據(jù)二級(jí)譜信息以及化學(xué)成分標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行物質(zhì)定性，分析時(shí)去除同位素信號(hào)，含K+離子、Na+離子、NH4+離子的重復(fù)信號(hào)以及本身是其他更大分子量物質(zhì)的碎片離子的重復(fù)信號(hào)。陽荷花苞中化學(xué)成分是利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的MRM分析完成，MRM模式中，四級(jí)桿首先篩選目標(biāo)物質(zhì)的母離子，排除其他分子量物質(zhì)對(duì)應(yīng)的離子以初步排除干擾，其后母離子經(jīng)碰撞室誘導(dǎo)電離后斷裂形成碎片離子，再通過三重四級(jí)桿過濾選出所需的一個(gè)特征碎片離子，排除非目標(biāo)離子干擾。利用軟件Analyst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采用峰面積歸一化法測定各化學(xué)成分的相對(duì)百分含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

使用Graphpad Prism 7.0和Photoshop軟件繪圖，使用Graphpad Prism 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽荷花苞中化學(xué)成分的鑒定

陽荷花苞化學(xué)成分用UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS分析，根據(jù)質(zhì)譜圖參數(shù)同數(shù)據(jù)庫母離子分子量、特征碎片離子、DP、CE以及標(biāo)準(zhǔn)品核對(duì)進(jìn)行化學(xué)成分的鑒定；其中樣品總離子流圖（Total ions current，TIC）及MRM代謝物檢測多峰圖，如圖1所示。表2～表5結(jié)果顯示，試驗(yàn)共鑒定了105個(gè)化學(xué)成分，其中包括了16個(gè)糖類、39個(gè)有機(jī)酸、25個(gè)氨基酸和25個(gè)脂肪酸。

2.2 陽荷花苞中糖類組分及相對(duì)含量分析

如表2所示，對(duì)陽荷花苞化學(xué)成分中糖類組分進(jìn)行鑒定分析，共發(fā)現(xiàn)16個(gè)糖類包括單糖、雙糖及其他糖類等。利用面積歸一法對(duì)這16個(gè)組分進(jìn)行相對(duì)定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)含量較高的糖類為單糖類如 D-葡萄糖、D-果糖等，其相對(duì)含量占鑒定的 16個(gè)糖類的 79.73%，而其相對(duì)含量依次為含 2.97%的 D-葡萄糖、2.95%的D-果糖等；其次為其他糖類如葡萄糖-1-磷酸、D-葡萄糖-6磷酸、D-景天庚酮糖7-磷酸等，雙糖類如D-蔗糖、麥芽糖、乳二糖等。以上鑒定到的陽荷單糖即D-葡萄糖、D-果糖以及雙糖如蔗糖同梁帥等[4]研究中提取的陽荷多糖組分結(jié)果一致，但梁帥等[4]提取的多糖中含量最高的是蔗糖，這和結(jié)果中鑒定到的糖類含量最高的D-葡萄糖結(jié)果不一致，這可能是產(chǎn)地等差異引起含糖量高低順序不一致的原因。

表2 UPLC-ESI-MS/MS鑒定的陽荷花苞糖類分析結(jié)果Table 2 Identification of the sugar components in bud of Zingiber mioga Roscoe by UPLC-ESI-MS/MS

表3 UPLC-ESI-MS/MS鑒定陽荷花苞有機(jī)酸分析結(jié)果Table 3 Identification of the organic acids in bud of Zingiber mioga Roscoe by UPLC-ESI-MS/MS

表4 UPLC-ESI-MS/MS鑒定陽荷花苞氨基酸分析結(jié)果Table 4 Identification of the amino acids in bud of Zingiber mioga Roscoe by UPLC-ESI-MS/MS

2.3 陽荷花苞中有機(jī)酸組分及相對(duì)含量分析

如表3所示，對(duì)陽荷花苞中化學(xué)成分有機(jī)酸組分進(jìn)行鑒定分析，共發(fā)現(xiàn)39個(gè)有機(jī)酸，包括三羧酸循環(huán)所涉及的有機(jī)酸及其衍生物等。利用面積歸一法對(duì)這39個(gè)組分進(jìn)行相對(duì)定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)含量較高為三羧酸循環(huán)過程所涉及的有機(jī)酸，如含 8.15%異琥珀酸、7.82%琥珀酸、7.80% L-蘋果酸、3.08%異檸檬酸、1.54%檸檬酸等，其相對(duì)含量占鑒定的39個(gè)有機(jī)酸的75.86%，其次為其他有機(jī)酸如壬二酸、奎寧酸、D-木糖酸、焦酒石酸、戊二酸等。其中，以上結(jié)果中陽荷的鑒定中含有機(jī)酸類物質(zhì)，同樣地朱仁威等[15]研究發(fā)現(xiàn)銅仁陽荷中可滴定酸含量達(dá)0.26%，表示其含有機(jī)酸類（包括檸檬酸），說明陽荷花苞中含有機(jī)酸物質(zhì)與朱仁威等[15]研究結(jié)果一致。

2.4 陽荷花苞中氨基酸組分及相對(duì)含量分析

如表4所示，對(duì)陽荷中化學(xué)成分氨基酸進(jìn)行鑒定分析，共發(fā)現(xiàn)25個(gè)氨基酸，包括9個(gè)必需氨基酸（即必需氨基酸指的是人體自身不能合成或合成速度不能滿足人體需要，必須從食物中攝取的氨基酸，主要包括8種必需氨基酸加1種嬰兒必需氨基酸即組氨酸）和16個(gè)非必需氨基酸等，其中本研究中陽荷花苞的必需氨基酸種類較朱仁威等[15]研究銅仁陽荷結(jié)果中必需氨基酸多1種即色氨酸。利用面積歸一法對(duì)25個(gè)氨基酸進(jìn)行相對(duì)定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其含量較高的為必需氨基酸，如L-賴氨酸、L-色氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-蘇氨酸，其相對(duì)含量占以上定性氨基酸的53.56%，其次為其他非必需氨基酸如L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-正亮氨酸、L-天冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸等。以上結(jié)果中陽荷花苞鑒定到氨基酸種類（25個(gè)）較其他研究多（≤18個(gè)），如朱仁威等[15]研究銅仁陽荷花苞氨基酸種類為17種，張成程等[5]研究來鳳縣陽荷氨基酸種類為18種；此外，本試驗(yàn)含量最高的為必需氨基酸，這同張成程等[5]研究陽荷中非必需氨基酸含量高于必需氨基酸的結(jié)果不一致，這可能是樣品產(chǎn)地不同所致，同時(shí)非必需氨基酸中含量最高的是精氨酸，這與張成程等[5]研究結(jié)果一致。與藥食兩用蔬菜生姜相比[20,22,23]，陽荷花苞中L-谷氨酰胺、高精氨酸、環(huán)亮氨酸、L-酵母氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-瓜氨酸、L-高胱氨酸、L-高瓜氨酸、L-別異亮氨酸、L-正亮氨酸、L-色氨酸為其特有氨基酸，其中L-色氨酸為必需氨基酸，L-瓜氨酸是一種具有極其重要的生理功能的非蛋白質(zhì)氨基酸[24]。

2.5 陽荷花苞中脂肪酸組分及相對(duì)含量分析

如表5所示，對(duì)陽荷中化學(xué)成分脂肪酸組分進(jìn)行鑒定分析，共發(fā)現(xiàn)25個(gè)脂肪酸，包括3個(gè)飽和脂肪酸和22個(gè)非飽和脂肪酸。利用面積歸一法對(duì)這25個(gè)組分進(jìn)行相對(duì)定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)含量較高的為非飽和脂肪酸（包括必需脂肪酸即亞油酸和α-亞麻酸），如γ-亞麻酸、9,10,13-三羥基-11-十八碳烯酸、亞油酸、反油酸、α-亞麻酸等，其相對(duì)含量占定性脂肪酸的70.00%，其次為3個(gè)飽和脂肪酸如硬脂酸、肉豆蔻酸和十一烷酸，其中本研究鑒定的亞油酸、γ-亞麻酸和α-亞麻酸和與嚴(yán)小紅等[25]研究結(jié)果中亞油酸和亞麻酸是姜科屬常見成分的結(jié)論一致。

表5 UPLC-ESI-MS/MS鑒定陽荷花苞脂肪酸分析結(jié)果Table 5 Identification of the fatty acids in bud of Zingiber mioga Roscoe by UPLC-ESI-MS/MS

3 結(jié)論

本研究利用 UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS分析陽荷化學(xué)成分，結(jié)果顯示陽荷花苞中共鑒定了包括糖類、有機(jī)酸、氨基酸和脂肪酸在內(nèi)的4類共105個(gè)化學(xué)成分。其中，糖類組分共鑒定了16個(gè)，利用面積歸一法對(duì)其進(jìn)行相對(duì)定量，含量最高的為單糖類，依次為D-葡萄糖、D-果糖、D-阿拉伯糖等，其次為其他糖類和雙糖類；共鑒定了39個(gè)有機(jī)酸組分，而三羧酸循環(huán)過程所涉及的有機(jī)酸如異琥珀酸、琥珀酸、L-蘋果酸、異檸檬酸、檸檬酸等相對(duì)含量最高，其次為其他有機(jī)酸如壬二酸、奎寧酸、D-木糖酸等；共發(fā)現(xiàn) 25個(gè)氨基酸，其中9個(gè)必需氨基酸（含組氨酸）相對(duì)含量較16個(gè)非必需氨基酸高；共鑒定了25個(gè)脂肪酸，其中22個(gè)脂肪酸為非飽和脂肪酸（包含必需脂肪酸亞油酸和α-亞麻酸），其相對(duì)含量高于飽和脂肪酸。綜上，與藥食兩用蔬菜生姜相比，陽荷花苞中特有氨基酸為L-谷氨酰胺、高精氨酸、環(huán)亮氨酸、L-瓜氨酸、L-色氨酸等12種，其中包括了必需氨基酸L-色氨酸及活性氨基酸L-瓜氨酸。本研究首次系統(tǒng)揭示了陽荷中化學(xué)成分糖類、有機(jī)酸、氨基酸和脂肪酸組成，其中包含了人體所需的9種必需氨基酸和2種必需脂肪酸，這為人們正確認(rèn)識(shí)陽荷的營養(yǎng)價(jià)值提供參考，并為陽荷鮮食風(fēng)味形成理論奠定基礎(chǔ)。